Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

Özet

Burada floresan görüntüleme yaklaşımı için bir protokol, D NA, RNA ve protein'in (MICDDRP) multiplex immunofloresan cell bazlı detectionu, viral protein ve farklı tip ve karaya oturmuş nükleik asitlerin eşzamanlı floresan tek hücreli görselleştirmesini yapabilen bir yöntemdir. Bu yaklaşım çok çeşitli sistemlere uygulanabilir.

Özet

Virüslerin dinamik replikasyon ve montaj süreçlerini yakalamak, viral nükleik asit ve proteinin hassas ve eşzamanlı olarak etiketlenmesini sağlayan sağlam in situ hibridizasyon (ISH) teknolojilerinin eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Konvansiyonel DNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) yöntemleri genellikle immün boyama ile uyumlu değildir. Bu nedenle, DNA, RNA ve proteinin eşzamanlı tek hücreli görselleştirmesini sağlayan MICDDRP (MULTIPLEX IMMUNOFLUORESCENT CELL-BASED D ETECTION OF DNA, RNA ve protein) adlı bir görüntüleme yaklaşımı geliştirdik. Geleneksel DNA FISH'lerle karşılaştırıldığında, micddrp, oligonükleotid probu duyarlılığını ve tespitini önemli ölçüde artıran dallanmış DNA (bDNA) ISH teknolojisini kullanır. MICDDRP'nin küçük modifikasyonları, viral proteinlerin farklı sarmallara sahip nükleik asitlerle (RNA veya DNA) eşzamanlı olarak görüntülenmesini sağlar. Bu protokolleri, insan immün yetmezlik virüsü (HIV)-1, insan T-lenfotropik virüsü (HTLV)-1, hepatit B virüsü (HBV), hepatit C virüsü (HCV), Zika virüsü (ZKV) ve influenza A virüsü (IAV) dahil olmak üzere çoklu viral patojenlerin yaşam döngülerini incelemek için uyguladık. Viral nükleik asitleri ve proteinleri çeşitli virüslerde etkili bir şekilde etiketleyebileceğimizi gösterdik. Bu çalışmalar bize çoklu viral sistemlerin gelişmiş mekanik anlayışını sağlayabilir ve ek olarak, DNA, RNA ve proteinin çok katlı floresan görüntülemesinin geniş bir hücresel sistem spektrumunda uygulanması için bir şablon görevi görebilir.

Giriş

Geleneksel immün boyama yaklaşımlarıyla proteinleri spesifik olarak etiketlemek için binlerce ticari antikor mevcut olsa da ve füzyon proteinleri, bir örnek^1'deki birden fazla proteini izlemek için foto-optimize floresan etiketlerle tasarlanabilirken, proteinin mikroskobik görselleştirilmesi genellikle geleneksel DNA floresan in situ hibridizasyonu (FISH) ile uyumlu ^değildir2 . Floresan tabanlı yaklaşımlar kullanılarak DNA, RNA ve proteinin eşzamanlı olarak görselleştirilmesindeki teknik sınırlamalar, virüs replikasyonunun derinlemesine anlaşılmasını engellemiştir. Enfeksiyon sırasında hem viral nükleik asidin hem de proteinin izlenmesi, virologların virüs replikasyonu ve montajı 3,4,5,6'nın altında yatan temel süreçleri görselleştirmelerini sağlar.

Nükleik asit tespitinin duyarlılığını artırmak için dallanmış DNA (bDNA) in situ teknolojisini kullanan DNA, RNA ve Protein'in (MICDDRP)^3'ün multiplex immunofloresan cell tabanlı detection'u adlı bir görüntüleme yaklaşımı geliştirdik ^7,8,9 . Ek olarak, bu yöntem gelişmiş özgüllük için eşleştirilmiş problar kullanır. bDNA dizisine özgü problar, yoğun ve lokalize bir sinyal üretmek için dallanma preamplifikatörü ve amplifikatör DNA'larını kullanır ve DNA^9'da tekrarlanan bölgeleri hedeflemeye dayanan önceki hibridizasyon yöntemlerini geliştirir. Klinik bağlamda enfekte olmuş hücreler genellikle bol miktarda viral genetik materyal içermez ve tanısal ortamlarda floresan nükleik asit tespiti için hassas bir yöntem için bir emtia sağlar. bDNA teknolojisinin RNAscope⁷ ve ViewRNA¹⁰ gibi yaklaşımlarla ticarileştirilmesi bu nişi doldurmuştur. bDNA floresan görüntülemenin duyarlılığı, hücre kültürü modellerinde kıt nükleik asit türlerinin tespit edilmesine izin veren hücre biyolojisinde de önemli bir faydaya sahiptir. Duyarlılığın büyük ölçüde artması, bDNA tabanlı görüntüleme yöntemlerini virüsleri incelemek için uygun hale getirir. Bununla birlikte, potansiyel bir eksiklik, bu yöntemlerin RNA veya RNA ve proteini görselleştirmeye odaklanmasıdır. Tüm çoğalan hücreler ve birçok virüs, DNA genomlarına sahiptir veya replikasyon döngüleri sırasında DNA oluşturur, bu da hem RNA hem de DNA'yı ve proteini görüntüleyebilen yöntemleri oldukça arzu edilir hale getirir.

