Monitoraggio dell'assemblaggio eIF4F misurando l'interazione eIF4E-eIF4G nelle cellule vive

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per misurare l'interazione eIF4E-eIF4G nelle cellule vive che consentirebbe all'utente di valutare la perturbazione indotta da farmaci delle dinamiche complesse eIF4F nei formati di screening.

Abstract

La formazione del complesso eIF4F ha dimostrato di essere il nodo chiave a valle per la convergenza delle vie di segnalazione che spesso subiscono l'attivazione oncogenica nell'uomo. eIF4F è un complesso di legame cap coinvolto nella fase di reclutamento mRNA-ribosoma dell'iniziazione alla traduzione. In molti modelli cellulari e precli clinici di tumori, la deregolamentazione dell'eIF4F porta a una maggiore traduzione di specifici sottoinsiemi di mRNA coinvolti nella proliferazione e nella sopravvivenza del cancro. eIF4F è un complesso etero-trimerico costruito dalla subunità eIF4E legante il tappo, dall'elisocca eIF4A e dalla subunità di impalcature eIF4G. Fondamentale per l'assemblaggio di complessi attivi eIF4F è l'interazione proteina-proteina tra proteine eIF4E ed eIF4G. In questo articolo viene descritto un protocollo per misurare l'assembly eIF4F che monitora lo stato dell'interazione eIF4E-eIF4G nelle celle vive. Il saggio di interazione proteina-proteina a base cellulare eIF4e:4G consente inoltre di valutare in modo accurato e affidabile i cambiamenti indotti dai farmaci nell'integrità complessa di eIF4F. Immaginiamo che questo metodo possa essere applicato per verificare l'attività dei composti disponibili in commercio o per un ulteriore screening di nuovi composti o modalità che interrompono in modo efficiente la formazione del complesso eIF4F.

Introduzione

Il controllo dell'espressione genica gioca un ruolo fondamentale nella corretta esecuzione di programmi cellulari come la proliferazione e la differenziazione della crescita. Un meccanismo di controllo normativo può essere esercitato sia a livello di trascrizione genica che a livello di traduzione dell'mRNA. Nell'ultimo decennio, è diventato sempre più evidente che il controllo traslazionale per modulazione del processo di iniziazione piuttosto che le fasi successive di allungamento e terminazione possono regolare finemente la sintesi di sottoinsiemi specifici di proteine che svolgono una vasta gamma di funzioni biologiche.

Una maggiore traduzione degli mRNA coinvolti nella sopravvivenza, nelle risposte anti-autofagiche e anti-apoptotiche è stata implicata in diversi tumori e sono state anche causalmente collegate all'attivazione aberrante o all'espressione sovraesperienza dei fattori di iniziazione^{alla traduzione 1}.

Il complesso eIF4F è un regolatore principale dell'avvio della traduzione. Legando la struttura del limite alla fine dei 5' mRNA, eIF4F sta guidando il reclutamento iniziale di mRNA-ribosoma e, a sua volta, aumentando l'efficienza di traduzione dell'mRNA degli mRNA eucarioti^{debolmente tradotti 2}. La traduzione mediata da eIF4F di mRNA correlati al cancro è stata segnalata per molti modelli di cancro che ospitano l'attivazione aberrante delle vie RAS/MAPK o AKT/TOR, suggerendo che le cellule tumorali upregolano eIF4F per aumentare la propria attività pro-neoplastica. L'interruzione di questo ciclo feed-forward inibendo la formazione complessa eIF4F è quindi una strategia terapeutica^{molto promettente 3,4}.

Il complesso eIF4F è costituito da (i) eIF4E, la subunità di legame con il tappo di eIF4F che interagisce con la struttura del cappuccio trovata al 5' UTR di mRNA, (ii) eIF4A, l'RNA elicase e (iii) eIF4G, la proteina dell'impalcatura che interagisce sia con eIF4A che con eIF4E e che alla fine recluta la subunità ribosomiale 40S⁵. L'associazione eIF4G con eIF4E è il passo limitante della velocità per l'assemblaggio di complessi eIF4F funzionali ed è regolata negativamente dalle proteine leganti eIF4E (4EMP, membri 1, 2 e 3))⁶. Competendo con l'associazione eIF4G a eIF4E attraverso un'interfaccia costituita da sequenze di associazione eIF4E canoniche e non canoniche^7,8,9 (regione compresa tra aa 604-646 sull'eIF4E umano), 4EBP riduce il pool di eIF4E attivamente coinvolti nella traduzione e impedisce la formazione complessa eIF4F. L'interazione di queste interazioni proteina-proteina è regolata principalmente dal bersaglio dei mammiferi della fosforilazione mediata dalla rapamicina (mTOR) di 4EBP. Su stimoli mitogenici, mTOR fosforilati direttamente i membri della famiglia proteica 4E-BP, diminuendo la loro associazione con eIF4E e, quindi, promuovendo l'interazione eif4E-eIF4G e la formazione di complessi funzionali eIF4F¹⁰.

