Durchflusszytometrie Analyse von Immunzell-Subsets innerhalb der Murinenmilen, Knochenmark, Lymphknoten und Synovialgewebe in einem Osteoarthritis-Modell

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein detailliertes und reproduzierbares Flusszytometrieprotokoll zur Identifizierung von Monozyten-Makrophagen- und T-Zell-Subsets mit extra- und intrazellulären Färbetests innerhalb der murinen Milz, des Knochenmarks, der Lymphknoten und des Synovialgewebes unter Verwendung eines etablierten chirurgischen Modells der murinen Arthrose.

Zusammenfassung

Osteoarthritis (OA) ist eine der häufigsten Muskel-Skelett-Erkrankungen, die Patienten mit Schmerzen und körperlichen Einschränkungen betrifft. Jüngste Erkenntnisse deuten auf eine mögliche entzündliche Komponente der Krankheit hin, wobei sowohl T-Zellen als auch Monozyten/Makrophagen potenziell mit der Pathogenese von OA in Verbindung gebracht werden können. Weitere Studien postulierten eine wichtige Rolle für Teilmengen der beiden entzündlichen Zelllinien, wie Th1, Th2, Th17 und T-regulatorische Lymphozyten, und M1, M2, und Synovium-Gewebe-residenten Makrophagen. Die Wechselwirkung zwischen der lokalen synovialen und systemischen entzündlichen zellulären Reaktion und den strukturellen Veränderungen im Gelenk ist jedoch unbekannt. Um vollständig zu verstehen, wie T-Zellen und Monozyten/Makrophagen zu OA beitragen, ist es wichtig, diese Zellen und ihre Teilmengen gleichzeitig in Synovialgewebe, sekundären Lymphorganen und systemisch (Milz und Knochenmark) quantitativ identifizieren zu können. Heutzutage können die verschiedenen entzündlichen Zelluntermengen durch eine Kombination von Zell-Oberflächen-Markern identifiziert werden, was die mehrfarbige Durchflusszytometrie zu einer leistungsstarken Technik bei der Untersuchung dieser zellulären Prozesse macht. In diesem Protokoll beschreiben wir detaillierte Schritte zur Gewinnung von Synovialgewebe und sekundären lymphatischen Organen sowie zur Erzeugung von einzelzelligen Suspensionen. Darüber hinaus präsentieren wir sowohl einen extrazellulären Färbetest zur Identifizierung von Monozyten/Makrophagen und deren Teilmengen als auch einen extra- und intrazellulären Färbetest zur Identifizierung von T-Zellen und deren Teilmengen innerhalb der murinen Milz, des Knochenmarks, der Lymphknoten und des Synovials. Jeder Schritt dieses Protokolls wurde optimiert und getestet, was zu einem hochreproduzierbaren Assay führte, der für andere chirurgische und nicht-chirurgische OA-Mausmodelle verwendet werden kann.

Einleitung

Osteoarthritis (OA) ist eine schwächende und schmerzhafte Krankheit mit verschiedenen Pathologien aller Gewebe, die mit dem Gelenk¹verbunden sind. OA betrifft etwa 3,8 % der Weltbevölkerung², OA ist eine der am weitesten verbreiteten Muskel-Skelett-Erkrankungen und es soll die^4. führende Ursache von Behinderungen weltweit bis 2020³werden. Posttraumatische OA tritt nach einer Gelenkverletzung auf und macht mindestens 12% aller OA und bis zu 25% der OA in anfälligen Gelenken wie dem Knie^4,5aus. Darüber hinaus erhöht Gelenkverletzung das Lebenslange Risiko von OA um mehr als das Fünffache^{von 6}. Nicht alle Verletzungen mit scheinbar ähnlicher Instabilität werden OA entwickeln, und daher bleiben die Definition von Faktoren, die das langfristige OA-Risiko antreiben, herausfordernd. Es ist von entscheidender Bedeutung, um wirksame Behandlungen zu entwickeln, um posttraumatische OA zu verhindern und/oder zu behandeln, die verletzungsspezifische Pathologie, Ursachen und Mechanismen zu untersuchen und besser zu definieren, die OA¹prädisponieren.

