Análise de Citometria de Fluxo de Subconjuntos de Células Imunes dentro do Baço de Murina, Medula Óssea, Linfonodos e Tecido Sinovial em um Modelo de Osteoartrite

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado e reprodutível de citometria de fluxo para identificar subconjuntos de monócito/macrófago e células T usando ensaios de coloração extra e intracelular dentro do baço de murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial, utilizando um modelo cirúrgico estabelecido de osteoartrite de murina.

Resumo

A osteoartrite (OA) é uma das doenças musculoesqueléticos mais prevalentes, afetando pacientes que sofrem de dor e limitações físicas. Evidências recentes indicam um potencial componente inflamatório da doença, com células T e monócitos/macrófagos potencialmente associados à patogênese de OA. Outros estudos postularam um papel importante para subconjuntos de ambas as linhagens celulares inflamatórias, como linfócitos de th1, th2, th17 e t-regulatory, e M1, M2, e macrófagos residentes em tecido sinovium. No entanto, a interação entre a resposta celular inflamatória sinovial local e sistêmica e as mudanças estruturais na articulação é desconhecida. Para entender perfeitamente como as células T e os monócitos/macrófagos contribuem para o OA, é importante ser capaz de identificar quantitivamente essas células e seus subconjuntos simultaneamente em tecido sinovial, órgãos linfáticos secundários e sistematicamente (o baço e a medula óssea). Hoje em dia, os diferentes subconjuntos de células inflamatórias podem ser identificados por uma combinação de marcadores de superfície celular tornando a citometria de fluxo multicolorida uma técnica poderosa na investigação desses processos celulares. Neste protocolo, descrevemos etapas detalhadas relativas à colheita de tecido sinovial e órgãos linfáticos secundários, bem como a geração de suspensões de células únicas. Além disso, apresentamos um ensaio de coloração extracelular para identificar monócitos/macrófagos e seus subconjuntos, bem como um ensaio de coloração extra e intracelular para identificar células T e seus subconjuntos dentro do baço de murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial. Cada etapa deste protocolo foi otimizada e testada, resultando em um ensaio altamente reprodutível que pode ser utilizado para outros modelos de camundongos OA cirúrgicos e não cirúrgicos.

Introdução

A osteoartrite (OA) é uma doença debilitante e dolorosa que envolve várias patologias de todos os tecidos associados à articulação¹. Afetando aproximadamente 3,8% da população global², o AA é uma das doenças musculoesqueléticos mais prevalentes e deve se tornar a^4ª principal causa de incapacidade em todo o mundo até 2020³. OA pós-traumático ocorre após uma lesão articular e representa pelo menos 12% de todos os OA e até 25% de OA em articulações suscetíveis como o joelho^4,,5. Além disso, a lesão articular aumenta o risco de vida útil de OA em mais de cinco^{vezes 6}. Nem todas as lesões com instabilidade aparentemente semelhante continuarão a desenvolver OA e, portanto, a definição de fatores que impulsionam o risco OA de longo prazo permanece desafiadora. É fundamental desenvolver tratamentos eficazes para prevenir e/ou tratar o OA pós-traumático, investigar e definir melhor a patologia, causas e mecanismos específicos da lesão que predispõem à OA¹.

OA e sua definição de destruição da cartilagem foram previamente atribuídas inteiramente ao estresse mecânico e, portanto, a OA foi considerada uma doença não inflamatória². No entanto, estudos mais recentes têm mostrado uma infiltração inflamatória de membranas sinoviais e um aumento de células inflamatórias no tecido sinovial em pacientes com OA em comparação com controles saudáveis², lançando luz sobre um componente inflamatório como uma potencial força motriz em OA. Outros estudos indicaram que anormalidades tanto no perfil das células T CD4+ quanto em CD8+, bem como monócitos/macrófagos do sistema imunológico inato podem contribuir para a patogênese de OA^2,7. Investigações detalhadas sobre essas anormalidades revelaram funções relevantes para vários subconjuntos de células T², como as populações normando Th1^8,Th2⁹, Th17⁸ e T (Treg)^10,11. Apesar dessa evidência convincente, a relação causal entre a alteração das respostas das células T e o desenvolvimento e progressão da OA ainda é desconhecida².