MICDDRP protokolünde, RNAscope yöntemini kullanarak viral nükleik asidin tespiti için bDNA FISH'i^{modifikasyonlar 7} ile gerçekleştiriyoruz. Bu protokoldeki en önemli değişikliklerden biri, kimyasal fiksasyonu takiben proteaz tedavisinin optimizasyonudur. Proteaz tedavisi, prob hibridizasyon verimliliğini artırmak için nükleik aside bağlı proteinlerin uzaklaştırılmasını kolaylaştırır. Proteaz tedavisini dallı oligonükleotid prob (lar) ile inkübasyon izler. bDNA problarının uygulanmasından sonra, numuneler yıkanır ve daha sonra sinyal ön amplifikatörü ve amplifikatör DNA'ları ile inkübe edilir. Çoklu gen hedeflerinin etiketlenmesi olan multipleks in situ hibridizasyon (ISH), spektral farklılaşma için farklı renk kanallarına sahip hedef problar gerektirir⁷. DNA amplifikatörleri ile inkübasyonu immünofloresan (IF) takip eder.

bDNA ISH, hedefe özgü sinyallerin amplifikasyonu ile sinyalden gürültüye iyileştirmeler sağlar ve spesifik olmayan hibridizasyon olaylarından kaynaklanan arka plan gürültüsüne bir azalma^{sağlar 7,11}. Hedef problar, spesifik olmayan hibridizasyon olaylarının olasılığını tahmin eden ve prob-hedef hibrid ^7,11'in erime sıcaklığını (T m) hesaplayan halka açık yazılım programları kullanılarak tasarlanmıştır. Hedef problar, hedef DNA / RNA dizisini tamamlayan 18 ila 25 bazlı bir bölge, bir ara dizi ve 14 bazlı bir kuyruk dizisi içerir. Her biri ayrı bir kuyruk dizisine sahip bir çift hedef prob, bir hedef bölgeye (~ 50 baza yayılan) melezleşir. İki kuyruk dizisi, amplifikatör probları için 20 bağlama bölgesi içeren ön amplifikatör probları için bir hibridizasyon bölgesi oluşturur ve bunlara ek olarak etiket probu için 20 bağlama bölgesi içerir. Örnek olarak, nükleik asit molekülü üzerindeki bir kilobaz (kb) bölgesi, 20 prob çifti tarafından hedeflenir ve ön amplifikatör, amplifikatör ve etiket probu ile sıralı hibridizasyon için moleküler bir iskele oluşturur. Bu nedenle, nükleik asit molekülü başına 8000 floresan etiketin teorik verimine yol açabilir, bu da tek moleküllerin tespitini ve geleneksel FISH yaklaşımları^7'ye göre büyük gelişmeler sağlar (bDNA sinyal amplifikasyonunun şeması için Şekil 1A'ya bakınız). Çoklanmış ISH için problar kurmak üzere her hedef probun farklı bir renk kanalında (C1, C2 veya C3) olması gerekir. Farklı renk kanallarına sahip bu hedef problar, farklı 14 tabanlı kuyruk dizilerine sahiptir. Bu kuyruk dizileri, farklı floresan problarla farklı sinyal amplifikatörlerini bağlayacak ve böylece birden fazla hedef arasında kolay spektral farklılaşmayı mümkün kılacaktır. Sunulan Protokolde, Adım 9'daki Tablo 4, hedef probların floresan olarak etiketlenmesi hakkında daha fazla bilgi sağlar. Ek olarak, Şekil 2 ve Şekil 3, HIV-1 ve HTLV-1 enfeksiyonlarını takiben çoklu viral nükleik asit hedeflerinin spesifik floresan etiketlemesini elde etmek için uygun Amplifikatör 4-FL (A, B veya C) (floresan probu ve son hibridizasyon adımı) 'nı nasıl seçtiğimize dair örnekler sunmaktadır.

