Einzelzell-Multiplex-Fluoreszenzbildgebung zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren und Proteine und zur Überwachung von HIV-, HTLV-, HBV-, HCV-, Zika-Virus- und Influenza-Infektionen

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll für einen Fluoreszenzbildgebungsansatz vorgestellt, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), eine Methode, die in der Lage ist, gleichzeitig Fluoreszenz-Einzelzellvisualisierung von viralen Proteinen und Nukleinsäuren unterschiedlicher Art und Strandung zu visualisieren. Dieser Ansatz kann auf eine Vielzahl von Systemen angewendet werden.

Zusammenfassung

Die Erfassung der dynamischen Replikations- und Assemblierungsprozesse von Viren wurde durch den Mangel an robusten In-situ-Hybridisierungstechnologien (ISH) behindert, die eine empfindliche und gleichzeitige Markierung von viraler Nukleinsäure und -protein ermöglichen. Herkömmliche Methoden der DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) sind oft nicht mit der Immunfärbung kompatibel. Wir haben daher einen bildgebenden Ansatz entwickelt, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of D NA, RNA and protein), der die gleichzeitige Einzelzellvisualisierung von DNA, RNA und Protein ermöglicht. Im Vergleich zu herkömmlichen DNA-Fischen verwendet micddrp die verzweigte DNA (bDNA) ISH-Technologie, die die Empfindlichkeit und Detektion von Oligonukleotidsonden drastisch verbessert. Kleine Modifikationen von MICDDRP ermöglichen die Abbildung viraler Proteine gleichzeitig mit Nukleinsäuren (RNA oder DNA) unterschiedlicher Litze. Wir haben diese Protokolle angewendet, um die Lebenszyklen mehrerer viraler Krankheitserreger zu untersuchen, darunter das humane Immundefizienzvirus (HIV)-1, das humane T-lymphotrope Virus (HTLV)-1, das Hepatitis-B-Virus (HBV), das Hepatitis-C-Virus (HCV), das Zika-Virus (ZKV) und das Influenza-A-Virus (IAV). Wir haben gezeigt, dass wir virale Nukleinsäuren und Proteine über eine Vielzahl von Viren hinweg effizient markieren können. Diese Studien können uns ein verbessertes mechanistisches Verständnis mehrerer viraler Systeme liefern und dienen darüber hinaus als Vorlage für die Anwendung der Multiplex-Fluoreszenzbildgebung von DNA, RNA und Protein in einem breiten Spektrum zellulärer Systeme.

Einleitung

Während Tausende von kommerziellen Antikörpern verfügbar sind, um Proteine über konventionelle Immunfärbungsansätze spezifisch zu markieren, und während Fusionsproteine mit photooptimierten fluoreszierenden Tags zur Verfolgung mehrerer Proteine in einer Probe hergestellt werden können¹, ist die mikroskopische Visualisierung von Proteinen oft nicht kompatibel mit der herkömmlichen DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)² . Technische Einschränkungen bei der gleichzeitigen Visualisierung von DNA, RNA und Protein mit fluoreszenzbasierten Ansätzen haben ein tiefes Verständnis der Virusreplikation behindert. Die Verfolgung von viraler Nukleinsäure und Protein während der Infektion ermöglicht es Virologen, grundlegende Prozesse zu visualisieren, die der Replikation und Assemblierung von Viren zugrunde liegen 3,4,5,6.

Wir haben einen bildgebenden Ansatz entwickelt, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and Protein (MICDDRP)³, der verzweigte DNA (bDNA) in situ Technologie verwendet, um die Empfindlichkeit der Nukleinsäuredetektion zu verbessern 7,8,9 . Darüber hinaus verwendet diese Methode gepaarte Sonden für eine verbesserte Spezifität. bDNA-sequenzspezifische Sonden verwenden verzweigte Vorverstärker- und Verstärker-DNAs, um ein intensives und lokalisiertes Signal zu erzeugen und frühere Hybridisierungsmethoden zu verbessern, die auf wiederholten Regionen in der DNA beruhten⁹. Infizierte Zellen in einem klinischen Kontext enthalten oft kein reichlich vorhandenes virales genetisches Material, was eine Ware für eine empfindliche Methode zum Nachweis fluoreszierender Nukleinsäure in diagnostischen Umgebungen darstellt. Die Kommerzialisierung der bDNA-Technologie durch Ansätze wie RNAscope⁷ und ViewRNA¹⁰ hat diese Nische gefüllt. Die Empfindlichkeit der bDNA-Fluoreszenzbildgebung hat auch einen wichtigen Nutzen in der Zellbiologie, da sie den Nachweis seltener Nukleinsäurespezies in Zellkulturmodellen ermöglicht. Die enorme Verbesserung der Empfindlichkeit macht bDNA-basierte Bildgebungsverfahren für die Untersuchung von Viren geeignet. Ein mögliches Manko ist jedoch, dass sich diese Methoden auf die Visualisierung von RNA oder RNA und Protein konzentrieren. Alle replizierenden Zellen und viele Viren haben DNA-Genome oder bilden während ihres Replikationszyklus DNA, was Methoden, die sowohl RNA und DNA als auch Protein abbilden können, sehr wünschenswert macht.