Além de células T específicas terem um papel em OA, estudos recentes sugerem que macrófagos polarizados/ativados diferencialmente podem estar associados à patogênese de OA¹². Em particular, macrófagos originários de monócitos sanguíneos se acumulam no sinolio e polarizam-se em macrófagos ativados clássicamente (M1) ou macrófagos ativados alternativamente (M2) durante o desenvolvimento de OA, implicando uma correlação entre macrófagos derivados de monocitos e OA¹³. Em contraste, certos subconjuntos de macrófagos povoam órgãos precocemente durante o desenvolvimento e auto-sustentam seus números em uma matéria independente monócito¹⁴. Recentemente, uma função de proteção articular mediada por uma barreira de junção apertada foi mostrada para esses macrófagos residentes em tecido sinovial (STRMs)¹⁴. Esses achados indicam que anormalidades em subconjuntos de macrófagos em particular podem desempenhar um papel crucial durante o desenvolvimento do OA. No entanto, as interações entre essa resposta inflamatória celular e as mudanças estruturais na articulação posterior ao trauma são desconhecidas.

Historicamente, a análise das células imunes no tecido sinovial foi restrita à imunohistoquímica (IHC) ou à expressão mRNA por reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) se aproxima^15,,16. No entanto, tanto o IHC quanto o RT-PCR não têm a capacidade de identificar vários tipos de células diferentes e seus subconjuntos simultaneamente, limitando assim a aplicabilidade desses métodos. Além disso, o IHC limita-se à análise de pequenas amostras de tecido e pode perder acúmulos de células inflamatórias focais. Ao longo dos últimos anos, uma miríade de marcadores superficiais para vários tipos de células foram desenvolvidos, e subconjuntos de células imunes podem agora ser identificados de forma confiável por combinações distintas desses marcadores. Devido ao progresso técnico constante, os citómetros de fluxo são agora capazes de identificar uma infinidade de diferentes fluorochromes simultaneamente permitindo a análise de grandes painéis de anticorpos multicoloridos.

A citometria de fluxo fornece aos pesquisadores uma técnica poderosa que permite a identificação simultânea e quantificação de uma infinidade de células imunes e seus subconjuntos no nível único das células. Desenvolvemos e otimizamos tanto um ensaio de coloração extracelular para identificar monócitos/macrófagos e seus subconjuntos, bem como um ensaio de coloração extra/intracelular para identificar células T e seus subconjuntos dentro do baço murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial. Cada etapa deste protocolo foi otimizada e testada resultando em um ensaio altamente reprodutível que pode ser utilizado para outros modelos de camundongos OA cirúrgicos e não cirúrgicos¹⁷.

Protocolo

O Comitê de Ética Animal do Distrito Sanitário Local de Sydney aprovou todos os procedimentos mencionados neste protocolo. Os camundongos são alojados e cuidados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Health and Medical Research Council of Australia Revised 2010). Para todos os experimentos de 10 a 12 semanas de idade, foram utilizados camundongos C57BL/6 masculinos.

NOTA: Para induzir o OA pós-traumático, foi realizada a desestabilização cirúrgica do menisco medial (DMM) na articulação de sufocamento direito. Informações detalhadas sobre este modelo animal foram publicadas por Glasson et al.¹⁸. Em suma, a anestesia geral é induzida em uma câmara de indução usando isoflurano e, posteriormente, mantida usando um cone de nariz. A perna cirúrgica é raspada com uma lâmina de barbear e o local cirúrgico é lavado e esfregado com etanol para minimizar a contaminação. O animal é então movido para o microscópio de operação e colocado em uma toalha estéril e a perna coberta com cortina de papel estéril para isolar o local cirúrgico e minimizar a contaminação. Utilizando o microscópio, é feita uma artrotomia para-patela medial de 0,5 cm, a patela luxou lateralmente, e a almofada de gordura infra-patela elevada para expor o ligamento menisco-tibial medial, que é transectado com fórceps dissecando. A articulação é lavada com soro fisiológico estéril para remover qualquer sangue e a ferida está fechada em três camadas – cápsula articular, tecido subcutâneo (uso de material sutura) e pele (usando cola de tecido cirúrgico). Os métodos descritos neste protocolo, no entanto, podem ser aplicados a outros modelos e métodos para induzir o OA. OA pode ser induzido em ambos os lados do animal, e ao colher tecidos, é importante colher os linfonodos ipsilaterais (drenantes).

