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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In diesem Protokoll wurde ein Verfahren zum Gen-Mining und zur Sequenzanalyse von Purin-Nukleosidase (PN, EC:3.2.2.1) auf Basis von RNA-Seq beschrieben. Die ProtProm-Analyse wurde angewendet, um die einzigartigen Sekundär- und Tertiärstrukturen von PN zu zeigen. Darüber hinaus wurde das PN-Gen aus dem Transkriptom kloniert, um die Zuverlässigkeit der RNA-Seq-Ergebnisse zu überprüfen.

Zusammenfassung

Der Raupenpilz (Ophiocordyceps sinensis) ist eine der am meisten geschätzten Pilze der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) und enthält viele Wirkstoffe wie Adenosin. Adenosin gilt als biologisch wirksamer Inhaltsstoff, der eine Vielzahl von antitumoralen und immunmodulatorischen Aktivitäten hat. Um den Mechanismus der Purinnukleosidase (PN) bei der Adenosinbiosynthese weiter aufzuklären, wurde erfolgreich ein für PN kodierendes Gen abgebaut und auf der Grundlage der RNA-Seq-Datenbank des Raupenpilzes weiter analysiert. Die cDNA von PN in voller Länge betrug 855 bp, was 284 Aminosäuren kodierte. Die BLAST-Analyse zeigte die höchste Homologie von 85,06 % mit Nukleosidhydrolase in NCBI. Die ProtProm-Analyse zeigte, dass das relative Molekulargewicht 30,69 kDa und der isoelektrische Punkt 11,55 kDa betrug. Die Sekundärstruktur von PN wurde durch Predict Protein vorhergesagt; Die Ergebnisse zeigten, dass die Alpha-Helix-Struktur 28,17 %, die Strangstruktur 11,97 % und die Schleifenstruktur 59,86 % ausmachte. Darüber hinaus wurde das PN-Gen weiter aus dem Transkriptom kloniert und zur Verifizierung durch Agarose-Gelelektrophorese nachgewiesen. Diese Studie liefert eine ausreichendere wissenschaftliche Grundlage und neue Ideen für die genetische Regulation der Adenosin-Biosynthese in der Pilz-TCM.

Einleitung

Pilz Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) verfügt über reichhaltige Artenressourcen 1,2. Der Raupenpilz (Ophiocordyceps sinensis) ist ein bekanntes Pilz-TCM und gilt als Quelle für innovative Medikamente 3,4. Der Raupenpilz ist eine Mischung aus Wurm und Pilz, die auf dem tibetischen Hochland im Südwesten Chinas vorkommt, wo Hirsutella sinensis am Raupenkörper parasitiertist 5. Derzeit wird H. sinensis als einziger Anamorph des Raupenpilzes gemäß molekular- und morphologischen Erkenntnissen berichtet 6,7 und weist im Vergleich zum wilden Raupenpilz eine geringere Toxizität und eine ähnliche klinische Wirksamkeit auf8. Es wurde festgestellt, dass H. sinensis eine Vielzahl biologisch wirksamer Inhaltsstoffe wie Nukleoside, Polysaccharide und Ergosterole besitzt, mit umfangreichen pharmakologischen Wirkungen, wie z. B. der Reparatur einer Leberschädigung 9,10,11. Adenosin ist ein typischer Wirkstoff, der aus dem Raupenpilz isoliert wird, und es ist eine Art Purinalkaloid12. Adenosin hat eine Vielzahl biologischer Aktivitäten: antitumorale, antibakterielle und immunmodulatorische Aktivitäten13,14. Leider ist der Biosynthesemechanismus von Adenosin sowie die beteiligten Schlüsselgene noch unklar15,16.

Adenosin zeigt seine antitumorale Wirkung vor allem durch immunsuppressive Wirkungen in der Tumormikroumgebung17. Es wurde berichtet, dass Adenosin immunsuppressive Funktionen zeigte, die entscheidend waren, um die Gewebereparatur nach einer Verletzung einzuleiten und das Gewebe vor übermäßigen Entzündungen zu schützen18,19. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass eine Adenosin-vermittelte Repression der Immunität die Immunüberwachung von Krebs stark beeinträchtigen und das Tumorwachstum fördern kann20. Daher ist es dringend erforderlich, den Mechanismus der Adenosinbiosynthese für seine breite Anwendung im Antitumorbereich zu untersuchen.