Im MICDDRP-Protokoll führen wir bDNA-FISH zum Nachweis viraler Nukleinsäure mit der RNAscope-Methode mit Modifikationen⁷ durch. Eine der wichtigsten Änderungen an diesem Protokoll ist die Optimierung der Proteasebehandlung nach chemischer Fixierung. Die Proteasebehandlung erleichtert die Entfernung von Proteinen, die an Nukleinsäure gebunden sind, um die Effizienz der Sondenhybridisierung zu verbessern. Auf die Proteasebehandlung folgt die Inkubation mit verzweigten Oligonukleotidsonden. Nach dem Auftragen der bDNA-Sonde(n) werden die Proben gewaschen und anschließend mit Signalvorverstärker- und Verstärker-DNAs inkubiert. Die multiplexierte In-situ-Hybridisierung (ISH), die Markierung mehrerer Gentargets, erfordert Zielsonden mit unterschiedlichen Farbkanälen für die spektrale Differenzierung⁷. Auf die Inkubation mit DNA-Verstärkern folgt die Immunfluoreszenz (IF).

bDNA ISH bewirkt Verbesserungen des Signal-Rauschens durch Verstärkung zielspezifischer Signale, mit einer Reduktion des Hintergrundrauschens von unspezifischen Hybridisierungsereignissen ^7,11. Zielsonden werden unter Verwendung öffentlich zugänglicher Softwareprogramme entworfen, die die Wahrscheinlichkeit unspezifischer Hybridisierungsereignisse vorhersagen und die Schmelztemperatur (T_m) des Sonden-Ziel-Hybrids ^7,11 berechnen. Zielsonden enthalten eine 18- bis 25-Basen-Region, die komplementär zur Ziel-DNA/RNA-Sequenz ist, eine Spacer-Sequenz und eine 14-Basen-Schwanzsequenz. Ein Paar Zielsonden, jede mit einer bestimmten Schwanzsequenz, hybridisiert zu einer Zielregion (über ~ 50 Basen). Die beiden Schwanzsequenzen bilden eine Hybridisierungsstelle für die Vorverstärkersonden, die 20 Bindungsstellen für die Verstärkersonden enthalten, die zusätzlich 20 Bindungsstellen für die Markierungssonde enthalten. Zum Beispiel wird eine Region von einer Kilobase (kb) auf dem Nukleinsäuremolekül von 20 Sondenpaaren anvisiert, wodurch ein molekulares Gerüst für die sequentielle Hybridisierung mit dem Vorverstärker, dem Verstärker und der Markierungssonde entsteht. Dies kann somit zu einer theoretischen Ausbeute von 8000 fluoreszierenden Markierungen pro Nukleinsäuremolekül führen, was den Nachweis einzelner Moleküle und enorme Verbesserungen gegenüber herkömmlichen FISH-Ansätzen ermöglicht⁷ (siehe Abbildung 1A für eine schematische Darstellung der bDNA-Signalamplifikation). Um Sonden für gemultiplextes ISH einzurichten, muss sich jede Zielsonde in einem anderen Farbkanal befinden (C1, C2 oder C3). Diese Zielsonden mit unterschiedlichen Farbkanälen besitzen unterschiedliche 14-Basen-Schwanzsequenzen. Diese Schwanzsequenzen binden unterschiedliche Signalverstärker mit verschiedenen Fluoreszenzsonden und ermöglichen so eine einfache spektrale Differenzierung über mehrere Ziele hinweg. Im vorgestellten Protokoll enthält Tabelle 4 in Schritt 9 weitere Informationen zu fluoreszenzmarkierenden Zielsonden. Darüber hinaus zeigen Abbildung 2 und Abbildung 3 Beispiele, wie wir den geeigneten Verstärker 4-FL (A, B oder C) (Fluoreszenzsonde und den letzten Hybridisierungsschritt) ausgewählt haben, um eine spezifische fluoreszierende Markierung mehrerer viraler Nukleinsäureziele nach HIV-1- und HTLV-1-Infektionen zu erreichen.