1. Isolamento do baço, medula óssea contralateral, linfonodos ipsilaterais drenando o sufoco e tecido sinovial

1. Eutanize o rato por luxação cervical. Coloque o mouse em uma posição supina sob um microscópio dissecando e limpe o peito, abdômen e pernas com 70% de etanol. Abra cuidadosamente a pele na linha média para o comprimento do abdômen usando uma tesoura reta deixando a cavidade abdominal intacta.
2. Puxe suavemente a pele do lado direito do animal para longe do músculo subjacente deixando o tecido adiposo subcutâneo preso à pele. Normalmente, tração suave por si só separará a pele e o tecido adiposo subjacente do músculo. As adesões esporádicas devem ser cortadas com uma tesoura fina, a fim de manter a tensão necessária para separar os tecidos ao mínimo e reduzir a chance de danificar os linfonodos. Identifique um cruzamento de três vasos provocando suavemente o tecido adiposo localizado na coxa usando dois fórceps finos curvos. O linfonodo inguinal está localizado na travessia e pode ser identificado por sua forma ovoid e cor ligeiramente mais escura.
3. Remova o linfonodo inguinal usando fórceps de dissecação fina. Tenha cuidado para não romper a cápsula. Remova a gordura restante na superfície do linfonodo com os fórceps.
4. Abra a cavidade abdominal e identifique o baço. Corte o baço com uma tesoura fina. Puxe suavemente os intestinos de lado para expor a aorta e sua bifurcação tomando cuidado para não prejudicá-los, a fim de minimizar o risco de contaminação. O linfonodo ilílico está localizado no segmento terminal da aorta abdominal e a origem da artéria ilíaca comum. Remova o linfonodo ilílico direito e prossiga conforme descrito em 1.3.
5. Remova suavemente a pele de ambos os membros traseiros. Disseque o fêmur esquerdo limpando-o do tecido muscular usando a lâmina e a tesoura fina. Desconecte cuidadosamente tanto o sufocamento quanto a articulação do quadril deixando todo o osso intacto e remova o fêmur.
6. Identifique o tendão da patela da articulação do sufocamento direito e, em seguida, remova o tecido muscular adjacente proximal a este usando uma tesoura fina até que aproximadamente 5mm de tendão quadríceps proximal à patela seja exposto. Depois disso, corte o tendão do quadríceps aproximadamente 3-4mm proximal à patela para formar uma alça e usando fórceps finos afastá-lo suavemente da articulação. Isso tornará visíveis as bordas da cápsula articular ao fêmur, e usando uma lâmina de bisturi cuidadosamente cortada ao longo das bordas da cápsula articular em ambos os lados, começando pelo fêmur indo em direção à tíbia, a fim de maximizar a quantidade de membrana sinovial que é colhida. Ao cortar é importante manter uma tração suave no tendão do quadríceps e pausar quando o bloco de tecido sinovial está apenas preso à tíbia. Nesta fase, a almofada de gordura intraarticular é agora claramente visível dítala à patela e pode ser suavemente separada da articulação e aspecto anterior do menisco usando a lâmina. Depois disso, corte ao longo da parte restante da cápsula articular (porção tibial) para remover o bloco de tecido sinovial.
   NOTA: Esta etapa tem que ser feita com muita precisão para permitir resultados confiáveis. Após a conclusão da dissecção, o "bloco de tecido sinovial" deve consistir na patela, tendão da patela, almofada de gordura infrapatora, revestimento sinovial de recesso supra e infrapaelar e cápsula articular associada anterior aos ligamentos colaterais. Mantenha todos os tecidos úmidos durante a dissecção usando solução salina de 0,9%.
   NOTA: Coloque cada amostra de bloco de tecido sinovial em um poço separado de uma placa de 24 poços rotulado contendo 1,5 ml de meio RPMI 1640. Combine tanto o ilílico quanto o linfonodo inguinal em um poço e tecidos de piscina de dois ratos.