Nonostante il grande sforzo nello sviluppo di composti mirati all'integrità complessa di eIF4F, la mancanza di saggi che misurano l'interruzione diretta dell'interazione eIF4E-eIF4G nelle cellule vive ha limitato la ricerca di composti colpiti attivi cellulari. Abbiamo applicato un saggio di luciferasi basato su un analogo coelenterazina (ad esempio, test di complementazione basato su Nanoluc) per monitorare in tempo reale lo stato dell'integrità eIF4F attraverso l'interazione eIF4E-eIF4G. Il sistema proteico di complementazione della luciferasi è costituito da un frammento proteico da 18 kDa (SubA) e 11 frammenti di peptide amminoacido (SubB) ottimizzati per un'auto-associazione minima^{e stabilità 11}. Una volta espresse come prodotto di fusione con l'eIF4E a figura intera umana e il dominio di interazione eIF4E di eiF4G1 umano (aa 604-646), le due proteine interagenti porteranno il frammento SubA e SubB in prossimità l'una dell'altra e indurranno la formazione della luciferasi attiva che, in presenza di un substrato permeabile cellulare, alla fine genererà un segnale luminoso luminescente (Figura 1). Abbiamo segnalato altrove la costruzione e la convalida del sistema di complemento eIF4E:eIF4G^{604-646 16}.

Qui descriviamo come il sistema di complementazione eIF4E:eIF4G^604-646 (disponibile su richiesta) può essere applicato per misurare con precisione l'interruzione eIF4E-eIF4G mediata da 4EBP1 nelle cellule vive. Inoltre, dimostriamo la sua utilità misurando gli effetti di diversi inibitori mTOR che sono attualmente in fase di sperimentazione clinica come potenziali farmaci terapeutici contro il^{cancro 12}. Poiché gli effetti off-target spesso mascherano l'attività specifica del farmaco, descriviamo anche come la versatilità della misurazione del sistema eIF4E:eIF4G^604-646 può essere estesa con misurazioni ortogonali della vitalità cellulare per tenerne conto.

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Protocollo

La linea cellulare HEK293 è stata utilizzata per il protocollo ed è stata coltivata nel Medium Aquila Modificata di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale, 2 mM L-glutammina e 100 U/mL penicillina/streptomicina. Le cellule sono state coltivate a 37 °C con il 5% di CO₂ in un ambiente umidificato.

