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Resumo

Neste protocolo, foi descrito um método para mineração gênica e análise de sequência de purina nucleosidase (PN, EC:3.2.2.1) baseado em RNA-Seq. A análise ProtProm foi aplicada para mostrar as estruturas secundárias e terciárias únicas da NP. Além disso, o gene PN foi clonado a partir do transcriptoma para verificar a confiabilidade dos resultados de RNA-Seq.

Resumo

O fungo da lagarta (Ophiocordyceps sinensis) é um dos fungos mais valorizados da medicina tradicional chinesa (MTC) e contém muitos ingredientes ativos, como a adenosina. A adenosina é considerada um ingrediente biologicamente eficaz que possui uma variedade de atividades antitumorais e imunomoduladoras. A fim de elucidar ainda mais o mecanismo da purina nucleosidase (PN) na biossíntese de adenosina, um gene que codifica PN foi minerado com sucesso e posteriormente analisado com base no banco de dados RNA-Seq do fungo da lagarta. O cDNA de comprimento total do PN foi de 855 pb, que codificou 284 aminoácidos. A análise BLAST mostrou a maior homologia de 85,06% com nucleosídeo hidrolase no NCBI. A análise ProtProm mostrou que o peso molecular relativo foi de 30,69 kDa e o ponto isoelétrico foi de 11,55. A estrutura secundária da NP foi predita pelo Predict Protein; Os resultados mostraram que a estrutura da hélice alfa foi responsável por 28,17%, a estrutura da fita foi responsável por 11,97% e a estrutura do loop foi responsável por 59,86%. Além disso, o gene PN foi posteriormente clonado a partir do transcriptoma e detectado por eletroforese em gel de agarose para verificação. Este estudo fornece base científica mais suficiente e novas ideias para a regulação genética da biossíntese de adenosina na MTC fúngica.

Introdução

A medicina tradicional chinesa fúngica (MTC) possui abundantes recursos de espécies 1,2. O fungo da lagarta (Ophiocordyceps sinensis) é um conhecido fungo da MTC e é considerado uma fonte de drogas inovadoras 3,4. O fungo da lagarta é uma mistura combinada de vermes e fungos encontrada no planalto tibetano no sudoeste da China, onde Hirsutella sinensis é parasita no corpo da lagarta5. Atualmente, H. sinensis é relatado como o único anamorfo do fungo da lagarta de acordo com evidências de biologia molecular e morfológica 6,7, e tem menos toxicidade associada e eficácia clínica semelhante em comparação com o fungo da lagarta selvagem8. Foi revelado que o H. sinensis possui uma variedade de ingredientes biologicamente eficazes, como nucleosídeos, polissacarídeos e ergosteróis, com extensos efeitos farmacológicos, como reparar uma lesão hepática 9,10,11. A adenosina é um ingrediente ativo típico isolado do fungo da lagarta e é um tipo de alcalóide purina12. A adenosina tem uma variedade de atividades biológicas: antitumoral, antibacteriana e imunomoduladora13,14. Infelizmente, o mecanismo biossintético da adenosina, bem como os principais genes envolvidos, ainda não estão claros 15,16.

A adenosina apresenta principalmente seu efeito antitumoral por meio de ações imunossupressoras no microambiente tumoral17. Foi relatado que a adenosina apresentava funções imunossupressoras, o que foi fundamental para iniciar o reparo tecidual após a lesão e para proteger os tecidos contra a inflamação excessiva18,19. Além disso, foi demonstrado que a repressão da imunidade mediada pela adenosina pode prejudicar gravemente a imunovigilância do câncer, bem como promover o crescimento do tumor20. Assim, é urgente estudar o mecanismo de biossíntese de adenosina para sua ampla aplicação em antitumorais.

Foi relatado que uma visão completa dos genes expressos e seus níveis de expressão poderia ser sistematicamente conduzida pelo sequenciamento de última geração do transcriptoma21. Além disso, o sequenciamento e a análise do transcriptoma foram aplicados para prever os genes envolvidos na via biossintética dos ingredientes ativos e investigar ainda mais a interação de diferentes vias biossintéticas22. A nucleosidase de purina (PN, EC 3.2.2.1) é uma classe de nucleosidase com especificidade de substrato para nucleosídeos de purina, que pode hidrolisar as ligações glicosídicas de nucleosídeos de purina em açúcares e bases23. Normalmente desempenha papéis importantes na biossíntese de adenosina. Foi relatado que a via biossintética da adenosina na MTC fúngica foi prevista; qPCR e expressão gênica mostraram que o aumento do acúmulo de adenosina é resultado da regulação negativa do gene PN , indicando que o gene PN pode desempenhar um papel importante na biossíntese de adenosina15. Portanto, o mecanismo da NP na biossíntese de adenosina deve ser urgentemente esclarecido. No entanto, as informações da sequência e a estrutura proteica da NP, bem como outros genes-chave envolvidos na biossíntese de adenosina da MTC fúngica, não foram mais estudadas.