OA und seine definierende Knorpelzerstörung wurde früher vollständig auf mechanische Beanspruchung zurückgeführt und oA wurde daher als nicht-entzündliche Erkrankung angesehen². Jedoch, neuere Studien haben gezeigt, eine entzündliche Infiltration von Synovialmembranen und eine Zunahme der entzündlichen Zellen im Synovialgewebe bei Patienten mit OA im Vergleich zu gesunden Kontrollen², Licht auf eine entzündliche Komponente als potenzielle treibende Kraft in OA. Weitere Studien zeigten, dass Anomalien sowohl im CD4+ als auch im CD8+ T-Zell-Profil sowie Monozyten/Makrophagen des angeborenen Immunsystems zur Pathogenese von OA^2,7beitragen können. Detaillierte Untersuchungen dieser Anomalien ergaben relevante Rollen für verschiedene T-Zell-Teilmengen², wie Th1⁸, Th2⁹, Th17⁸ und T regulatorische (Treg) Populationen^10,11. Trotz dieser überzeugenden Beweise ist der kausale Zusammenhang zwischen der Veränderung der T-Zell-Antworten und der Entwicklung und Progression von OA noch unbekannt².

Zusätzlich zu bestimmten T-Zellen, die eine Rolle in OA spielen, deuten neuere Studien darauf hin, dass differenziell polarisierte/aktivierte Makrophagen mit der Pathogenese von OA¹²in Verbindung gebracht werden können. Insbesondere akkumulieren Makrophagen aus Blutmonozyten im Synovium und polarisieren entweder in klassisch aktivierte Makrophagen (M1) oder alternativ aktivierte Makrophagen (M2) während der OA-Entwicklung, was eine Korrelation zwischen monozytenabgeleiteten Makrophagen und OA¹³impliziert. Im Gegensatz dazu bevölkern bestimmte Teilmengen von Makrophagen Organe früh während der Entwicklung und unterstützen ihre Zahl in einer monozytenunabhängigen Materie¹⁴. Kürzlich wurde eine gemeinsame Schutzfunktion gezeigt, die durch eine enge Kreuzungsbarriere vermittelt wurde, für diese synovial-geweberesidenten Makrophagen (STRMs)¹⁴. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Anomalien in bestimmten Makrophagen-Teilmengen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von OA spielen können. Die Wechselwirkungen zwischen dieser entzündlichen zellulären Reaktion und den strukturellen Veränderungen im Gelenk nach dem Trauma sind jedoch unbekannt.

Historisch gesehen beschränkte sich die Analyse von Immunzellen im Synovialgewebe auf die Immunhistochemie (IHC) oder mRNA-Expression durch Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) Ansätze^15,16. Sowohl IHC als auch RT-PCR sind jedoch nicht in der Lage, mehrere verschiedene Zelltypen und deren Teilmengen gleichzeitig zu identifizieren, wodurch die Anwendbarkeit dieser Methoden eingeschränkt wird. Darüber hinaus beschränkt sich IHC auf die Analyse von kleinen Gewebeproben und kann fokale entzündliche Zellansammlungen verpassen. In den letzten Jahren wurden unzählige Oberflächenmarker für verschiedene Zelltypen entwickelt, und Untermengen von Immunzellen können nun durch unterschiedliche Kombinationen dieser Marker zuverlässig identifiziert werden. Aufgrund des stetigen technischen Fortschritts sind Durchflusszytometer nun in der Lage, eine Vielzahl verschiedener Fluorchrome gleichzeitig zu identifizieren, was die Analyse großer mehrfarbiger Antikörperplatten ermöglicht.

Die Durchflusszytometrie bietet den Forschern eine leistungsstarke Technik, die die gleichzeitige Identifizierung und Quantifizierung einer Vielzahl von Immunzellen und deren Teilmengen auf Einzelzellebene ermöglicht. Wir haben sowohl einen extrazellulären Färbetest zur Identifizierung von Monozyten/Makrophagen und deren Teilmengen als auch einen extra-intrazellulären Färbetest entwickelt und optimiert, um T-Zellen und ihre Untergruppen in muriner Milz, Knochenmark, Lymphknoten und Synovialgewebe zu identifizieren. Jeder Schritt dieses Protokolls wurde optimiert und getestet, was zu einem hochreproduzierbaren Assay führte, der für andere chirurgische und nicht-chirurgische OA-Mausmodelle¹⁷verwendet werden kann.

Protokoll

Die Northern Sydney Local Health District Animal Ethics Committee hat alle in diesem Protokoll genannten Verfahren genehmigt. Mäuse werden gemäß dem Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Health and Medical Research Council of Australia Revised 2010) untergebracht und gepflegt. Für alle Experimente wurden 10-12 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse eingesetzt.