1. Valutazione quantitativa dell'interruzione complessa del FEI4F tramite il saggio di completamento eIF4E:eIF4G^604-646

1. Coltura cellulare e transitoria transitoria del saggio di completamento eIF4E:eIF4G^604-646
   1. Utilizzare cellule appena scongelate con meno di 20 passaggi per tutti gli esperimenti. Il primo giorno, determinare il numero di cella utilizzando un contatore di celle standard e contare le celle vitali totali utilizzando il metodo di esclusione blu Trypan¹³.
   2. Piastre seme 6-po 'con 0,9 - 1,2 x 10⁶ di cellule HEK 293 per pozzo in 2 mL di mezzo di crescita standard.
      NOTA: Al fine di ottenere la migliore efficienza di trasfezione all'interno delle linee cellulari sopra indicate, assicurarsi che le cellule placcate siano confluenti al 70-90% il giorno dopo la semina.
   3. La mattina del secondo giorno, co-trasfezionare le cellule con subA-eIF4E ed eIF4G^604-646-SubB plasmide utilizzando un reagente di trasfezione a base lipidica (vedi Tabella dei materiali)come descritto di seguito.
      1. Diluire 9 μL di soluzione a base di liposoma in un tubo contenente 125 μL di mezzo siero ridotto senza rosso fenolo (vedi Tabella dei materiali)per ogni trasfezione e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
      2. Preparare la miscela master di DNA diluire 3 μg di ogni plasmide in 125 μL di mezzo siero ridotto per ogni tubo di trasfezione.
      3. Aggiungere 12 μL di reagenti enhancer al tubo mix master dna, mescolare bene e aggiungere immediatamente il DNA: enhancer master mix ad ogni tubo di liposomi diluiti in un rapporto 1:1. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
      4. Aggiungere il complesso DNA-lipidico ad ogni pozzo e incubare le cellule in un incubatore di 37 °C con 5% di CO₂ per 24 ore.
   4. La mattina del giorno 3, sciacquare ogni bene con 1 mL di PBS.
   5. Rimuovere il PBS e incubare le cellule in ogni pozzo con 0,3 mL di tripside per 5 minuti a 37 °C.
   6. Neutralizzare la tripparina aggiungendo 2 ml del mezzo siero ridotto senza rosso fenolo contenente lo 0% di FCS in ogni pozzo e trasferire le cellule trasfette in un tubo da 15 ml.
      NOTA: Il rosso fenolo può interferire con l'attività della luciferasi; pertanto, le cellule devono essere maneggiate da questo passo in poi in mezzo senza rosso fenolo.
   7. Spin down celle per 5 min a 290 x g e aspirare il mezzo. Rimossare le cellule in 2 mL del mezzo siero ridotto senza rosso fenolo contenente lo 0% di FCS. Contare come descritto nel passaggio 1.1.
   8. I semi hanno trasfetto cellule HEK 293 in 96 piastre ben opache ad una densità di 30.000 cellule per pozzo in 90 μL di mezzo senza rosso fenolo contenente lo 0% di FCS. Al fine di ottenere 3 repliche tecniche all'interno dello stesso esperimento per 3 composti diversi, seme 60 pozzi delle piastre con cellule escluse i pozzi sui bordi.
   9. Subito dopo la semina delle cellule trasfette, aggiungere 10 μL di soluzione composta DMSO al 10% (vedere fase 1.2).
2. Preparazione composta
   1. Preparare soluzioni di stock composto da 1 mM sciogliendo il composto di interesse in DMSO al 100% (v/v). Per avere 3 repliche per ogni titolazione composta, utilizzare 8 μL della soluzione di stock composto da 1 mM.
      NOTA: Il volume di 1 mM di composto stock utilizzato è superiore a quello necessario. Questo viene fatto per tenere conto degli eventuali errori di pipettazione.
   2. Eseguire una diluizione seriale di 2 volte della soluzione di composto stock con 4 μL del materiale da 1 mM in 4 μL di DMSO al 100% per ogni punto di titolazione.
      NOTA: Per una titolazione composta completa, eseguire 9 diluizioni seriali dal materiale iniziale in DMSO al 100%. Se è necessario testare più composti, utilizzare una piastra di pozzo 96 e una pipetta multicanale per facilitare questo passaggio e le successive diluizioni.
   3. Aggiungere 36 μL di acqua sterile di grado HPLC per ogni punto della diluizione seriale 2 volte per preparare un 40 μL di soluzioni di lavoro 10x in DMSO al 10% (v/v) (cioè Da 100 μM a 0,39 μM 10% serie di scorte DMSO porterà a una soluzione finale da 10 μM a 0,039 μM, in 1% DMSO se aggiunto alle cellule). Per quanto riguarda il controllo del trattamento, preparare anche una soluzione stock solo DMSO al 10% in acqua sterile di grado HPLC.
   4. Aggiungere 10 μL di soluzioni di lavoro 10x alle celle della piastra ben opaca 96 al fine di ottenere la concentrazione finale prevista con una concentrazione residua di DMSO dell'1% (v/v) in un volume totale di 100 μL e incubare per 3 h a 37 °C con 5% v/v CO_{atmosferica 2}.
3. Test di complementazione luciferasi e fattibilità
   1. Dopo 3 ore di farmaco, iniziare a preparare il reagente del substrato di luciferasi combinando 1 volume di substrato con 19 volumi del reagente di diluizione (vedere le istruzioni del produttore).
      NOTA: Il saggio luciferasi viene eseguito utilizzando un kit disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali).
   2. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere immediatamente 25 μL di reagente del substrato.
   3. Agitare la piastra a 350 giri/min per 50 minuti su uno shaker orbitale a temperatura ambiente.
   4. Valutare la luminescenza utilizzando un lettore di lastre. Per fare ciò, impostare il lettore di specchi sulla luminescenza e il filtro di emissione su 455. Utilizzare un'altezza di misura di 6,5 mm con un tempo di misurazione di 1 s.
   5. Per valutare la vitalità delle cellule, aggiungere 33 μL di reagente di dosaggio di vitalità e quindi rimescolare nuovamente la luminescenza dopo 15 minuti a temperatura ambiente, utilizzando il lettore di piastre.
   6. Valutare la luminescenza con il lettore di lastre impostando il lettore di specchi sulla luminescenza e il filtro di emissione su 600 nm. Utilizzare un'altezza di misura di 6,5 mm con un tempo di misurazione di 1 s.
      NOTA: La vitalità viene valutata misurando il livello intracellulare di ATP sullalisi cellulare secondo le istruzioni del produttore. Il multiplexing è possibile in questo caso poiché il saggio di fattibilità utilizza una luciferasi diversa con una diversa lunghezza d'onda di emissione.
   7. Utilizzate i dati per determinare i valori IC50 di ogni composto per curva adattando i dati a un'equazione della curva di raccordo a 4 parametri:
      Y = ((A-D)/(1+((x/C)^B))) + D
      I valori numerici D e A devono essere vincolati nel processo di raccordo della curva:
      D = valore luminescente sull'asse Y per un asintoto di curva minimo o un livello teorico minimo di risposta previsto dal saggio di complementazione eIF4E:4G.
      A = valore luminescente sull'asse Y per l'asintoto della curva massima o la massima risposta teorica al livello prevista dal saggio di completamento eIF4E:4G.
      NOTA: Il valore per la risposta minima è derivato dal trattamento di controllo DMSO (v/v) dell'1% e il valore per la risposta massima deriva dalla risposta massima di un inibitore mTOR ad alta affinità che si è stabilizzato senza alcun effetto sulla vitalità cellulare.