Wir haben mehrere Anwendungen der simultanen Fluoreszenzvisualisierung von RNA, DNA und Proteinen demonstriert und kritische Stadien der Virusreplikation mit hoher raumzeitlicher Auflösung ^3,4,5 beobachtet. Zum Beispiel hat uns die gleichzeitige Einzelzellvisualisierung von viraler RNA, zytoplasmatischer und nukleärer DNA und Proteinen ermöglicht, Schlüsselereignisse während der HIV-1-Infektion zu visualisieren, einschließlich der Verfolgung von RNA-haltigen Kernen im Zytoplasma vor dem Kerneintritt und der Integration von proviraler DNA³. Darüber hinaus haben wir MICDDRP angewendet, um die Auswirkungen von Wirtsfaktoren und medikamentöser Behandlung auf Virusinfektionen und Replikation zu charakterisieren ^4,5. In Ukah et al. verfolgten wir die Reaktivierung der HIV-1-Transkription in Latenzzellmodellen, die mit verschiedenen Latenzumkehrern behandelt wurden, um die HIV-Transkription und die Latenzumkehrung 4 zu visualisieren^. Darüber hinaus kann MICDDRP es uns ermöglichen, phänotypische Veränderungen im Zusammenhang mit antiviraler Hemmung zu visualisieren, die auf die Behandlung kleiner Moleküle oder die Einschränkung des Wirtsfaktors zurückzuführen sind. Als Proof of Concept für die Robustheit und breite Anwendbarkeit unseres Ansatzes haben wir gezeigt, dass wir Modifikationen unseres Protokolls verwenden können, um virale Nukleinsäure effizient zu markieren, um Infektionen nicht nur im humanen Immundefizienzvirus (HIV)-1, sondern auch im humanen T-lymphotropen Virus (HTLV)-1, Hepatitis-B-Virus (HBV), Hepatitis-C-Virus (HCV), Zika-Virus (ZIKV) und Influenza-A-Virus (IAV). Da der HIV-1-Lebenszyklus sowohl aus viraler DNA als auch aus RNA-Spezies besteht, haben wir den Großteil unserer Optimierung von MICDDRP nach HIV-1-Replikationskinetik durchgeführt. Darüber hinaus haben wir jedoch gezeigt, dass wir die Synthese verschiedener viraler RNA-Transkripte von einem oder beiden Sense- (+) und Antisense- (-) Strängen in Viren wie ZIKV, IAV, HBV und HCV verfolgen können, um die virale Transkription und Replikation zu überwachen 3,4,5,6. Die Studien zielen darauf ab, das mechanistische Verständnis mehrerer viraler Prozesse zu verbessern und dienen als Richtlinie für die Implementierung dieser Fluoreszenzbildgebungstechnologie auf ein breites Spektrum von Zellmodellen.

Protokoll

1. Samenzellen (Suspension vs. Adhärent Cells) auf Deckgläsern oder Kammerobjektträgern (vorgestelltes Protokoll verwendet Deckgläser).

1. Aussaat von Suspensionszellen
   1. Bereiten Sie mit Poly-D-Lysin (PDL) beschichtete Deckgläser vor (erleichtert die Anhaftung von Suspensionszellen an Deckglas), indem Sie zuerst Deckgläser in Ethanol (EtOH) für 5 Minuten inkubieren (sterilisiert Deckgläser und entfernt alle Rückstände). Anschließend 2x in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen, bevor Deckgläser in PDL (20 μg/ml) für 30 Minuten (min) bei Raumtemperatur (RT) inkubiert werden.
   2. PDL entfernen und 2x in PBS waschen. Pelletzellen (zuvor infiziert/behandelt basierend auf den gewünschten Bildgebungsbedingungen) und resuspendieren 10⁶Zellen in 50 μL PBS. 50 μL Zellen auf Glas (PDL-beschichtet) eintauchen und bei RT 30 min inkubieren.
2. Aussaat von adhärenten Zellen
   1. Kulturzellen auf sterilem Deckglas in 6-Well-Schale und infizieren Zellen mit viralen Partikeln oder behandeln mit Verbindung von Interesse. Lassen Sie die Zellen vor der Probenvorbereitung für bildgebende Experimente eine Konfluenz von 50-70% erreichen.