HINWEIS: Um posttraumatische OA zu induzieren, wurde eine chirurgische Destabilisierung des medialen Meniskus (DMM) im rechten Stimmlergelenk durchgeführt. Detaillierte Informationen zu diesem Tiermodell wurden von Glasson et al.¹⁸veröffentlicht. Kurz gesagt, die Vollnarkose wird in einer Induktionskammer mit Isofluran induziert und anschließend mit einem Nasenkegel aufrechterhalten. Das chirurgische Bein wird mit einer Rasierklinge rasiert und die chirurgische Stelle wird gewaschen und mit Ethanol getupft, um die Kontamination zu minimieren. Das Tier wird dann zum Operationsmikroskop bewegt und auf ein steriles Handtuch gelegt und das Bein mit sterilem Papierdraps drapiert, um die chirurgische Stelle zu isolieren und die Kontamination zu minimieren. Mit Hilfe des Mikroskops wird eine 0,5 cm mediale Para-Patella-Arthrotomie hergestellt, die Patella seitlich luxiert und das Infra-Patella-Fettpolster erhöht, um das mediale Menisko-Tibialband freizulegen, das mit sezierenden Zangen transsektiert wird. Das Gelenk wird mit steriler Herzwäsche gespült, um Blut zu entfernen und die Wunde wird in drei Schichten geschlossen – Gelenkkapsel, Subkutangewebe (mit Nahtmaterial) und Haut (mit chirurgischem Gewebekleber). Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden können jedoch auf andere Modelle und Methoden zum Induzieren von OA angewendet werden. OA kann auf beiden Seiten des Tieres induziert werden, und bei der Ernte von Geweben ist es wichtig, die ipsilateralen (draining) Lymphknoten zu ernten.

1. Isolierung der Milz, kontralaterales Knochenmark, ipsilaterale Lymphknoten, die das Stifle und das Synovialgewebe entwässern

1. Euthanisieren Sie die Maus durch zervikale Dislokation. Legen Sie die Maus in eine Supine-Position unter einem Sezieren mikroskop und wischen Sie Brust, Bauch und Beine mit 70% Ethanol ab. Öffnen Sie die Haut an der Mittellinie vorsichtig für die Länge des Bauches mit einer geraden Schere, die die Bauchhöhle intakt lässt.
2. Ziehen Sie die Haut auf der rechten Seite des Tieres vorsichtig vom darunter liegenden Muskel weg und lassen Sie das subkutane Fettgewebe an der Haut hängen. Normalerweise trennt die sanfte Traktion allein die Haut und das darunter liegende Fettgewebe vom Muskel. Sporadische Haftungen sollten mit einer feinen Schere durchgeschnitten werden, um die spannung zu halten, die notwendig ist, um Gewebe zu trennen und die Wahrscheinlichkeit zu verringern, die Lymphknoten zu schädigen. Identifizieren Sie eine Kreuzung von drei Gefäßen, indem Sie das fette Gewebe am Oberschenkel mit zwei gekrümmten feinen Zangen sanft herausheben. Der Leistenlymphknoten befindet sich an der Kreuzung und kann durch seine eiförmige Form und etwas dunklere Farbe identifiziert werden.
3. Entfernen Sie den Leistenlymphknoten mit feiner Sezieren der Zange. Achten Sie darauf, die Kapsel nicht zu brechen. Entfernen Sie das restliche Fett auf der Oberfläche des Lymphknotens mit der Zange.
4. Öffnen Sie die Bauchhöhle und identifizieren Sie die Milz. Die Milz mit einer feinen Schere ausschneiden. Ziehen Sie den Darm vorsichtig zur Seite, um die Aorta und ihre Bifurkation freizulegen, die darauf achtet, sie nicht zu beschädigen, um das Risiko einer Kontamination zu minimieren. Der iliac Lymphknoten befindet sich am Endsegment der Bauchaorta und dem Ursprung der gemeinsamen Iliasarterie. Entfernen Sie den rechten iliac Lymphknoten und gehen Sie wie in 1.3 beschrieben.
5. Entfernen Sie vorsichtig die Haut beider Hinterbeine. Sezieren Sie den linken Oberschenkelknochen, indem Sie ihn mit der Klinge und der feinen Schere aus dem Muskelgewebe reinigen. Trennen Sie vorsichtig sowohl das Ersticken als auch das Hüftgelenk und lassen Sie den gesamten Knochen intakt und entfernen Sie den Oberschenkelknochen.
6. Identifizieren Sie die Patellasehne des rechten Stäubegelenks, dann entfernen Sie das angrenzende Muskelgewebe proximal, um dies mit einer feinen Schere, bis etwa 5mm Quadrizepssehne proximal zur Patella ausgesetzt ist. Danach durchschneiden Sie durch die Quadrizepssehne ca. 3-4mm proximal zur Patella, um einen Griff zu bilden und mit feinen Zangen sanft vom Gelenk wegzuziehen. Dies wird die Ränder der Gelenkkapsel Befestigung an Oberschenkelknochen sichtbar machen, und mit einem Skalpell Klinge sorgfältig entlang der Kanten der Gelenkkapsel auf beiden Seiten geschnitten, beginnend am Oberschenkelin in Richtung tibia, um die Menge der Synovialmembran, die geerntet wird zu maximieren. Beim Schneiden ist es wichtig, eine sanfte Traktion auf der Quadrizepssehne zu erhalten und innezuhalten, wenn der Synovialgewebeblock nur an der Tibia befestigt ist. In diesem Stadium ist das intraartikuläre Fettpolster nun deutlich sichtbar distal zur Patella und kann mit der Klinge sanft vom Gelenk und vorderen Aspekt der Meniszien gelöst werden. Danach schneiden Sie entlang des verbleibenden Teils der Gelenkkapsel (tibialen Teil), um den Synovialgewebeblock zu entfernen.
   HINWEIS: Dieser Schritt muss sehr präzise durchgeführt werden, um zuverlässige Ergebnisse zu ermöglichen. Nach Abschluss der Zerlegung sollte der "Synovialgewebeblock" aus Patella, Patellasehnenartde, Infrapatellarfettpad, supra- und infrapatellarer Aussparung synovialauskleidung und der damit verbundenen Gelenkkapsel vor den Kollateralbändern bestehen. Halten Sie alle Gewebe feucht während der Zerlegung mit 0,9% Saline-Lösung.
   HINWEIS: Legen Sie jede Synovialgewebeblockprobe in einen separaten Brunnen einer gekennzeichneten 24-Well-Platte mit 1,5 ml RPMI 1640 Medium. Kombinieren Sie sowohl den Ilias als auch den Leistenlymphknoten in einem Brunnen und bündeln Sie Gewebe von zwei Mäusen.