Neste estudo, uma nova sequência do gene PN foi extraída de dados de RNA-Seq do fungo da lagarta e verificada por clonagem de genes. Além disso, as características moleculares e a estrutura proteica da NP foram analisadas de forma abrangente, o que poderia fornecer novas direções e ideias para a regulação gênica da biossíntese de adenosina.

Protocolo

NOTA: Uma cepa de anamorfo do fungo lagarta (H. sinensis) foi depositada em nosso laboratório. Escherichia coli DH5 foram preservados pelo Hospital de Shenzhen, Universidade de Medicina Chinesa de Pequim.

1. Preparando-se para RNA-Seq

  1. Colheita de micélios
    1. Preparar meio de fermentação para fermentação de H. sinensis: farinha de milho em pó (1%), pupas de bicho-da-seda (1,5%), extrato de levedura (0,5%), triptona (1%), glicose (1,5%), farelo (1,5%), dextrina (0,5%), KH2PO4 (0,02%) e MgSO4 (0,01%).
    2. Preparar a inoculação com 10% de meio de fermentação para cultura de aumento de escala (adicionar 10 ml de meio por 100 ml de meio). Realizar fermentação submersa na condição de 16 °C em um agitador rotativo a 150 rpm por 10 dias.
    3. Reproduza e colha assexuadamente micélios do anamorfo do fungo da lagarta por 10 dias. Centrifugar o meio fermentado e rejeitar o sobrenadante após centrifugação. Suspenda o micélio adicionando 100 mL de água ultrapura por 3 vezes e remova o sobrenadante por centrifugação. Moa os micélios limpos em pó usando nitrogênio líquido.
  2. RNA-Seq
    1. Extrair o RNA total do anamorfo do fungo da lagarta de acordo com os protocolos do fabricante (Tabela de Materiais) e posteriormente tratar a amostra com DNase I livre de RNase (Tabela de Materiais).
    2. Isole o mRNA dos sistemas de isolamento de mRNA de RNA total PolyATtract e isole o mRNA de poli(A) usando grânulos com oligo(dT) de acordo com os protocolos do fabricante (Tabela de Materiais).
    3. Tome os fragmentos curtos como modelos para sintetizar o cDNA da primeira fita por hexâmeros-primers aleatórios de acordo com os protocolos do fabricante (Tabela de Materiais). Realize a síntese do cDNA de segunda fita de acordo com os protocolos do fabricante.
    4. Posteriormente, gere as bibliotecas de sequenciamento utilizando o Ultra RNA Library Prep Kit de acordo com os protocolos do fabricante (Tabela de Materiais).
    5. Purificar fragmentos curtos por kit de extração por PCR de acordo com os protocolos do fabricante (Tabela de Materiais) e resolvê-los por tampão EB, respectivamente.
    6. Conecte os fragmentos curtos (limiar de 300 pb) com adaptadores de sequenciamento de acordo com o resultado da eletroforese em gel de agarose.
    7. Posteriormente, realize a amplificação com PCR usando os modelos selecionados a partir de fragmentos adequados.
    8. Sequencie a biblioteca por Illumina HiSeq 4000 com sequenciamento de extremidade emparelhada de acordo com os protocolos do fabricante. Filtre leituras brutas sujas dos dados brutos da sequência para obter dados limpos. Adote a montagem denovo para obter Unigenes com o mínimo de Ns que não pode ser estendido em nenhuma das extremidades.
    9. Alinhe sequências Unigene por blastx a bancos de dados de proteínas, como nr, Swiss-Prot, KEGG e COG (valor < 0,00001). Recupere proteínas com a maior similaridade de sequência com os Unigenes fornecidos, juntamente com suas anotações funcionais de proteínas. Resuma os resultados do RNA-Seq (Tabela de Materiais).
      NOTA: Kits comerciais foram usados nas etapas acima e todas as operações foram feitas de acordo com o protocolo do fabricante.