2. Zelluläre Fixierung: Zur Erhaltung der Zellmorphologie für Fluoreszenzbildgebungsstudien

HINWEIS: Halten Sie 4% PFA und PBS mindestens 30 Minuten vor der zellulären Fixierung bei RT.

1. Die zellulären Medien absaugen, Zellen auf Deckgläsern 3x in PBS waschen und Zellen in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 30 min fixieren. PFA absaugen und Zellen in PBS 2x waschen.
   HINWEIS: Zellen können nun dehydriert und gelagert werden, wenn der Experimentator das Experiment zu einem anderen Zeitpunkt fortsetzen möchte. Fixierte Zellen können vor der Lagerung in EtOH dehydriert werden.
   1. Entfernen Sie PBS nach dem Waschen nach zellulärer Fixierung und ersetzen Sie es durch 500 μL 50% EtOH (v/v in Wasser). Inkubieren bei RT für 5 min.
   2. Entfernen Sie 50% EtOH und ersetzen Sie es durch 500 μL 70% EtOH. Inkubieren bei RT für 5 min.
   3. Entfernen Sie 70% EtOH und ersetzen Sie es durch 500 μL 100% EtOH. Inkubieren bei RT für 5 min.
   4. Entfernen Sie 100% EtOH und ersetzen Sie es durch frisches 100% EtOH.
      HINWEIS: Dehydrierte Zellen können bei -20 °C für 6 Monate gelagert werden. Versiegeln Sie die Platten vor der Lagerung mit Klebeband oder Parafilm, um das Verdampfen von EtOH zu verhindern.
   5. Rehydrieren Sie die Zellen, um zur multiplexten Fluoreszenzmarkierung von Zellen / Viren überzugehen.
   6. Entfernen Sie 100% EtOH und ersetzen Sie es durch 500 μL 70% EtOH. Inkubieren bei RT für 2 min.
      HINWEIS: Lassen Sie die Zellen zu keiner Zeit austrocknen. Verwenden Sie immer genügend Lösung, um alle Zellen einzutauchen.
   7. Entfernen Sie 70% EtOH und ersetzen Sie es durch 500 μL 50% EtOH. Inkubieren bei RT für 2 min.
   8. Entfernen Sie 50% EtOH und ersetzen Sie es durch 1x PBS.
      HINWEIS: Bereiten Sie Proteaseverdünnung, Hybridisierungssonden und Waschpuffer vor der Proteasebehandlung (Schritt 4) und der Zielsondenanwendung (Schritt 5) vor. Spezifische Anweisungen zur Reagenzienzubereitung finden Sie zu Beginn jedes jeweiligen Schritts.

Reagenzien	Sonstige Anmerkungen
Protease-Lösung	Vorbereiten in 1X PBS
Ziel-Oligonukletodie-Sonde(n)	Verdünnung im Hybridisierungspuffer
Waschpuffer	Wascht nach Zielhybridisierungsschritten
Hybridisierungspuffer	Rezept in Tabelle 3

Tabelle 1: Schlüsselreagenzien im MICDDRP-Protokoll.

3. Zellpermeabilisierung: Erhöht den Zugang in die Zelle und zellulären Organellen für den Eintritt großer Moleküle (Antikörper, Nukleinsäure-Hybridisierungssonden)

1. Entfernen Sie 1x PBS nach zellulärer Fixierung oder Rehydratation und ersetzen Sie es durch 500 μL 0,1% (v/v) Tween-20 in 1x PBS. Inkubieren bei RT für 10 min. Ersetzen Sie eins nach dem anderen. Einmal mit 500 μL 1x PBS waschen und frisches 1x PBS hinzufügen.

4. Deckglasimmobilisierung auf Objektträger und Proteasebehandlung zur Entfernung von Nukleinsäure-bindenden Proteinen aus fixierter viraler/zellulärer Nukleinsäure zur Verbesserung der Hybridisierungseffizienz

HINWEIS: Bereiten Sie die verdünnte Protease III-Lösung (siehe Besonderheiten des Reagenzes in der Materialtabelle) während der zellulären Permeabilisierung vor. Lassen Sie die Protease vor der Permeabilisierung 10 Minuten lang RT erreichen.