RNA, DNA ve proteinlerin eşzamanlı floresan görselleştirmesinin çeşitli uygulamalarını gösterdik ve yüksek uzaysal zamansal çözünürlük ^3,4,5 ile virüs replikasyonunun kritik aşamalarını gözlemledik. Örneğin, viral RNA, sitoplazmik ve nükleer DNA ve proteinin eşzamanlı tek hücreli görselleştirmesi, nükleer girişten önce sitoplazmada RNA içeren çekirdekleri takip etmek ve proviral DNA^3'ün entegrasyonu da dahil olmak üzere HIV-1 enfeksiyonu sırasındaki önemli olayları görselleştirmemize izin vermiştir. Ayrıca konakçı faktörlerin ve ilaç tedavisinin viral enfeksiyon ve replikasyon üzerine etkilerini karakterize etmek için MICDDRP uyguladık ^4,5. Ukah ve ark.'da, HIV transkripsiyonunu ve gecikme tersine çevirmesini görselleştirmek için farklı gecikme tersine çevirici ajanlarla tedavi edilen gecikmeli hücre modellerinde HIV-1 transkripsiyonunun reaktivasyonunu izledik⁴. Ek olarak, MICDDRP, küçük molekül tedavisine veya konakçı faktörü kısıtlamasına atfedilen antiviral inhibisyonla ilişkili fenotipik değişiklikleri görselleştirmemize izin verebilir. Yaklaşımımızın sağlamlığına ve geniş uygulanabilirliğine kavramın bir kanıtı olarak, sadece insan immün yetmezlik virüsünde (HIV)-1'de değil, aynı zamanda insan T-lenfotropik virüsünde (HTLV)-1, hepatit B virüsünde (HBV), hepatit C virüsünde (HCV) enfeksiyonu takip etmek için viral nükleik asidi etkili bir şekilde etiketlemek için protokolümüzün modifikasyonlarını kullanabileceğimizi gösterdik. Zika virüsü (ZIKV) ve influenza A virüsü (IAV). HIV-1 yaşam döngüsü hem viral DNA hem de RNA türlerinden oluştuğundan, HIV-1 replikasyon kinetiğini takiben MICDDRP optimizasyonumuzun çoğunu gerçekleştirdik. Bununla birlikte, ek olarak, viral transkripsiyon ve replikasyonu izlemek için ZIKV, IAV, HBV ve HCV gibi virüslerde her iki duyu (+) ve antisens (-) sarmallılığın farklı viral RNA transkriptlerinin sentezini izleyebileceğimizi gösterdik 3,4,5,6. Çalışmalar, çeşitli viral süreçlerin mekanik anlayışını geliştirmeyi ve bu floresan görüntüleme teknolojisini çok çeşitli hücresel modellere uygulamak için bir kılavuz görevi görmeyi amaçlamaktadır.

Protokol

1. Kapak kapakları veya oda slaytları üzerindeki tohum hücreleri (Süspansiyon vs Yapışkan Hücreler) (sunulan protokol kapakları kullanır).

1. Süspansiyon hücrelerinin tohumlanması
   1. Poli-D-lizin (PDL) kaplı örtü kızaklarını hazırlayın (süspansiyon hücrelerinin örtü kaymasına yapışmasını kolaylaştırır) önce 5 dakika boyunca etanol (EtOH) içindeki örtü kaymalarını inkübe ederek (örtü kaymalarını sterilize eder ve herhangi bir kalıntıyı giderir). Daha sonra, oda sıcaklığında (RT) 30 dakika (dak) boyunca PDL'de (20 μg / mL) örtüleri inkübe etmeden önce fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 2x yıkayın.
   2. PDL'yi çıkarın ve PBS'de 2 kat yıkayın. Pelet hücreleri (istenen görüntüleme koşullarına göre daha önce enfekte edilmiş / tedavi edilmiş) ve 50 μL PBS'de 10⁶hücreyi yeniden askıya alır. Cam üzerinde (PDL kaplı) 50 μL hücre tespit edin ve RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
2. Yapışkan hücrelerin tohumlanması
   1. Steril örtü üzerindeki kültür hücreleri, 6 kuyucuklu tabağa yerleştirilir ve hücreleri viral parçacıklarla enfekte eder veya ilgilenilen bileşikle tedavi eder. Görüntüleme deneyleri için numune hazırlamadan önce hücrelerin% 50-70 akıcılığa ulaşmasına izin verin.

2. Hücresel fiksasyon: Floresan görüntüleme çalışmaları için hücresel morfolojiyi korumak

NOT: Hücresel fiksasyondan önce RT'de %4 PFA ve PBS'yi en az 30 dakika tutun.