2. Geração de suspensões celulares únicas de cada tecido

NOTA: Para garantir números celulares suficientes para análise de fluxo, tecidos sinoviais de dois camundongos precisam ser agrupados. No protocolo atual, acumule todos os tecidos dos mesmos dois camundongos para manter a analogia. Além disso, linfonodos ilílicos e inguinais foram combinados para cada animal, resultando em um total de 4 linfonodos para cada amostra. Em geral, os números de células em baço, medula óssea e linfonodos de um animal são suficientes para realizar a análise de fluxo e o protocolo pode ser aplicado. No entanto, ao usar tecidos de apenas um tempo de lise animal pode precisar ser ajustado.

1. O baço
   1. Coloque os dois baços agrupados em um coador de células de 70 μm em cima de um tubo de 15 mL. Macerar suavemente o baço através do filtro de malha usando um êmbolo de seringa estéril de 3 mL. Lave o coador com frequência com um total de 6 mL de RPMI 1640 médio suplementado com 10% de FBS.
   2. Gire as células (500 x g, 5 min, RT) e resuspense a pelota em 5 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC). Incubar por 5 min no RT e parar a reação diluindo o tampão de lise com 10 mL de PBS. Gire as células (500 x g, 5 min, RT) e repita esta etapa uma vez ou até que não haja mais RBC na pelota.
      NOTA: Refilter a suspensão usando um coador de células de 30 μm em um novo tubo de 15 mL entre as duas rodadas de lise para remover células coaguladas.
   3. Após a lise completa, gire as células (500 x g, 5 min, RT), descarte a supernascedora e a pelota resuspendida em 1 mL de PBS. Conte o número de células vivas em um hemótmetro usando a exclusão azul trypan.
2. Os linfonodos
   1. Coloque os quatro linfonodos agrupados em um coador de células de 70 μm em cima de um tubo de 15 mL. Provoque suavemente os linfonodos em uma única suspensão celular pressionando com um êmbolo de seringa estéril de 3 mL. Lave o coador com frequência com um total de 6 mL de RPMI com 10% de FBS.
   2. Gire as células (500 x g, 5 min, RT), descarte o supernaspe e resuspense a pelota em 500 μL de PBS. Refilter a suspensão usando um coador de células de 30 μm em um novo tubo de 15 mL para remover células coaguladas. Conte o número de células vivas em um hemótmetro usando a exclusão azul trypan.
3. A medula óssea
   1. Segure cuidadosamente o fêmur intacto usando um fórceps de tecido sem fraturá-lo. Corte a extremidade do fêmur proximal com uma tesoura afiada, a fim de facilitar a lavagem do osso. Vire o fêmur e posicione uma agulha de 23 G no meio do entalhe intercondílar do fêmur. Ao mesmo tempo em que aplica pressão suave gire a agulha entre o polegar e o dedo indicador, a fim de fazer um furo no entalhe intercondilar para entrar na cavidade óssea.
      NOTA: Às vezes, partículas do osso podem obstruir a agulha após a perfuração do orifício, para evitar uma pressão alta desnecessária durante a descarga de uma troca de agulha antes que a descarga seja recomendada.
   2. Lave o osso com 6 mL de RPMI com 10% de FBS (ou até que a descarga fique branca) usando uma seringa de 10 mL com uma agulha de 23 G em um coador de células de 70 μm que é colocado em um tubo de 15 mL. Pressione suavemente a medula óssea através do coador celular com um êmbolo de uma seringa de 3 mL e enxágue o coador com mais 3 mL de RPMI.
      NOTA: Os ossos devem parecer brancos uma vez que toda a medula tenha sido completamente lavada.
   3. Gire as células (500 x g, 5 min, RT) e resuspense a pelota em 5 mL de tampão de lise RBC. Incubar por 5 min no RT e parar a reação diluindo o tampão de lise com 10 mL de PBS.
   4. Gire as células (500 x g, 5 min, RT), descarte o supernaspe e resuspense a pelota em 1 mL de PBS. Refilter a suspensão usando um coador de células de 30 μm em um novo tubo de 15 mL para remover células coaguladas. Conte o número de células vivas em um hemótmetro usando a exclusão azul trypan.
4. O tecido sinovial
   1. Pique os dois blocos de tecido sinovial em pequenos pedaços com uma tesoura cirúrgica fina. Transfira as amostras com meio para um tubo de 15 mL. Enxágüe o poço antigo com 0,5 mL adicional de RPMI para obter células remanescentes e tecidos sinoviais, transfira para tubo falcão (volume final de 2 mL).
      DICA: Use uma pipeta de transferência e corte da ponta onde o diâmetro se expande nesta etapa.
   2. Enzima reconstituída e alíquota de acordo com as instruções do fabricante (por exemplo, Liberase). Adicione enzima suficiente para resultar em uma concentração final de 1 Unidade/mL (um total de 2 Unidades por amostra). Digerir a 37 °C por 2 h usando um rotador MACS.
   3. Pare a digestão adicionando 8 mL de RPMI com 10% de FBS e suspensão de células filtrante através de um coador de células de 70 μm em um novo tubo de 15 mL. Enxágüe o antigo tubo de 15 mL com outros 5 mL de RPMI com suspensão de células médias e filtros 10% FCS através do mesmo coador de células no novo tubo (volume final de 15 mL).
   4. Gire as células (500 x g, 10 min, RT), descarte o supernaspe e resuspenque a pelota em 500 μL de PBS. Conte o número de células vivas em um hemótmetro usando a exclusão azul trypan.