2. Correlare l'inibizione del saggio eIF4E:eIF4G^604-646 con interruzione complessa del fei4F nelle cellule

1. Confermare che il segnale misurato dal saggio corrisponde all'interruzione fisica dell'interazione eIF4E-eIF4G da parte del composto, cellule di semi come descritto al passaggio 1.1.
2. Il giorno dopo, sostituire il mezzo con 1 mL di mezzo siero ridotto non contenente rosso fenolo e incubare per 4 ore con il composto di interesse. Assicurare una concentrazione residua di DMSO dell'1% (v/v) in un volume totale di 1 mL.
   NOTA: Per consentire facilmente una correlazione con il risultato, utilizzare concentrazioni composte all'inizio, al punto medio e all'estremità della curva di titolazione del saggio di complementazione misurata.
3. Le celle Lyse ed eseguite m⁷GTP si abbassano per isolare i complessi eIF4F ed eIF4E:4EBP1. Procedure dettagliate su come eseguire l'esperimento pull down m⁷GTP possono essere trovate altrove¹⁴.
4. Rilevare i livelli di proteine m⁷GTP bound eIF4G, eIF4E e 4EBP1 mediante analisi western blot, quindi correlare con l'interruzione del complesso eIF4F con l'inibizione del segnale di dosaggio di complementazione.

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Risultati

Al fine di convalidare la sensibilità del sistema di complementazione eIF4E:eIF4G^604-646, l'inibizione mediata 4EBP1 dell'assemblaggio complesso eIF4F è stata valutata utilizzando inibitori mTOR. Inibendo la fosforilazione dipendente dalla chinasi mTORC1 della famiglia di proteine 4EBP, l'inibizione mTOR migliora l'associazione 4EBP1 all'eIF4E e, quindi, allo smontaggio eIF4F¹⁵. Sono state testate due classi di inibitori meccanisticamente diversi delle...

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Discussione

Il metodo descritto in questo articolo utilizza un saggio di complementazione basato sulla luciferasi per monitorare quantitativamente l'assemblaggio complesso eIF4F attraverso la misurazione diretta dell'interazione eIF4G-eIF4E nelle cellule vive. Abbiamo fornito dettagli per l'uso del sistema di completamento eIF4E-eIF4G e abbiamo anche dimostrato che il sistema è estremamente accurato nella misurazione della dissociazione mediata da 4EBP1 indotta da farmaci dell'interazione eIF4E-eIF4G¹⁶. Al f...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
293FT cells	Thermo Fisher Scientific	R70007
Cell culture microplate 96 well, F-Bottom	greiner bio-one	655083
Cell titer Glo 2.0	PROMEGA	G9241
Envision Multilabel Reader	PerkinElmer	not applcable
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml	Thermo Fisher Scientific	4662070
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml	Thermo Fisher Scientific	4662050
FUGENE6	PROMEGA	E2692
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000015
NanoBiT PPI Starter Systems	PROMEGA	N2014
Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	11058021
Orbital shaker	Eppendorf	not appicable
γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose	Jena Bioscience	AC-155S