1. Legen Sie einen kleinen Tropfen Nagellack auf einen sterilisierten Glasobjektträger. Trocknen Sie den Rücken (Seite ohne Zellschicht) und legen Sie den Rand des Deckglases auf den Nagellacktropfen, wobei die Seite mit den verklebten Zellen nach oben zeigt. Fügen Sie einige Tropfen PBS auf das immobilisierte Deckglas hinzu, um ein Austrocknen zu verhindern.
   1. Zeichnen Sie einen Kreis (ca. 3 mm vom Deckglas entfernt) um den Umfang des Deckglases, das jetzt mit einem hydrophoben Barrierestift (wasserabweisender Stift, der Reagenzien auf Zellen lokalisiert) auf dem Objektträger haftet.
2. Verdünnte Protease III in 1x PBS (100 μL/Deckglas).
   HINWEIS: Die Proteasekonzentration muss möglicherweise in Abhängigkeit von Unterschieden in Zelltypen, Sonden oder Zielnukleinsäure(n) durch empirische Optimierung angepasst werden (siehe Diskussion). Für die effizienteste RNA/DNA-Markierung über verschiedene Virussysteme hinweg hatten wir Erfolg mit den folgenden Verdünnungen in Tabelle 2 unten mit Verdünnungen von (1 bis 2)-(1 bis 15) (Protease bis 1x PBS).

Sondenziele	Proteaseverdünnung in 1X PBS (Protease III bis 1X PBS)
HIV-1 DNA/RNA	1 bis 5
HTLV-1 DNA/RNA	1 bis 5
HBV-pgRNA und Gesamt-HBV-RNA	1 bis 15
IAV-RNA	1 bis 15
ZIKV-RNA	1 bis 2

Tabelle 2: Protease III-Verdünnungen in PBS für die virale Nukleinsäurehybridisierung.

3. Dekantieren Sie das 1x PBS nach der Immobilisierung auf dem Deckglas und tragen Sie die verdünnte Protease III auf.
4. In einem befeuchteten Ofen bei 40 °C für 15 min inkubieren.
5. Dekantieren Sie Proteaselösung und tauchen Sie Objektträger in 1x PBS. Mit einer Schaukelschale 2 min bei RT rühren. Wiederholen Sie das Waschen mit dem neuen 1x PBS.
   1. Für den DNA-Nachweis werden die Proben dreimal mit nukleasefreiem Wasser für jeweils 2 min gewaschen, gefolgt von einer Inkubation mit 5 mg/ml RNase A, verdünnt in PBS für 30 min bei 37 °C.
   2. Dekantieren Sie RNase A-Lösung und waschen Sie 3x für 2 min mit Reinstwasser. Fahren Sie mit ISH der Zielsonde(n) fort.
      HINWEIS: Hybridisierungspuffer verbessert die vDNA-Erkennung, ohne die vRNA-Färbeeffizienz für die vorgestellten Ergebnisse zu beeinträchtigen (repräsentative Ergebnisse). Verdünnte DNA Kanal 1 (C1) Sonden 1:1 mit Hybridisierungssonde. Verdünnte RNA C2- und C3-Sonden im Hybridisierungspuffer. Die in unseren bildgebenden Untersuchungen verwendeten C2- und C3-Sonden befinden sich in 50X-Lösungen (1:50; Zielsonde zu Hybridisierungspuffer).
6. Bereiten Sie den Hybridisierungspuffer in nukleasefreiem Wasser nach dem folgenden Schritt-für-Schritt-Verfahren vor:
   1. In einem 15-ml-Röhrchen werden 700 μL Nuklease-freies Wasser, 300 μL 50% (Gewicht/Volumen (w/v)) Dextransulfat, 300 μL 5 M NaCl, 125 μL 200 mM Natriumcitrat (pH 6,2) und 375 mg (Pulver) Ethylencarbonat hinzugefügt.
   2. Mischen Sie gut mit einem Wirbel, um Ethylencarbonat aufzulösen (stellen Sie sicher, dass das gesamte Pulver gelöst und klar gelöst ist).
   3. Fügen Sie 25 μL von 10% (Volumen / Volumen (v / v)) Tween-20 und genügend nukleasefreies Wasser hinzu, um 2,5 ml (2x Lösung) zu vervollständigen.
      HINWEIS: Das Rezept für den Hybridisierungspuffer finden Sie in Tabelle 3 unten. Die Lösung ist für eine Woche stabil. Stellen Sie sicher, dass Tween-20-Reinigungsmittel ausreichend gemischt wird, und achten Sie darauf, ein Sprudeln der Lösung zu vermeiden.