2. Mineração gênica da purina nucleosidase

  1. Baixe os arquivos de resultados de RNA-Seq no computador. Encontre os arquivos de resultados de anotação de Unigenes montados a partir dos resultados de RNA-Seq.
    NOTA: As leituras de extremidade emparelhada foram usadas novamente para preenchimento de lacunas de andaimes para obter sequências com menos Ns que não podem ser estendidas em nenhuma das extremidades. Tais sequências foram definidas como Unigenes. A anotação Unigene fornece informações de expressão e anotação funcional de Unigene.
  2. Abra o caminho Arquivos de anotação e digite o mapa 00230 na barra de pesquisa; em seguida, pesquise o metabolismo de purinas (map00230) na classificação KEGG de arquivos de anotação.
  3. Marque EC:3.2.2.1 (PN) em vermelho no mapa anotado 00230 e indique que havia Unigenes montados que foram anotados em PN.
    NOTA: Havia três Unigenes (Unigene10777, Unigene14697 e Unigene17827) anotados em PN após clicar no número EC 3.2.2.1 e mostrados no mapa anotado 00230.
  4. Clique no número EC 3.2.2.1 e mostre as informações anotadas do Unigenes.
  5. Abra o software LTFViewer e importe o arquivo Unigene.fa com um atalho Ctrl-O e mostre as informações de sequência dos Unigenes montados.
  6. Pesquise informações de sequência de Unigene10777, Unigene14697 e Unigene17827 com um atalho Ctrl-F .
  7. Baixe as informações de sequência de Unigene10777, Unigene14697 e Unigene17827 com os atalhos Ctrl-C e Ctrl-V.
  8. Elimine Unigene10777 e Unigene17827 com sequências excessivamente curtas de quadro de leitura aberto (ORF).
    NOTA: As informações básicas da sequência foram exibidas no software LTFViewer.
  9. Selecione Unigene14697 (tamanho 1.705 pb, lacuna 0 0%) com comprimento adequado de ORF para estudo posterior.

3. Análise bioinformática

  1. Analise a ORF do gene PN por ORFfinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/).
    1. Cole a sequência na caixa. Escolha os parâmetros da seguinte forma, comprimento mínimo de ORF (nt): 75, código genético: 1. padrão, códon de início de ORF a ser usado: somente ATG. Clique no botão Enviar para obter as informações do ORF.
  2. Use a ferramenta ProtParam (http://us.expasy.org/tools/protparam.html) para calcular a massa molecular teórica e o ponto isoelétrico.
    1. Cole a sequência de aminoácidos (em código de uma letra) na caixa e clique no botão Calcular parâmetros para obter os resultados.
  3. Aplique o SignalP5.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) para prever os peptídeos de sinal.
    1. Insira as sequências de proteínas no formato FASTA. Escolha os parâmetros da seguinte forma, grupo de organismos: Eukarya, formato de saída: Saída longa. Clique no botão Enviar para obter os resultados.
  4. Aplique BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para analisar a homologia das sequências de proteínas.
    1. Clique no botão Explosão de Proteína e insira a sequência na caixa. Escolha os parâmetros da seguinte forma, banco de dados: Sequências de proteínas não redundantes (nr), algoritmo: blastp (proteína-proteína BLAST). Clique no botão Explosão para obter os resultados.
  5. Aplicar o programa Clustal X (http://www.clustal.org/) para alinhar as sequências ácidas de NP de diferentes fungos.
    1. Carregue um arquivo ou cole as sequências na caixa. Defina os parâmetros da seguinte forma, formato de saída: ClustalW com contagens de caracteres. Clique no botão Enviar para obter os resultados. O Clustal X só pode reconhecer arquivos no formato FASTA, e o caminho dos arquivos só pode incluir nomes em inglês.
  6. Use o MEGA 4.0 (https://www.megasoftware.net/mega4/) para conduzir a árvore filogenética.
    1. Abra o software e clique no botão Arquivo para fazer upload das sequências. Selecione o tipo de dados como Sequências de proteínas, clique no botão OK para prosseguir para a próxima etapa. Em seguida, clique no botão Filogenia e selecione Filogenia de Teste de Bootstrap e, em seguida, clique em Árvore de Junção de Vizinhos. Selecione os parâmetros padrão e clique no botão Calcular para obter os resultados.
  7. Aplique o InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/) para identificar o domínio catalítico do NP.
    1. Insira a sequência na caixa. Selecione os parâmetros padrão e clique no botão Pesquisar para obter os resultados.
  8. Aplique Predict Protein (http://www.predictprotein.org/) online para prever a estrutura secundária da proteína.
    1. Insira uma sequência de aminoácidos (código de uma letra) na caixa e clique no botão predictProtein para obter os resultados.
  9. Aplique as ferramentas online SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/) para avaliar a estrutura tridimensional do PN24.
    1. Clique no botão Iniciar modelagem e cole a sequência de destino na caixa. Preencha as informações de Título do Projeto e E-mail e clique no botão Pesquisar Modelos para obter os resultados.