Es wurde berichtet, dass eine vollständige Sicht auf die exprimierten Gene und ihre Expressionsniveaus durch Next-Generation-Sequencing des Transkriptoms21 systematisch durchgeführt werden kann. Darüber hinaus wurde die Transkriptomsequenzierung und -analyse angewendet, um die Gene vorherzusagen, die am Biosyntheseweg der Wirkstoffe beteiligt sind, und um das Zusammenspiel verschiedener Biosynthesewege weiter zu untersuchen22. Purinnukleosidase (PN, EC 3.2.2.1) ist eine Klasse von Nukleosidasen mit Substratspezifität für Purinnukleoside, die die Glykosidbindungen von Purinnukleosiden zu Zuckern und Basen hydrolysieren kann23. Es spielt typischerweise eine wichtige Rolle bei der Adenosinbiosynthese. Es wurde berichtet, dass der Biosyntheseweg von Adenosin in der Pilz-TCM vorhergesagt wurde; qPCR und Genexpression zeigten, dass die erhöhte Adenosinakkumulation ein Ergebnis der Herunterregulierung des PN-Gens ist, was darauf hindeutet, dass das PN-Gen eine wichtige Rolle bei der Adenosinbiosynthese spielenkönnte 15. Daher muss der Mechanismus von PN bei der Adenosinbiosynthese dringend geklärt werden. Die Sequenzinformation und die Proteinstruktur von PN sowie anderen Schlüsselgenen, die an der Adenosinbiosynthese der Pilz-TCM beteiligt sind, wurden jedoch nicht weiter untersucht.

In dieser Studie wurde eine neue Sequenz des PN-Gens aus RNA-Seq-Daten von Raupenpilzen gewonnen und durch Genklonierung verifiziert. Darüber hinaus wurden die molekularen Eigenschaften und die Proteinstruktur von PN umfassend analysiert, was neue Richtungen und Ideen für die Genregulation der Adenosinbiosynthese liefern könnte.

Protokoll

HINWEIS: In unserem Labor wurde ein Anamorphstamm des Raupenpilzes (H. sinensis) deponiert. Escherichia Coli DH5 wurden vom Shenzhen Hospital der Beijing University of Chinese Medicine konserviert.

1. Vorbereitung auf RNA-Seq

  1. Ernte von Myzelien
    1. Bereiten Sie das Fermentationsmedium für die Fermentation von H. sinensis vor: Maismehlpulver (1%), Seidenraupenpuppen (1,5%), Hefeextrakt (0,5%), Trypton (1%), Glukose (1,5%), Kleie (1,5%), Dextrin (0,5%),KH2PO4 (0,02%) und MgSO4 (0,01%).
    2. Bereiten Sie die Inokulation mit 10 % Fermentationsmedium für die Scale-up-Kultur vor (fügen Sie 10 ml Medium pro 100 ml Medium hinzu). Die Unterwassergärung bei 16 °C auf einem Rotationsschüttler bei 150 U/min für 10 Tage durchführen.
    3. Vermehren und ernten Sie 10 Tage lang Myzelien des Anamorphs des Raupenpilzes. Das fermentierte Medium wird zentrifugiert und der Überstand wird nach der Zentrifugation verworfen. Suspendieren Sie das Myzel, indem Sie 3-mal 100 ml Reinstwasser hinzufügen und den Überstand durch Zentrifugation entfernen. Mahlen Sie das gereinigte Myzel mit flüssigem Stickstoff zu einem Pulver.
  2. RNA-Seq
    1. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA des Anamorphs des Raupenpilzes gemäß den Protokollen des Herstellers (Table of Materials) und behandeln Sie die Probe weiter mit RNase-freier DNase I (Table of Materials).
    2. Isolieren Sie die mRNA aus Gesamt-RNA-PolyATtract-mRNA-Isolationssystemen und isolieren Sie Poly(A)-mRNA mit Kügelchen mit Oligo(dT) gemäß den Protokollen des Herstellers (Materialtabelle).
    3. Nehmen Sie die kurzen Fragmente als Matrizen für die Synthese der Erststrang-cDNA durch zufällige Hexamer-Primer gemäß den Protokollen des Herstellers (Table of Materials). Führen Sie die Synthese der Zweitstrang-cDNA gemäß den Protokollen des Herstellers durch.
    4. Generieren Sie anschließend die Sequenzierungsbibliotheken mit dem Ultra RNA Library Prep Kit gemäß den Protokollen des Herstellers (Table of Materials).
    5. Reinigen Sie kurze Fragmente mit einem PCR-Extraktionskit gemäß den Protokollen des Herstellers (Table of Materials) und lösen Sie sie mit EB-Puffer auf.
    6. Verbinden Sie die kurzen Fragmente (Schwelle von 300 bp) mit Sequenzieradaptern entsprechend dem Ergebnis der Agarose-Gelelektrophorese.
    7. Führen Sie anschließend eine Amplifikation mit PCR unter Verwendung der aus geeigneten Fragmenten ausgewählten Templates durch.
    8. Sequenzieren Sie die Bibliothek mit dem Illumina HiSeq 4000 mit Paired-End-Sequenzierung gemäß den Protokollen des Herstellers. Filtern Sie fehlerhafte Rohlesevorgänge aus den Rohsequenzdaten, um saubere Daten zu erhalten. Nehmen Sie die Denovo-Assemblierung an, um Unigenes mit den geringsten Ns zu erhalten, die an keinem der beiden Enden verlängert werden können.
    9. Richten Sie Unigene-Sequenzen von blastx an Proteindatenbanken wie nr, Swiss-Prot, KEGG und COG (e-Wert < 0,00001) aus. Abrufen von Proteinen mit der höchsten Sequenzähnlichkeit mit den gegebenen Unigenen zusammen mit ihren funktionellen Proteinannotationen. Fassen Sie die RNA-Seq-Ergebnisse zusammen (Table of Materials).
      HINWEIS: In den obigen Schritten wurden kommerzielle Kits verwendet, und alle Vorgänge wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.