2. Erzeugung von einzelzelligen Suspensionen aus jedem Gewebe

HINWEIS: Um ausreichende Zellzahlen für die Strömungsanalyse zu gewährleisten, müssen Synovialgewebe von zwei Mäusen gepoolt werden. Im aktuellen Protokoll, bündeln Sie alle Gewebe von den gleichen beiden Mäusen, um Analogie zu erhalten. Darüber hinaus wurden iliac und leistende Lymphknoten für jedes Tier kombiniert, was zu insgesamt 4 Lymphknoten für jede Probe führte. Im Allgemeinen reichen Zellnummern in Milz, Knochenmark und Lymphknoten eines Tieres aus, um eine Strömungsanalyse durchzuführen, und das Protokoll kann angewendet werden. Bei der Verwendung von Geweben aus nur einer Tierlysing-Zeit müssen jedoch möglicherweise Anpassungen erforderlich sein.

1. Die Milz
   1. Legen Sie die beiden gepoolten Milz auf ein 70 m Zellsieb auf einem 15 ml Rohr. Die Milz vorsichtig durch den Netzfilter mit einem sterilen Spritzenkolben von 3 ml mazerieren. Spülen Sie das Sieb häufig mit insgesamt 6 ml RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10% FBS.
   2. Drehen Sie die Zellen (500 x g, 5 min, RT) und setzen Sie das Pellet in 5 ml roter Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer wieder auf. Inkubieren Sie für 5 min bei RT und stoppen Sie die Reaktion durch Verdünnung des Lysepuffers mit 10 ml PBS. Drehen Sie die Zellen (500 x g, 5 min, RT) und wiederholen Sie diesen Schritt einmal oder bis sich kein RBC mehr im Pellet befinden.
      HINWEIS: Filtern Sie die Suspension mit einem 30-m-Zellsieb in ein neues 15 ml-Rohr zwischen den beiden Lysing-Runden, um koagulierte Zellen zu entfernen.
   3. Nach Abschluss der Lysing drehen Sie die Zellen (500 x g, 5 min, RT), verwerfen Überstand und resuspendpellet in 1 ml PBS. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen auf einem Hämozytometer mit Trypan-Blauausschluss.
2. Die Lymphknoten
   1. Legen Sie die vier gepoolten Lymphknoten auf ein 70 m Zellsieb auf einem 15 ml-Rohr. Necken Sie die Lymphknoten vorsichtig in eine einzellige Suspension, indem Sie sie mit einem sterilen 3 ml Spritzenkolben pressen. Spülen Sie das Sieb häufig mit insgesamt 6 ml RPMI mit 10% FBS.
   2. Drehen Sie die Zellen (500 x g, 5 min, RT), entsorgen Sie Überstand und setzen Sie das Pellet in 500 l PBS wieder auf. Filtern Sie die Suspension mit einem 30-m-Zellsieb in ein neues 15 ml-Rohr, um koagulierte Zellen zu entfernen. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen auf einem Hämozytometer mit Trypan-Blauausschluss.
3. Das Knochenmark