3. Alocação de células

1. Rotule duas placas de 96 poços (forma inferior u) com tipo de tecido, identificação animal e o painel de anticorpos designado. Um total de dois painéis de anticorpos são usados neste protocolo: painel de subconjunto monocito (coloração extracelular) e painel de subconjunto de células T (coloração extra e intracelular).
2. Forneça 5 x 10⁵ células por poço usando as respectivas suspensões de célula única.
   NOTA: Ao configurar o experimento, avalie o número absoluto de células esperadas por grupo e tipo de tecido (animais tratados têm maior contagem de células em tecidos do que animais de controle). Ao reutilizar a pelota celular durante a última etapa de geração de suspensões de célula única, escolha uma quantidade apropriada de PBS para acabar com uma concentração de 5 x 10⁵ por 200 μL. A placa de 96 poços utilizada aqui pode conter um máximo de 300 μL e, tipicamente, 200 μL é ideal para minimizar o risco de contaminação cruzada devido ao derramamento.
3. Para cada painel e tipo de tecido, distribua pelo menos 5 x 10⁵ células como controles não manchados em poços que foram claramente marcados.

4. Painel de subconjunto monócito

1. Realizar a coloração de viabilidade: Células de giro (500 x g,5 min, 4 °C) usando um rotador de placa e lavar as células uma vez com 200 μL de 1x PBS. Prepare uma solução de estoque de corante amina-reativa (mancha de viabilidade) diluída 1:50 em 1x PBS. Posteriormente, resuspenco as pelotas de célula com 100 μL desta solução de estoque resultando em um volume absoluto de 2 μL de mancha de viabilidade por poço. Incubar por 15 min a 4 °C protegido da luz.
   NOTA: A quantidade ideal de mancha de viabilidade necessária deve ser determinada realizando uma curva de titulação de dose. Além disso, a solução diluída de estoque de manchas de viabilidade deve ser usada em um único dia e não ser armazenada. Consulte as instruções do fabricante para obter mais informações sobre como reconstituir, diluir e armazenar a mancha de viabilidade.
2. Durante a incubação, prepare o coquetel de anticorpos em um volume apropriado de tampão FACS (PBS livre Ca2+ e Mg+ contendo 0,1%BSA e 0,02% de azida de sódio). Lave as células duas vezes com 200 μL de tampão FACS, centrífuga (500 x g, 5 min, 4 °C) e resuspenda cada pelota com 100 μL da mistura de anticorpos ou mistura de controle apropriada. Incubar por 30 min a 4 °C protegido da luz.
   NOTA: Por favor, esteja ciente de que o azida de sódio é tóxico para as células. No protocolo atual, a concentração de azida de sódio no tampão de fluxo é muito baixa (0,02%) e as amostras são executadas imediatamente após a coloração, não causando nenhum problema. Se forem planejados ensaios funcionais a jusante de células classificadas, pode ser benéfico fazer um novo buffer FACS a cada dia de experimentos e não usar qualquer azida de sódio. Ao usar uma infinidade de anticorpos, é aconselhável adicionar uma quantidade apropriada de "Tampão de Mancha Brilhante" ao coquetel de anticorpos para melhorar os resultados.
3. Lave as células duas vezes com 200 μL de tampão FACS e resuspenja as células em 250 μL de tampão FACS + EDTA (tampão FACS contendo 1 mM EDTA). Transfira amostras para tubos FACS rotulados. Mantenha as amostras a 4 °C e protegia da luz até a aquisição.
   NOTA: As células imunes tendem a ser pegajosas. Para minimizar tanto o risco de bloqueio quanto o número de doublets, recomenda-se adicionar 1 mM EDTA ao buffer de fluxo final.