4. Clonagem de genes e construção de plasmídeo recombinante

  1. Primers de design cujo primer reverso continha um local NotI e o primer direto tinha um site EcoRI.
  2. Mostre o primer direto como: AGAGAATTCATGACCATGCCAGATTCT (5'–3'), e o primer reverso como: ATAGCGGCCGCCTAACGCGTGCCGTTAGA (5'–3') da Primer Express.
  3. Prepare os primers, bem como o cDNA do fungo da lagarta para clonagem do gene PN . Realize PCR da seguinte forma: pré-desnaturação a 95 ° C por 5 min, desnaturação a 94 ° C por 45 s, renaturação a 55 ° C por 60 s, extensão a 72 ° C por 90 s, repita por 35 ciclos e extensão a 72 ° C por 10 min.
  4. Obter os fragmentos de PCR e detectá-los por eletroforese em gel de agarose para verificação. Ligue os fragmentos de PCR com pMD18-T. Conduza o sistema de ligação de PMD18-T da seguinte forma: 1 μL de PMD18-T, 4 μL de solução1 e 5 μL de gene alvo. Defina as condições da seguinte forma: manutenção a 16 °C por 16 h, inativação a 65 °C por 15 min.
  5. Transferir os plasmídeos recombinantes para as células competentes de E. coli JM109 de acordo com o manual de operação25.
  6. Digerir os plasmídeos pMD18-T/PN recombinantes e o vetor ppic9K com EcoRI e NotI. Ligue os fragmentos após digestão por T4 DNA ligase.
  7. Construa o plasmídeo recombinante ppic9K / PN para expressão heteróloga adicional.

Resultados

A sequência ORF do gene PN tinha 855 pb de comprimento, que codificava 284 aminoácidos com uma massa molecular calculada de 30,69 kDa e um ponto isoelétrico previsto de 11,55, indicando que a PN é uma proteína alcalina. A aplicação do SignalP4.0 Server foi conduzida para identificar o peptídeo sinal, e os resultados indicaram que o PN não possui peptídeos sinal. Além disso, os resultados da pesquisa BLASTP indicaram que o PN originado do fungo lagarta compartilhou a m...

Discussão

A saúde humana enfrenta uma série de problemas médicos importantes, como doenças tumorais, cardiovasculares e cerebrovasculares 26,27. A MTC tem sido considerada a fonte de pesquisa e desenvolvimento de medicamentos inovadores, devido aos seus ricos recursos de espécies e estrutura e funções diversificadas de ingredientes ativos28,29. O fungo lagarta é um parasita...

Divulgações

Os autores não relatam conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31871244, 81973733, 81803652), Fundação de Ciências Naturais da Província de Guangdong (2019A1515011555, 2018A0303100007), Fundação de Shenzhen da Comissão de Saúde e Planejamento Familiar (SZBC2018016), Fundo Especial para o Desenvolvimento Econômico e Tecnológico do Distrito de Longgang da Cidade de Shenzhen (LGKCYLWS2020064, LGKCYLWS2019000361).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
RNase-free DNase ITaKaRa2270B
PolyATtract mRNA Isolation SystemsPromegaIII
Random hexamer-primersThermo ScientificSO142
NEBNext1 Ultra RNA Library Prep KitNEBE7530S
PCR extraction kitQiaQuick
AgaroseTransGen BiotechGS201-01
High-throughput sequencerIlluminaHiSeq™ 4,000
LTF ViewerLTFV5.2
ORF programNCBI
ProtParam toolSIB Swiss Institute of Bioinformatics
SignalP ServerDTU Health Tech5.0
BLASTNCBI
Clustal X programUCD Dublin
MEGACenter for Evolutionary Medicine and Informatics4.0
InterProScanEuropean Molecular Biology Laboratory
Predict ProteinTechnical University of Munich
WISS-MODELSwiss Institute of Bioinformatics
Primer ExpressApplied Biosystems3.0
EcoRINEBR0101V
NotINEBER0591
pMD18-T VectorTaKaRa6011
agaroseSigma-AldrichGS201-01
Trans2K® Plus II DNA MarkerSigma-AldrichBM121-01
6×DNA Loading BufferSigma-AldrichGH101-01
GelStainSigma-AldrichGS101-02
50 x TAESigma-AldrichT1060
Gel imaginganalysis systemSyngeneG:BOX F3
E. coli JM109Promega
T4 DNA ligaseEarthOxBE004A-02
pPIC9KGenlociGP0983