Reagenz	Bestandskonzentration	Zusätzliche Hinweise
Nukleasefreies Wasser	NA
Dextransulfat	50% (w/v)	Sehr viskos
Natriumchlorid	5 M
Natriumcitrat (pH 6,2)	200 mM	Bei 4 °C lagern
Ethylencarbonat	NA	Pulver
Tween-20	10% (v/v)

Tabelle 3: Hybridisierungspufferliste der Reagenzien.

5. Inkubation mit DNA/RNA-Zielhybridisierungssonden: Ziel-Oligonukleotid-Sonden binden an interessierende Regionen und erzeugen ein molekulares Gerüst für Vorverstärker, Verstärker und Fluoreszenzsonden zum Binden.

HINWEIS: Warme DNA/RNA-Sonden bei 40 °C für 10 min (während der Zellpermeabilisierung) und kühlen für mindestens 10 min auf RT ab, wenn keine RNase-Behandlung enthalten ist. Wenn vor der Hybridisierung der Zielsonde eine RNase-Behandlung oder eine weitere Probenbehandlung erforderlich ist, werden die Sonden entsprechend warm. C2- und C3-Sonden nach dem Erwärmen herunterdrehen und im Hybridisierungspuffer verdünnen. Nach der Verdünnung können C2- und C3-Sonden kurz erwärmt werden. 50x Waschpuffer (siehe Materialtabelle ) bei 40 °C für 10-20 min erwärmen und auf 1x in molekularbiologischem Wasser verdünnen.

1. 200 μL des Hybridisierungspuffers bei 67 °C für 10 min vor Zugabe der Hybridisierungssonde(n) inkubieren. Verdünnte Sonde im Hybridisierungspuffer (Rezept in Tabelle 2 aufgeführt). Fügen Sie 50 μL/Deckglas hinzu.
2. Im befeuchteten Ofen bei 40 °C für 2 Stunden (h) inkubieren. Dekantsonden und Tauchschlitten in 1x Waschpuffer. Rühren, indem Sie die Schale für 2 min bei RT schaukeln. Wiederholen Sie die Wäsche mit dem neuen 1x Waschpuffer.

6. Verstärker (Amp) 1-FL Hybridisierung: Hinzufügen eines Vorverstärkers, der komplementär zur Schwanzsequenz der Ziel-DNA/RNA-Sonden ist (Schritt 5)

HINWEIS: Verstärker sollten vor dem Gebrauch auf RT sein. Holen Sie jeden einzelnen Verstärker 30 Minuten vor Gebrauch aus dem Kühlschrank und lassen Sie ihn bei RT auf der Bank.

1. Objektträger aus 1x Waschpuffer entfernen und klopfen/absorbieren, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
2. Fügen Sie 1 Tropfen Amp 1-FL auf das Deckglas hinzu. Im befeuchteten Ofen bei 40 °C 30 min inkubieren.
3. Decant Amp 1-FL und 1x Waschpuffer eintauchen. Rühren, indem Sie die Schale 2 min bei RT schaukeln. Wiederholen Sie die Wäsche mit dem neuen 1x Waschpuffer.

7. Amp 2-FL Hybridisierung: Inkubation mit Signalverstärker mit verwandter Erkennungssequenz zu Vorverstärkern (Amp 1-FL)

1. Objektträger aus 1x Waschpuffer entfernen und klopfen/absorbieren, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
2. Fügen Sie 1 Tropfen Amp 2-FL auf das Deckglas hinzu. Im Befeuchtungsofen bei 40 °C 15 min inkubieren.
3. Decant Amp 2-FL und 1x Waschpuffer eintauchen. Rühren, indem Sie die Schale 2 min bei RT schaukeln. Wiederholen Sie die Wäsche mit dem neuen 1x Waschpuffer.

8. Amp 3-FL Hybridisierung: Inkubation mit zweitem Signalverstärker

1. Objektträger aus 1x Waschpuffer entfernen und klopfen/absorbieren, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
2. Fügen Sie 1 Tropfen Amp 3-FL auf das Deckglas hinzu. Im befeuchteten Ofen bei 40 °C 30 min inkubieren.
3. Decant Amp 3-FL und 1x Waschpuffer eintauchen. Rühren, indem Sie die Schale 2 min bei RT schaukeln. Wiederholen Sie die Wäsche mit dem neuen 1x Waschpuffer.