5. Painel de subconjunto de células T

1. Realizar a coloração de viabilidade: Células de giro (500 x g,5 min, 4 °C) usando um rotador de placa e lavar as células uma vez com 200 μL de 1x PBS. Prepare uma solução de estoque de corante amina-reativa (mancha de viabilidade) diluída 1:50 em 1x PBS. Posteriormente, resuspenco as pelotas de célula com 100 μL desta solução de estoque resultando em um volume absoluto de 2 μL de mancha de viabilidade por poço. Incubar por 15 min a 4 °C protegido da luz.
2. Enquanto incuba as amostras, prepare o coquetel de anticorpos de coloração extracelular em um volume apropriado de 1x tampão FACS. Lave as células duas vezes com 200 μL de tampão FACS 1x, gire-as para baixo (500 x g, 5 min, 4 °C) e resuspenda cada pelota com 100 μL da mistura de anticorpos ou mistura de controle apropriada. Incubar por 30 min a 4 °C protegido da luz.
3. Realize a coloração intracelular com um kit de fixação e permeabilização seguindo as instruções do fabricante. Lave as células duas vezes com 200 μL de 1x tampão FACS e resuspend em 200 μL de buffer de fixação. Incubar por 40 min a 4 °C protegido da luz.
4. Durante a incubação, prepare o coquetel de anticorpos (coloração intracelular) em um volume apropriado de permeabilização de 1x e tampão de lavagem. Coletar células girando (750 x g, 5 min, 4 °C) e lavar células duas vezes com 200 μL de 1x porm/tampão de lavagem.
   NOTA: A fixação e a permeabilização resultam em células que tendem a ser um pouco mais difíceis de dotizar adequadamente. Para minimizar a perda celular durante as etapas de lavagem subsequentes, aumente a força centrífuga para 750 x g. Alternativamente, um ciclo de fiação mais longo também poderia ser aplicado. No entanto, isso resultaria em um tempo consideravelmente maior que é necessário para preparar as células.
5. Gire células (750 x g, 5 min, 4 °C) e resuspende cada pelota com 100 μL da mistura de anticorpos ou mistura de controle apropriada. Incubar por 40 min a 4 °C protegido da luz.
6. Lave as células duas vezes com 200 μL de 1x porm/wash buffer e resuspense as células em 250 μL de tampão FACS + EDTA. Transfira amostras para tubos FACS rotulados. Mantenha as amostras a 4 °C e protegia da luz até a aquisição.
   NOTA: Para cada anticorpo, a concentração ideal precisa ser determinada realizando uma curva de titulação de dose. A concentração entre anticorpos pode diferir drasticamente: CD3 e CD80 foram utilizados com fator de diluição de 1:1, enquanto CD11b e CD4 foram utilizados com fator de diluição de 1:6400. Ao titular a concentração de anticorpos use o mesmo número de células que serão usadas durante os experimentos.