Referências

  1. Dong, C. J. The traditional Chinese medicine fungus Cordyceps and its biotechnological production. Research Journal of Biotechnology. 8, 1-2 (2013).
  2. Xia, E. H., et al. The caterpillar fungus, Ophiocordyceps sinensis, genome provides insights into highland adaptation of fungal pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1806 (2017).
  3. Koganti, P., et al. Cordyceps sinensis increases hypoxia tolerance by inducing heme oxygenase-1 and metallothionein via Nrf2 activation in human lung epithelial cells. BioMed Research International. 2013, 569206 (2013).
  4. Shen, C. Y., Jiang, J. G., Li, Y., Wang, D. W., Wei, Z. Anti-ageing active ingredients from herbs and nutraceuticals used in traditional Chinese medicine: pharmacological mechanisms and implications for drug discovery. British Journal of Pharmacology. 174, (2017).
  5. Jiang, Y., Yao, Y. J. Names related to Cordyceps sinensis anamorph. Mycotaxon. 84, 245-254 (2002).
  6. Chen, Y. Q., Wang, N., Qu, L. H., Li, T. H., Zhang, W. M. Determination of the anamorph of Cordyceps sinensis inferred from the analysis of the ribosomal DNA internal transcribed spacers and 5.8S rDNA. Biochemical Systematics and Ecology. 29, 597-607 (2001).
  7. Liu, Z. Y., et al. Molecular evidence for the anamorph-teleomorph connection in Cordyceps sinensis. Mycological Research. 105, 827-832 (2001).
  8. Yu, S. J., Zhang, Y., Fan, M. Z. Analysis of volatile compounds of mycelia of Hirsutella sinensis, the anamorph of Ophiocordyceps sinensis. Applied Mechanics and Materials. 140, 253-257 (2012).
  9. Singh, M., et al. Cordyceps sinensis increases hypoxia tolerance by inducing heme oxygenase-1 and metallothionein via Nrf2 activation in human lung epithelial cells. BioMed Research International. 2013, 569206 (2013).
  10. Cha, S. H., et al. Production of mycelia and exo-biopolymer from molasses by Cordyceps sinensis 16 in submerged culture. Bioresource Technology. 98, 165-168 (2007).
  11. Lin, S., et al. Enhancement of cordyceps polysaccharide production via biosynthetic pathway analysis in Hirsutella sinensis. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 872-880 (2016).
  12. Xia, E. H., et al. The caterpillar fungus, Ophiocordyceps sinensis, genome provides insights into highland adaptation of fungal pathogenicity. Scientific Reports. 7, 1806 (2017).
  13. Cha, S. H., et al. Production of mycelia and exo-biopolymer from molasses by Cordyceps sinensis 16 in submerged culture. Bioresource Technology. 98, 165-168 (2007).
  14. Antonioli, L., Blandizzi, C., Pacher, P., Hasko, G. Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nature Reviews. Cancer. 13, 842-857 (2013).
  15. Lin, S., Zou, Z., Zhou, C., Zhang, H., Cai, Z. Transcriptome analysis reveals the molecular mechanisms underlying adenosine biosynthesis in anamorph Strain of caterpillar fungus. BioMed Research International. 2019, 1864168 (2019).
  16. Lin, S., et al. Biosynthetic pathway analysis for improving the cordycepin and cordycepic aid production in Hirsutella sinensis. Applied Biochemistry and Biotechnology. 179, 633-649 (2016).
  17. Allard, B., Beavis, P. A., Darcy, P. K., Stagg, J. Immunosuppressive activities of adenosine in cancer. Current Opinion in Pharmacology. 29, 7-16 (2016).
  18. Fredholm, B. B. Adenosine, an endogenous distress signal, modulates tissue damage and repair. Cell Death and Differentiation. 14, 1315-1323 (2007).
  19. Ohta, A., Sitkovsky, M. Role of G-protein-coupled adenosine receptors in downregulation of inflammation and protection from tissue damage. Nature. 414, 916-920 (2001).
  20. Allard, B., Turcotte, M., Stagg, J. CD73-generated adenosine: orchestrating the tumor-stroma interplay to promote cancer growth. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012, 485156 (2012).