2. Gen-Mining von Purin-Nukleosidase

  1. Laden Sie die Dateien mit den RNA-Seq-Ergebnissen auf den Computer herunter. Suchen Sie die Annotationsergebnisdateien von assemblierten Unigenes aus den RNA-Seq-Ergebnissen.
    HINWEIS: Paired-End-Lesevorgänge wurden erneut zum Füllen von Lücken von Gerüsten verwendet, um Sequenzen mit dem geringsten Ns zu erhalten, die an keinem der beiden Enden verlängert werden können. Solche Sequenzen wurden als Unigene definiert. Die Unigene Annotation liefert Informationen über die Expression und die funktionelle Annotation von Unigene.
  2. Öffnen Sie den Pfad für die Anmerkungsdateien , und geben Sie die Karte 00230 in die Suchleiste ein. Suchen Sie dann nach Purinstoffwechsel (map00230) in der KEGG-Klassifikation von Annotationsdateien.
  3. Markieren Sie EC:3.2.2.1 (PN) rot in der annotierten Map00230 und geben Sie an, dass es assemblierte Unigenes gab, die mit PN annotiert wurden.
    HINWEIS: Es wurden drei Unigene (Unigene10777, Unigene14697 und Unigene17827) mit PN annotiert, nachdem sie auf die EC-Nummer 3.2.2.1 geklickt und in der annotierten map00230 angezeigt wurden.
  4. Klicken Sie auf die EC-Nummer 3.2.2.1 und zeigen Sie die annotierten Unigenes-Informationen an.
  5. Öffnen Sie die LTFViewer-Software und importieren Sie die Datei Unigene.fa mit einer Tastenkombination Strg-O und zeigen Sie die Sequenzinformationen der assemblierten Unigenes an.
  6. Suchen Sie mit der Tastenkombination Strg-F nach Sequenzinformationen von Unigene10777, Unigene14697 und Unigene17827.
  7. Laden Sie die Sequenzinformationen von Unigene10777, Unigene14697 und Unigene17827 mit den Tastenkombinationen Strg-C und Strg-V herunter.
  8. Eliminierung von Unigene10777 und Unigene17827 mit übermäßig kurzen Sequenzen des Open Reading Frame (ORF).
    HINWEIS: Grundlegende Sequenzinformationen wurden in der LTFViewer-Software angezeigt.
  9. Wählen Sie Unigene14697 (Größe 1.705 bp, Lücke 0 0%) mit geeigneter ORF-Länge für weitere Untersuchungen.