6. Compensação, controles apropriados e gating

1. Configurando o experimento
   1. Uma vez determinada a concentração ideal de anticorpos, executa controles manchados e únicos para compensação para ajustar para sobreposição espectral.
      NOTA: Execute todos os controles de compensação com células e contas de compensação. Use o que gerar os resultados mais brilhantes (o mais alto MFI de eventos positivos) para compensação. MFI significa intensidade média de fluorescência e é frequentemente usado para descrever e definir a intensidade média do sinal gerado e, portanto, nível de expressão de anticorpos.
   2. Execute controles de fluorescência menos um (FMO) e controles isótipos ao iniciar um novo experimento multicolor. Mais detalhes sobre o FMO foram publicados anteriormente¹⁹.
   3. Determine a tensão ideal da Área de Dispersão Para a Frente (FSC-A) e a tensão da Área de Dispersão Lateral (SSC-A) para detectar a população de leucócitos em controles não manchados de cada tipo de tecido.
      NOTA: O processo de fixação e permeabilização altera as dimensões da célula. Assim, as tensões FSC-A e SSC-A para o painel de subconjunto monocito e o painel de subconjunto de células T diferem consideravelmente. Para encontrar as tensões ideais para o Painel de Subconjunto de Células T, use células que foram manchadas com CD3 e portão traseiro em direção às populações leucócitos enquanto ajusta os valores FSC-A e SSC-A.
2. Estratégia gating
   1. Uma vez determinada a tensão ideal de FSC-A e SSC-A, configure um portão primário na população de leucócitos.
      NOTA: Antes de cada experimento calibrar o citómetro usando contas de calibração de acordo com as instruções do fabricante e executar contas não manchadas. Populações leucócitos de diferentes pontos de tempo devem ter propriedades comparáveis de FSC e SSC (pequenas diferenças entre os tipos de tecido são esperadas e normais). Se FSC e SSC variam problemas consideráveis, atire no citômetro e na geração de amostras.
   2. Exclua os duplos: Plot FSC-A (eixo y) e FSC-H (eixo x). Singlets aparecem como uma diagonal desta trama. Portão em singlets.
   3. Exclua célula morta: Plot FVS510 (mancha de viabilidade) (eixo x) e FSC-A (eixo y). Células mortas aparecerão como eventos positivos, assim portão em células vivas.
      NOTA: As verdadeiras células negativas serão visíveis em controles não manchados. Assim, ajuste este portão para cada conjunto de amostras ao executar os controles não manchados antes de amostras manchadas. Mais gating depende do painel de anticorpos e do tipo celular que é investigado. As estratégias de gating para cada painel utilizado neste protocolo podem ser encontradas na Figura 1 e Figura 4, respectivamente.

Resultados

Os resultados representativos do painel de subconjunto de monócito e do painel de subconjunto de células T são descritos abaixo.

A Figura 1 ilustra a estratégia hierárquica de gating para o painel de subconjunto de monócitos em células imunes recolhidas da medula óssea de animais tratados com DMM. A mesma estratégia foi utilizada e verificada em todos os outros tipos de tecidos. Ao configurar o experimento, a tensão de Área de Dispersão Para a Frente (...

Discussão

Os métodos descritos neste protocolo foram projetados e testados para identificar de forma confiável vários subconjuntos de monócitos/macrófagos e células T dentro do baço de murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial em um modelo de murina de osteoartrite (OA). O protocolo atual pode ser facilmente modificado para investigar diferentes tipos de tecidos, ou outros tipos de células, trocando anticorpos, e pode ser usado para modelos murinos alternativos de OA. Ao testar outros tipos de tecidos, é fundame...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC anti-mouse CD194 (CCR4)	BioLegend	131212	T-Cell Panel
Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst	BD	566385	Buffers
Fixable Viability Stain 510, 100 µg	BD	564406	T-Cell Panel
Fixable Viability Stain 510, 100 µg	BD	564406	Monocyte Panel
Liberase, Research Grade	Roche	5401127001	Enzyme for synovial tissue
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg	BD	564985	Monocyte Panel
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg	BD	562454	Monocyte Panel
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg	BD	742274	T-Cell Panel
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg	BD	565250	Monocyte Panel
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg	BD	563061	T-Cell Panel
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg	BD	557596	T-Cell Panel
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg	BD	552775	T-Cell Panel
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg	BD	565480	T-Cell Panel
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg	BD	565261	T-Cell Panel
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg	BD	740664	T-Cell Panel
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg	BD	563687	Monocyte Panel
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg	BD	563332	T-Cell Panel
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg	BD	565411	Monocyte Panel
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg	BD	560408	T-Cell Panel
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg	BD	563414	Monocyte Panel
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg	BD	560593	Monocyte Panel
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg	BD	560600	Monocyte Panel
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg	BD	564143	T-Cell Panel
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg	BD	562894	T-Cell Panel
Red Blood Cell Lysing Buffer	N/A	N/A	Buffers	Description in: Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow / Xiaoyu Liu and Ning Quan/ Bio Protoc. 2015 October 20; 5(20): .
Transcription Factor Buffer Set 100Tst	BD	562574	Buffers