9. Amp 4-FL Hybridisierung: Fluoreszierende Markierung und letzter Hybridisierungsschritt

HINWEIS: In Tabelle 4 können Sie zunächst den geeigneten Amp 4 (A, B oder C)- FL basierend auf den Kanälen der Zielsonde(n) auswählen. Beurteilen Sie, welcher Amp 4-FL benötigt wird, um DNA / RNA von Interesse zu markieren. Ein Beispiel finden Sie in der folgenden Tabelle:

	Ein	B	C
DNA-Kanal 1 (C1)	488	550	550
DNA/RNA Kanal 2 (C2)	550	488	647
RNA-Kanal 3 (C3)	647	647	488

Tabelle 4: Auswahl der Amp 4 (A, B oder C)-FL Fluoreszenzsonde für gemultiplexte ISH.

HINWEIS: Für gemultiplexte FISH (mehrere Ziele) ist die Auswahl des richtigen Amp 4 (A, B oder C)- FL entscheidend für die korrekte Kennzeichnung Ihres Ziels von Interesse. Zielsonden (Schritt 5) haben unterschiedliche Farbkanäle (C1, C2 oder C3), die ihre jeweilige fluoreszierende Markierung (Alexa 488, Atto 550 oder Alexa 647) bestimmen, basierend auf dem gewählten Amp 4-FL. Beispiele für die Auswahl von Fluorophorkombinationen für die Multiplexbildgebung finden Sie in den Legenden von Abbildung 2 und Abbildung 3. Als weiteres Beispiel wird die Auswahl von Amp 4B-FL selektiv DNA-C1-Sonden mit Atto 550 und RNA-C3-Sonden mit Alexa 647 markieren.

1. Objektträger aus 1x Waschpuffer entfernen und klopfen/absorbieren, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
2. Fügen Sie 1 Tropfen Amp 4-FL auf das Deckglas hinzu. Im Befeuchtungsofen bei 40 °C 15 min inkubieren.
   HINWEIS: Bewahren Sie nach Schritt 9.2 die Proben bedeckt und vor Licht geschützt auf.
3. Decant Amp 4-FL und 1x Waschpuffer eintauchen. Rühren, indem Sie die Schale für 2 min bei RT schaukeln. Wiederholen Sie die Wäsche mit dem neuen 1x Waschpuffer. Mit 1x PBS waschen (2 min) und in PBS lagern.

10. Proteinimmunfärbung: Zur Markierung von Protein(en) von Interesse

1. Dekantieren Sie PBS und geben Sie 200 μL Blockierpuffer (1% w/v BSA, 10% v/v FBS in PBS mit 0,1% v/v Tween-20 (PBST)) zum Deckglas. Inkubation 1 h bei RT.
2. Dekant blockierenden Puffer und 200 μL primären Antikörper verdünnt in PBST + 1% w/v BSA auftragen. Inkubation 1 h bei RT.
3. Waschen Sie den Objektträger zweimal mit PBST für 10 min bei RT mit Schütteln.
4. Wenden Sie sekundäre Antikörper Ihrer Wahl für 1 h bei RT in PBST + 1% w/v BSA an.
5. Waschen Sie den Objektträger mit PBST für 10 min bei RT mit Schütteln.

11. Kernfärbung: Gegenfärbungskerne nach Immunfärbung

1. Dekantieren Sie PBST und tragen Sie DAPI oder Kernfärbung Ihrer Wahl für 1 min bei RT auf.
2. Waschen Sie den Objektträger zweimal mit PBS für 10 min bei RT mit Schütteln.

12. Montage

1. Geben Sie 1 Tropfen Antifade-Lösung (z. B. Prolong Gold) auf den neuen sterilen Objektträger (zuerst den Objektträger mit EtOH reinigen und trocknen lassen, um sicherzustellen, dass sich keine Rückstände auf dem Glas befinden). Verteilen Sie mit derselben Spitze den Antifade-Lösungstropfen, um einen Bereich von der Größe des Deckglases zu bedecken.
   HINWEIS: Die Antifade-Lösung ist sehr viskos und kann schwierig zu pipetten sein. Das Abschneiden der Spitze einer 200-μL-Spitze vor dem Pipettieren kann diese Probleme mildern.
2. Entfernen Sie Deckglas mit Zellprobe vom Objektträger und tauchen Sie in PBS ein, um den restlichen Nagellack auf der Rückseite mit der Pinzette und PBS zu entfernen. Trocknen Sie die Pinzette und die Rückseite des Deckglases mit einem Kimwipe.
3. Deckglas vorsichtig in den Tropfen der Antifade-Lösung einbetten und Probenseite (Seite mit Zellschicht) des Deckglases auf Tropfen legen).
4. Proben über Nacht trocknen lassen.