   1. Greifen Sie den intakten Oberschenkelknochen vorsichtig mit einer Gewebe-Daumenzange, ohne ihn zu brechen. Schneiden Sie das Ende des proximalen Oberschenkelknochens mit einer scharfen Schere ab, um die Spülung des Knochens zu erleichtern. Drehen Sie den Oberschenkelknochen um und positionieren Sie eine 23 G Nadel in der Mitte der interkondylaren Kerbe des Oberschenkelknochens. Während des sanften Drucks drehen Sie die Nadel zwischen Daumen und Zeigefinger, um ein Loch in die intercondylar Kerbe zu bohren, um in die Knochenhöhle einzutreten.
      HINWEIS: Manchmal können Partikel des Knochens die Nadel nach dem Bohren des Lochs behindern, um unnötigen hohen Druck beim Spülen eines Nadelwechsels vor dem Spülen zu vermeiden.
   2. Spülen Sie den Knochen mit 6 ml RPMI mit 10% FBS (oder bis der Flush weiß wird) mit einer 10 ml Spritze mit einer 23 G Nadel auf ein 70-m-Zellsieb, das auf ein 15 ml-Rohr gelegt wird. Drücken Sie das Knochenmark vorsichtig durch das Zellsieb mit einem Kolben einer 3 ml Spritze und spülen Sie das Sieb mit weiteren 3 ml RPMI.
      HINWEIS: Die Knochen sollten weiß erscheinen, sobald das gesamte Mark vollständig ausgespült wurde.
   3. Drehen Sie die Zellen (500 x g, 5 min, RT) und setzen Sie das Pellet in 5 ml RBC-Lysepuffer wieder auf. Inkubieren Sie für 5 min bei RT und stoppen Sie die Reaktion durch Verdünnung des Lysepuffers mit 10 ml PBS.
   4. Drehen Sie die Zellen (500 x g, 5 min, RT), entsorgen Sie Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml PBS wieder auf. Filtern Sie die Suspension mit einem 30-m-Zellsieb in ein neues 15 ml-Rohr, um koagulierte Zellen zu entfernen. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen auf einem Hämozytometer mit Trypan-Blauausschluss.
4. Das Synovialgewebe
   1. Die beiden Synovialgewebeblöcke mit einer feinen chirurgischen Schere in winzige Stücke zerkleinern. Übertragen Sie die Proben mit Medium in ein 15 ml Rohr. Spülen Sie den alten Brunnen mit zusätzlichen 0,5 ml RPMI, um verbleibende Zellen und Synovialgewebe zu erhalten, in das Falkenrohr zu übertragen (Endvolumen 2 ml).
      TIPP: Verwenden Sie eine Transferpipette und schneiden Sie die Spitze, wo sich der Durchmesser in diesem Schritt vergrößert.
   2. Rekonstituieren Enzym und aliquot nach Herstelleranweisungen (z.B. Liberase). Fügen Sie genügend Enzym hinzu, um eine Endkonzentration von 1 Einheit/ml (insgesamt 2 Einheiten pro Probe) zu erreichen. Mit einem MACS-Rotator bei 37 °C für 2 h verdauen.
   3. Beenden Sie die Verdauung, indem Sie 8 ml RPMI mit 10% FBS und Filterzellensuspension durch ein 70-m-Zellsieb in ein neues 15 ml-Rohr geben. Spülen Sie das alte 15 ml-Rohr mit weiteren 5 ml RPMI mit 10% FCS-Medium und Filterzellensuspension durch gleiches Zellsieb in das neue Rohr (15 ml Endvolumen).
   4. Drehen Sie die Zellen (500 x g, 10 min, RT), entsorgen Sie Überstand und setzen Sie das Pellet in 500 l PBS wieder auf. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen auf einem Hämozytometer mit Trypan-Blauausschluss.