3. Bioinformatische Analyse

  1. Analysieren Sie den ORF des PN-Gens mit ORFfinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/).
    1. Fügen Sie die Sequenz in das Feld ein. Wählen Sie die Parameter wie folgt: minimale ORF-Länge (nt): 75, genetischer Code: 1. Standard, zu verwendendes ORF-Startcodon: nur ATG. Klicken Sie auf den Button Senden , um die ORF-Informationen zu erhalten.
  2. Verwenden Sie das ProtParam-Werkzeug (http://us.expasy.org/tools/protparam.html), um die theoretische Molekülmasse und den isoelektrischen Punkt zu berechnen.
    1. Fügen Sie die Aminosäuresequenz (in einem Ein-Buchstaben-Code) in das Feld ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Parameter berechnen , um die Ergebnisse zu erhalten.
  3. Wenden Sie SignalP5.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) an, um die Signalpeptide vorherzusagen.
    1. Geben Sie Proteinsequenzen im FASTA-Format ein. Wählen Sie die Parameter wie folgt aus, Organismusgruppe: Eukarya, Ausgabeformat: Lange Ausgabe. Klicken Sie auf die Schaltfläche Senden , um die Ergebnisse zu erhalten.
  4. Wenden Sie BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) an, um die Homologie von Proteinsequenzen zu analysieren.
    1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Protein Blast und geben Sie die Sequenz in das Feld ein. Wählen Sie die Parameter wie folgt, Datenbank: Nicht redundante Proteinsequenzen (nr), Algorithmus: blastp (Protein-Protein BLAST). Klicken Sie auf die Schaltfläche Blast , um die Ergebnisse zu erhalten.
  5. Wenden Sie das Clustal X-Programm (http://www.clustal.org/) an, um die Säuresequenzen von PN aus verschiedenen Pilzen auszurichten.
    1. Laden Sie eine Datei hoch oder fügen Sie die Sequenzen in das Feld ein. Stellen Sie die Parameter wie folgt ein, Ausgabeformat: ClustalW mit Zeichenanzahl. Klicken Sie auf die Schaltfläche Senden , um die Ergebnisse zu erhalten. Clustal X kann nur Dateien im FASTA-Format erkennen, und der Pfad der Dateien darf nur englische Namen enthalten.
  6. Verwenden Sie MEGA 4.0 (https://www.megasoftware.net/mega4/), um den phylogenetischen Baum durchzuführen.
    1. Öffnen Sie die Software und klicken Sie auf die Schaltfläche Datei , um die Sequenzen hochzuladen. Wählen Sie den Datentyp als Proteinsequenzen aus und klicken Sie auf die Schaltfläche OK , um mit dem nächsten Schritt fortzufahren. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Phylogenie , wählen Sie Bootstrap Test Phylogenie aus, und klicken Sie dann auf Neighbor Joining Tree. Wählen Sie die Standardparameter aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Berechnen , um die Ergebnisse zu erhalten.
  7. Wenden Sie InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/) an, um die katalytische Domäne von PN zu identifizieren.
    1. Geben Sie die Sequenz in das Feld ein. Wählen Sie die Standardparameter aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Suchen , um die Ergebnisse zu erhalten.
  8. Wenden Sie Predict Protein (http://www.predictprotein.org/) online an, um die Sekundärstruktur des Proteins vorherzusagen.
    1. Geben Sie eine Aminosäuresequenz (einen Buchstabencode) in das Feld ein und klicken Sie dann auf die Schaltfläche predictProtein , um die Ergebnisse zu erhalten.
  9. Wenden Sie die Online-Tools SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/) an, um die dreidimensionale Struktur von PN24 zu evaluieren.
    1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Modellierung starten und fügen Sie die Zielsequenz in das Feld ein. Geben Sie den Projekttitel und die E-Mail-Informationen ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Nach Vorlagen suchen , um die Ergebnisse zu erhalten.