13. Bildgebung

1. Bild mit einem Epifluoreszenzmikroskop.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung von MICDDRP. Auf die Markierung von DNA und RNA folgt die Immunfärbung. Die Verwendung von Verzweigungsverstärkern erhöht das Signal und ermöglicht den Nachweis einzelner Nukleinsäuremoleküle.

Abbildung 1: Schematische Darstellung von MICDDRP und Schritt-für-Schritt-Workflow....

Diskussion

Die gleichzeitige Visualisierung von RNA, DNA und Protein erfordert oft umfangreiche Optimierungen. Zwei häufig verwendete Methoden sind die 5-Ethinyl-2-Desoxyuridin-Markierung (EdU) und die DNA-FISH. Die EdU-Markierung wurde angewendet, um virale DNA und Protein gleichzeitig sichtbar zu machen, da EdU in naszierende DNA eingebaut und anschließend mit azidhaltigen Fluoreszenzfarbstoffen über Klickchemie markiert wird. Die EdU-Markierung kann somit verwendet werden, um die native Virusreplikationskinetik von D...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% PFA
50% dextran sulfate	Amreso	198	For DNA hybridization buffer
50X wash buffer	ACD Bio	320058
6-well plates
Amplifier 1-FL	ACD Bio
Amplifier 2-FL	ACD Bio
Amplifier 3-FL	ACD Bio
Amplifier 4-FL	ACD Bio		Consult Amp-4 table in protocol
Anti-HCV NS5a antibody	Abcam	ab13833	Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4
Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody	NIH AIDS Reagent Program	3537
Anti-Mov10 antibody	Abcam	ab80613	Rabbit polyclonal
Anti-PB1 antibody	GeneTex	GTX125923	Antibody against flu protein
Bovine serum albumin			Blocking reagent for immunostaining
Cell media with supplements			Media appropriate for cell model
Coverslips
DAPI	ACD Bio		Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio)
Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS)	Gibco	14190250	No calcium and magnesium
Ethylene carbonate	Sigma	E26258
Fetal bovine serum (FBS)			Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS)
Fisherbrand colorfrost plus microscope slides	Fisher Scientific	12-550-17/18/19	Precleaned
HCV-GT2a-sense-C2 probe	ACD Bio	441371	HCV(+) sense RNA probe
HIV-gagpol-C1	ACD Bio	317701	HIV-1 cDNA probe
HIV-nongagpol-C3	ACD Bio	317711-C	HIV-1 RNA probe
HybEZ hybridization oven	ACD Bio	321710/321720
ImmEdge hydrophobic barrier pen	Vector Laboratories	H-4000
Nail polish			For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment
Nuclease free water	Ambion	AM9937
Poly-d-lysine (PDL)			Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes
Probe diluent	ACD Bio	300041	For diluting RNA C2 or C3 probes
Prolong gold antifade	Invitrogen	P36930
Protease III	ACD Bio	322337
RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP	ACD Bio	436221
RNase A	Qiagen
Secondary antibodies
Slides
Sodium chloride			For DNA hybridization buffer
Sodium citrate, pH 6.2			For DNA hybridization buffer
Tween-20			For DNA hybridization buffer and PBS-T
V-HBV-GTD	ACD Bio	441351	Total HBV RNA
V-HBV-GTD-01-C2	ACD Bio	465531-C2	HBV pgRNA probe
V-HCV-GT2a probe	ACD Bio	441361	HCV(-) sense RNA probe
V-HTLV-HBZ-sense-C3	ACD Bio	495071-C3	HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ
V-HTLV1-GAG-C2	ACD Bio	495051-C2	HTLV-1 DNA probe
V-HTLV1-GAG-POL-sense	ACD Bio	495061	HTLV-1 (+) sense RNA probe
V-Influenza-H1N1-H5N1-NP	ACD Bio	436221	IAV RNA probe
V-ZIKA-pp-O2	ACD Bio	464531	Zika(+) sense RNA probe
V-ZIKA-pp-O2-sense-C2	ACD Bio	478731-C2	Zika(-) sense RNA probe