  21. Zhang, Y., Wang, X., Nan, P., Li, J., Jin, L. De novo transcriptome sequencing of genome analysis provides insights into Solidago canadensis invasive capability via photosynthesis. Journal of Plant Interactions. 14, 572-579 (2019).
  22. Liu, Z. Q., et al. Transcriptome sequencing and analysis of the entomopathogenic fungus Hirsutella sinensis isolated from Ophiocordyceps sinensis. BMC Genomics. 16, 106 (2015).
  23. Ogawa, J., et al. Purification, characterization, and gene cloning of purine nucleosidase from Ochrobactrum anthropi. Applied and Environmental Microbiology. 67, 1783-1787 (2001).
  24. Konstantin, A., et al. The swiss-model workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics. 16, 195-201 (2006).
  25. Chung, C., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 2172-2175 (1989).
  26. Lin, S., et al. Association between aldose reductase gene C(-106)T polymorphism and diabetic retinopathy: A systematic review and Meta-Analysis. Ophthalmic Research. 63, 1-10 (2020).
  27. Peng, Y., et al. Inguinal subcutaneous white adipose tissue (ISWAT) transplantation model of murine islets. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).
  28. Zhang, T. T., Jiang, J. G. Active ingredients of traditional Chinese medicine in the treatment of diabetes and diabetic complications. Expert Opinion on Investigational Drugs. 21, 1625-1642 (2012).
  29. Lin, S., Zhou, C., Zhang, H., Cai, Z. Expression, purification and characterization of 5'-nucleotidase from caterpillar fungus by efficient genome-mining. Protein Expression and Purification. 168, 105566 (2020).
  30. Kinjo, N., Mu, Z. Morphological and phylogenetic studies on Cordyceps sinensis distributed in southwestern China. Mycoence. 42, 567-574 (2001).
  31. Xiao, J. H., Ying, Q., Xiong, Q. Nucleosides, a valuable chemical marker for quality control in traditional Chinese medicine Cordyceps. Recent Patents on Biotechnology. 7, 2 (2013).
  32. Tu, P., Yong, J., Guo, X. Discovery, research and development for innovative drug of traditional Chinese medicine under new situations. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 40, 3423-3428 (2015).
  33. Zheng, P., et al. Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris, a valued traditional Chinese medicine. Genome Biology. 12, 116 (2011).
  34. Covarrubias, R., et al. Role of the CD39/CD73 purinergic pathway in modulating arterial thrombosis in mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36, 1809-1820 (2016).
  35. Ogawa, Y., Murayama, N., Yanoshita, R. Molecular cloning and characterization of ecto-5'-nucleotidase from the venoms of Gloydius blomhoffi. Toxicon. 54, 408-412 (2009).
  36. Lin, S., et al. Mining and characterization of two novel chitinases from Hirsutella sinensis using an efficient transcriptome-mining approach. Protein Expresion and Purification. 133, 81-89 (2017).
  37. Ueda, M., Hirano, Y., Fukuhara, H. Gene cloning, expression, and X-ray crystallographic analysis of a β-mannanase from Eisenia fetida. Enzyme and Microbial Technology. 117, 15-22 (2018).
  38. Rebets, Y., Kormanec, J., Luzhetskyy, A., Bernaerts, K., Anné, J. Cloning and expression of metagenomic DNA in Streptomyces lividans and subsequent fermentation for optimized production. Methods in Molecular Biology. 1539, 99 (2017).
  39. Wang, S. S., Ning, Y. J., Wang, S. N., Zhang, J., Chen, Q. J. Purification, characterization, and cloning of an extracellular laccase with potent dye decolorizing ability from white rot fungus Cerrena unicolor GSM-01. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 920-927 (2016).

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