3. Zuweisung von Zellen

1. Beschriften Sie zwei 96-Well-Platten (U-Boden-Form) mit Gewebetyp, Tier-ID und dem dafür vorgesehenen Antikörper-Panel. In diesem Protokoll werden insgesamt zwei Antikörper-Panels verwendet: Monozyten-Untersatz-Panel (extrazelluläre Färbung) und T-Zell-Untermengenpanel (extra- und intrazelluläre Färbung).
2. Stellen Sie 5 x 10⁵ Zellen pro Brunnen mit den jeweiligen einzelzelligen Suspensionen zur Verfügung.
   ANMERKUNG: Bewerten Sie beim Einrichten des Experiments die absolute Anzahl der Zellen, die pro Gruppe und Gewebetyp erwartet werden (behandelte Tiere haben eine höhere Zellzahl in Geweben als Kontrolltiere). Wenn Sie das Zellpellet während des letzten Schritts der Erzeugung von Einzelzellsuspensionen wieder aufhängen, wählen Sie eine angemessene Menge an PBS, um am Ende eine Konzentration von 5 x 10⁵ pro 200 l zu haben. Die hier verwendete 96-Well-Platte kann maximal 300 l aufnehmen, und in der Regel sind 200 l ideal, um das Risiko einer Kreuzkontamination durch Verschüttung zu minimieren.
3. Verteilen Sie für jedes Panel und jeden Gewebetyp mindestens 5 x 10⁵ Zellen als ungefärbte Kontrollen in gut markierten Brunnen.

4. Monozyten-Teilsatz-Panel

1. Durchführbarkeitsfärbung durchführen: Spinzellen (500 x g, 5 min, 4 °C) mit einem Plattenspinner und waschen Sie die Zellen einmal mit 200 l 1x PBS. Bereiten Sie eine Stammlösung aus zellimpermeant Amin-reaktivem Farbstoff (Lebensfähigkeitsfleck) verdünnt 1:50 in 1x PBS. Danach setzen Sie die Zellpellets mit 100 l dieser Stammlösung wieder auf, was zu einem absoluten Volumen von 2 l Lebensfähigkeitsfleck pro Bohrgut führt. 15 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.
   HINWEIS: Die optimale Menge an Rentabilität Fleck benötigt sollte durch die Durchführung einer Dosis Titration Kurve bestimmt werden. Darüber hinaus sollte die verdünnte Lebensfähigkeits-Fleckenstofflösung an einem einzigen Tag verwendet und nicht gelagert werden. Weitere Informationen zur Rekonstituieren, Verdünnung und Lagerung des Rentabilitätsflecks finden Sie in den Anweisungen des Herstellers.
2. Während der Inkubation den Cocktail von Antikörpern in einem geeigneten Volumen FACS-Puffer (Ca2+ und Mg+ freie PBS mit 0,1%BSA und 0,02% Natriumazid) zubereiten. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 l FACS-Puffer, Zentrifuge (500 x g, 5 min, 4 °C) und setzen Sie jedes Pellet mit 100 l des Antikörpergemisches oder eines geeigneten Kontrollgemisches wieder auf. 30 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.
   HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass Natriumazid für Zellen giftig ist. Im aktuellen Protokoll ist die Natriumazidkonzentration im Strömungspuffer sehr gering (0,02%) und Proben werden so unmittelbar nach der Färbung ausgeführt, was kein Problem verursacht. Wenn nachgelagerte funktionelle Assays von sortierten Zellen geplant sind, könnte es von Vorteil sein, jeden Tag der Experimente einen frischen FACS-Puffer zu bilden und kein Natriumazid zu verwenden. Bei der Verwendung einer Vielzahl von Antikörpern, Es wird empfohlen, eine angemessene Menge an "Brilliant Stain Buffer" zu dem Cocktail von Antikörpern hinzufügen, um die Ergebnisse zu verbessern.
3. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 L FACS-Puffer und setzen Sie die Zellen in 250 L FACS + EDTA-Puffer (FACS-Puffer mit 1 mM EDTA) wieder aus. Übertragen Sie Proben in beschriftete FACS-Rohre. Proben bei 4 °C aufbewahren und bis zur Erfassung vor Licht schützen.
   HINWEIS: Immunzellen neigen dazu, klebrig zu sein. Um sowohl das Risiko einer Verstopfung als auch die Anzahl der Doublets zu minimieren, wird empfohlen, dem endgültigen Durchflusspuffer 1 mM EDTA hinzuzufügen.