4. Genklonierung und Konstruktion von rekombinanten Plasmiden

  1. Design-Primer, deren umgekehrter Primer eine Nicht-I-Stelle und der vordere Primer eine EcoRI-Stelle enthielt.
  2. Zeigen Sie den vorderen Primer als: AGAGAATTCATGACCATGCCAGATTCT (5'–3') und den umgekehrten Primer als: ATAGCGGCCGCCTAACGCGTGCCGTTAGA (5'–3') von Primer Express.
  3. Bereiten Sie die Primer sowie die cDNA des Raupenpilzes für die Klonierung des PN-Gens vor. Die PCR wird wie folgt durchgeführt: Vordenaturierung bei 95 °C für 5 min, Denaturierung bei 94 °C für 45 s, Renaturierung bei 55 °C für 60 s, Verlängerung bei 72 °C für 90 s, Wiederholung für 35 Zyklen und Verlängerung bei 72 °C für 10 min.
  4. Erwerben Sie die PCR-Fragmente und weisen Sie sie zur Verifizierung durch Agarose-Gelelektrophorese nach. Lilizieren Sie die PCR-Fragmente mit pMD18-T. Führen Sie das Ligationssystem von PMD18-T wie folgt durch: 1 μl PMD18-T, 4 μl Lösung1 und 5 μl Zielgen. Stellen Sie die Bedingungen wie folgt ein: 16 Stunden lang bei 16 °C halten, 15 Minuten lang bei 65 °C deaktivieren.
  5. Die rekombinanten Plasmide gemäß der Bedienungsanleitung25 auf die zuständigen E. coli JM109-Zellen übertragen.
  6. Verdau der rekombinanten pMD18-T/PN-Plasmide und des Vektors ppic9K mit EcoRI und NotI. Ligate der Fragmente nach dem Verdau durch T4-DNA-Ligase.
  7. Konstruieren Sie das rekombinante Plasmid ppic9K/PN für die weitere heterologe Expression.

Ergebnisse

Die ORF-Sequenz des PN-Gens war 855 bp lang, die 284 Aminosäuren mit einer berechneten Molekülmasse von 30,69 kDa und einem vorhergesagten isoelektrischen Punkt von 11,55 kodierte, was darauf hindeutet, dass PN ein alkalisches Protein ist. Die Anwendung des SignalP4.0 Servers wurde durchgeführt, um Signalpeptide zu identifizieren, und die Ergebnisse zeigten, dass PN keine Signalpeptide enthält. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse der BLASTP-Suche, dass PN aus dem Raupenp...

Diskussion

Die menschliche Gesundheit steht vor einer Reihe schwerwiegender medizinischer Probleme wie Tumor-, Herz-Kreislauf- und zerebrovaskulären Erkrankungen26,27. Die TCM gilt aufgrund ihrer reichen Artenressourcen und ihrer vielfältigen Struktur und Funktionen der Wirkstoffe als Quelle der Forschung und Entwicklung innovativer Medizin28,29. Der Raupenpilz ist ein Pilzparasit...

Offenlegungen

Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten.

Danksagungen

Diese Studie wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (31871244, 81973733, 81803652), der Natural Science Foundation der Provinz Guangdong (2019A1515011555, 2018A0303100007), der Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZBC2018016), dem Sonderfonds für wirtschaftliche und technologische Entwicklung des Longgang District der Stadt Shenzhen (LGKCYLWS2020064, LGKCYLWS2019000361).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
RNase-free DNase ITaKaRa2270B
PolyATtract mRNA Isolation SystemsPromegaIII
Random hexamer-primersThermo ScientificSO142
NEBNext1 Ultra RNA Library Prep KitNEBE7530S
PCR extraction kitQiaQuick
AgaroseTransGen BiotechGS201-01
High-throughput sequencerIlluminaHiSeq™ 4,000
LTF ViewerLTFV5.2
ORF programNCBI
ProtParam toolSIB Swiss Institute of Bioinformatics
SignalP ServerDTU Health Tech5.0
BLASTNCBI
Clustal X programUCD Dublin
MEGACenter for Evolutionary Medicine and Informatics4.0
InterProScanEuropean Molecular Biology Laboratory
Predict ProteinTechnical University of Munich
WISS-MODELSwiss Institute of Bioinformatics
Primer ExpressApplied Biosystems3.0
EcoRINEBR0101V
NotINEBER0591
pMD18-T VectorTaKaRa6011
agaroseSigma-AldrichGS201-01
Trans2K® Plus II DNA MarkerSigma-AldrichBM121-01
6×DNA Loading BufferSigma-AldrichGH101-01
GelStainSigma-AldrichGS101-02
50 x TAESigma-AldrichT1060
Gel imaginganalysis systemSyngeneG:BOX F3
E. coli JM109Promega
T4 DNA ligaseEarthOxBE004A-02
pPIC9KGenlociGP0983

Referenzen

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