5. T-Zell-Teilmengen-Panel

1. Durchführbarkeitsfärbung durchführen: Spinzellen (500 x g, 5 min, 4 °C) mit einem Plattenspinner und waschen Sie die Zellen einmal mit 200 l 1x PBS. Bereiten Sie eine Stammlösung aus zellimpermeant Amin-reaktivem Farbstoff (Lebensfähigkeitsfleck) verdünnt 1:50 in 1x PBS. Danach setzen Sie die Zellpellets mit 100 l dieser Stammlösung wieder auf, was zu einem absoluten Volumen von 2 l Lebensfähigkeitsfleck pro Bohrgut führt. 15 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.
2. Während der Inkubation der Proben bereiten Sie den extrazellulären Färbe-Antikörper-Cocktail in einem entsprechenden Volumen von 1x FACS-Puffer vor. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 l 1x FACS Puffer, drehen Sie sie nach unten (500 x g, 5 min, 4 °C) und setzen Sie jedes Pellet mit 100 l des Antikörpergemisches oder eines geeigneten Kontrollgemisches wieder auf. 30 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.
3. Führen Sie die intrazelluläre Färbung mit einem Fixierungs- und Permeabilisationskit nach den Anweisungen des Herstellers durch. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 l 1x FACS-Puffer und suspendieren Sie in 200 l Fixationspuffer. 40 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.
4. Während der Inkubation den Cocktail von Antikörpern (intrazelluläre Färbung) in einem geeigneten Volumen von 1x Permeabilisation und Waschpuffer vorbereiten. Sammeln Sie Zellen durch Spinnen (750 x g, 5 min, 4 °C) und waschen Sie Zellen zweimal mit 200 l von 1x perm/Waschpuffer.
   HINWEIS: Fixierung und Permeabilisierung führt zu Zellen, die in der Regel etwas schwieriger zu pellet. Um den Zellverlust während der nachfolgenden Waschschritte zu minimieren, erhöhen Sie die Fliehkraft auf 750 x g. Alternativ könnte auch ein längerer Spinnzyklus angewendet werden. Dies würde jedoch zu einer wesentlich längeren Zeit führen, die für die Vorbereitung der Zellen erforderlich ist.
5. Spinzellen (750 x g, 5 min, 4 °C) und jedes Pellet mit 100 l des Antikörpergemischs oder des geeigneten Kontrollgemisches wieder aufhängen. 40 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.
6. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 L 1x Perm/Waschpuffer und setzen Sie die Zellen in 250 l FACS + EDTA-Puffer wieder auf. Übertragen Sie Proben in beschriftete FACS-Rohre. Proben bei 4 °C aufbewahren und bis zur Erfassung vor Licht schützen.
   HINWEIS: Für jeden Antikörper muss die optimale Konzentration durch DieDurchführung einer Dosistitrationskurve bestimmt werden. Die Konzentration zwischen Antikörpern kann sich drastisch unterscheiden: CD3 und CD80 wurde mit einem Verdünnungsfaktor von 1:1 verwendet, während CD11b und CD4 mit einem Verdünnungsfaktor von 1:6400 verwendet wurden. Verwenden Sie bei der Titierung der Antikörperkonzentration die gleiche Anzahl von Zellen, die während der Experimente verwendet werden.

6. Entschädigung, angemessene Kontrollen und Gating

1. Einrichten des Experiments
   1. Sobald die optimale Antikörperkonzentration bestimmt wurde, laufen sie ungefärbt und einzelne gebeizte Kontrollen zur Kompensation, um sich an spektralen Überlappungen anzupassen.
      HINWEIS: Führen Sie alle Kompensationskontrollen mit Zellen und Kompensationsperlen aus. Verwenden Sie alles, was die hellsten Ergebnisse (höchstem MFI positiver Ereignisse) für die Kompensation generiert. MFI steht für mittlere Fluoreszenzintensität und wird häufig verwendet, um die mittlere Intensität des erzeugten Signals und damit die Höhe der Antikörperexpression zu beschreiben und zu definieren.
   2. Führen Sie Fluoreszenz minus eins (FMO) und Isotypsteuerungen aus, wenn Sie ein neues Multicolor-Experiment starten. Weitere Einzelheiten zum FMO wurden bereits veröffentlicht¹⁹.
   3. Bestimmen Sie die optimale Forward Scatter Area (FSC-A) Spannung und Side Scatter Area (SSC-A) Spannung, um die Leukozytenpopulation in ungefärbten Kontrollen jedes Gewebetyps zu erkennen.
      HINWEIS: Der Fixierungs- und Permeabilisierungsprozess ändert die Abmessungen der Zelle. Somit unterscheiden sich die FSC-A- und SSC-A-Spannungen für das Monocyte Subset Panel und das T Cell Subset Panel erheblich. Um die optimalen Spannungen für das T Cell Subset Panel zu finden, verwenden Sie Zellen, die einzeln mit CD3 und back gate in Richtung der Leukozytenpopulationen gefärbt wurden, während Sie die FSC-A- und SSC-A-Werte anpassen.
2. Gating-Strategie
   1. Sobald die optimale FSC-A- und SSC-A-Spannung ermittelt wurde, richten Sie ein primäres Tor auf die Leukozytenpopulation ein.
      HINWEIS: Vor jedem Experiment kalibrieren Sie das Zytometer mit Kalibrierperlen gemäß den Anweisungen des Herstellers und führen Sie ungefärbte Perlen. Leukozytenpopulationen mit unterschiedlichen Zeitpunkten sollten vergleichbare FSC- und SSC-Eigenschaften aufweisen (leichte Unterschiede zwischen den Gewebetypen werden erwartet und normal). Wenn FSC und SSC variiert erhebliche Probleme schießen das Zytometer und Probe-Generierung.
   2. Doppelgänger ausschließen: Plot FSC-A (y-Achse) und FSC-H (x-Achse). Singlets werden als Diagonale dieses Diagramms angezeigt. Tor auf Singlets.
   3. Totzelle ausschließen: Plot FVS510 (Lebensfähigkeitsfleck) (x-Achse) und FSC-A (y-Achse). Abgestorbene Zellen erscheinen als positive Ereignisse, also Tor auf lebenden Zellen.
      HINWEIS: Echte negative Zellen werden in nicht befleckten Steuerelementen sichtbar. Passen Sie daher dieses Tor für jeden Satz von Proben an, wenn Sie die ungefärbten Steuerelemente vor den gebeizten Proben ausführen. Weitere Gating hängt von der Antikörper-Panel und Zelltyp, die untersucht wird. Gating-Strategien für jedes in diesem Protokoll verwendete Panel finden Sie in Abbildung 1 bzw. Abbildung 4.

Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse sowohl aus dem Monozyten-Teilmengenbereich als auch aus dem T-Zell-Teilmengenbereich werden unten beschrieben.

Abbildung 1 zeigt die hierarchische Gating-Strategie für das Monozyten-Untersatzpanel auf Immunzellen, die aus Knochenmark von DMM-behandelten Tieren gewonnen wurden. Die gleiche Strategie wurde in allen anderen Gewebetypen verwendet und verifiziert. Beim Einrichten des Experiments wurde für jeden Gewebetyp die Spannung des Vo...

Diskussion

Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden entwickelt und getestet, um verschiedene Teilmengen sowohl aus Monozyten/Makrophagen als auch aus T-Zellen innerhalb der murinen Milz, des Knochenmarks, der Lymphknoten und des Synovialgewebes in einem murinen Modell der Arthrose (OA) zuverlässig zu identifizieren. Das aktuelle Protokoll kann leicht geändert werden, um verschiedene Gewebetypen oder andere Zelltypen durch Austausch von Antikörpern zu untersuchen, und kann für alternative murine Modelle von OA verwe...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC anti-mouse CD194 (CCR4)	BioLegend	131212	T-Cell Panel
Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst	BD	566385	Buffers
Fixable Viability Stain 510, 100 µg	BD	564406	T-Cell Panel
Fixable Viability Stain 510, 100 µg	BD	564406	Monocyte Panel
Liberase, Research Grade	Roche	5401127001	Enzyme for synovial tissue
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg	BD	564985	Monocyte Panel
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg	BD	562454	Monocyte Panel
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg	BD	742274	T-Cell Panel
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg	BD	565250	Monocyte Panel
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg	BD	563061	T-Cell Panel
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg	BD	557596	T-Cell Panel
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg	BD	552775	T-Cell Panel
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg	BD	565480	T-Cell Panel
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg	BD	565261	T-Cell Panel
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg	BD	740664	T-Cell Panel
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg	BD	563687	Monocyte Panel
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg	BD	563332	T-Cell Panel
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg	BD	565411	Monocyte Panel
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg	BD	560408	T-Cell Panel
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg	BD	563414	Monocyte Panel
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg	BD	560593	Monocyte Panel
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg	BD	560600	Monocyte Panel
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg	BD	564143	T-Cell Panel
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg	BD	562894	T-Cell Panel
Red Blood Cell Lysing Buffer	N/A	N/A	Buffers	Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): .
Transcription Factor Buffer Set 100Tst	BD	562574	Buffers