1. Hücresel ortamı aspire edin, PBS'de kapak kapaklarındaki hücreleri 3 kat yıkayın ve hücreleri 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyin. PFA'yı aspire edin ve hücreleri PBS 2x'te yıkayın.
   NOT: Deneyci deneye başka bir tarihte devam etmek isterse, hücreler artık kurutulabilir ve saklanabilir. Sabit hücreler depolamadan önce EtOH'de dehidre edilebilir.
   1. Hücresel fiksasyondan sonra yıkamayı takiben PBS'yi çıkarın ve 500 μL% 50 EtOH (suda v / v) ile değiştirin. RT'de 5 dakika boyunca kuluçkaya yatın.
   2. %50 EtOH'yi çıkarın ve 500 μL %70 EtOH ile değiştirin. RT'de 5 dakika boyunca kuluçkaya yatın.
   3. %70 EtOH'yi çıkarın ve 500 μL %100 EtOH ile değiştirin. RT'de 5 dakika boyunca kuluçkaya yatın.
   4. % 100 EtOH'yi çıkarın ve% 100 EtOH ile değiştirin.
      NOT: Susuz hücreler 6 ay boyunca -20 °C'de saklanabilir. EtOH'nin buharlaşmasını önlemek için depolamadan önce plakaları bant veya parafilm ile kapatın.
   5. Hücrelerin/virüslerin çoklanmış floresan etiketlemesine geçmek için hücreleri rehidratlayın.
   6. % 100 EtOH'yi çıkarın ve% 70 EtOH'nin 500 μL'si ile değiştirin. RT'de 2 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: Hücrelerin hiçbir zaman kurumasına izin vermeyin. Tüm hücreleri batırmak için her zaman yeterli çözelti kullanın.
   7. %70 EtOH'yi çıkarın ve 500 μL %50 EtOH ile değiştirin. RT'de 2 dakika boyunca inkübe edin.
   8. % 50 EtOH'yi çıkarın ve 1x PBS ile değiştirin.
      NOT: Proteaz seyreltme, hibridizasyon probları ve yıkama tamponunu proteaz tedavisi (Adım 4) ve hedef prob uygulamasından (Adım 5) önce hazırlayın. Reaktif hazırlama ile ilgili özel talimatlar, ilgili her adımın başında sunulmaktadır.

Reaktif	Diğer Notlar
Proteaz çözeltisi	1X PBS'de hazırlanın
Hedef oligonükletodie probu(ları)	Hibridizasyon tamponunda seyreltin
Yıkama tamponu	Hedef hibridizasyon adımlarını izleyerek yıkarlar
Hibridizasyon tamponu	Tablo 3'te sunulan tarif

Tablo 1: MICDDRP protokolündeki anahtar reaktifler.

3. Hücre geçirgenliği: Büyük moleküllerin (antikorlar, nükleik asit hibridizasyon probları) girişi için hücre ve hücresel organellere erişimi arttırır

1. Hücresel fiksasyon veya rehidrasyondan sonra 1x PBS'yi çıkarın ve 1x PBS'de 500 μL% 0.1 (v / v) Ara-20 ile değiştirin. RT'de 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Tek tek değiştirin. 500 μL 1x PBS ile bir kez yıkayın ve taze 1x PBS ekleyin.

4. Hibridizasyon verimliliğini artırmak için sabit viral/hücresel nükleik asitten nükleik asit bağlayıcı proteinleri uzaklaştırmak için cam slayt üzerinde coverslip immobilizasyonu ve proteaz işlemi

NOT: Hücresel geçirgenlik sırasında seyreltilmiş Proteaz III (Malzeme Tablosundaki reaktifin özelliklerine bakınız) çözeltisini hazırlayın. Proteazın geçirgenlikten önce 10 dakika boyunca RT'ye ulaşmasına izin verin.

1. Sterilize edilmiş bir cam slaytın üzerine küçük bir damla oje yerleştirin. Arkanızı kurutun (hücre tabakası olmayan taraf) ve kapak kaymasının kenarını oje damlasının üzerine, yapıştırılmış hücrelerin yukarı baktığı tarafı olacak şekilde yerleştirin. Kurumayı önlemek için hareketsiz kapak kapağına birkaç damla PBS ekleyin.
   1. Hidrofobik bariyer kalemi (reaktifleri hücreler üzerinde lokalize tutan su itici kalem) kullanarak slayta yapıştırılan kapak kaymasının çevresine bir daire (kapak kaymasından yaklaşık 3 mm uzaklıkta) çizin.
2. Protease III'ü 1x PBS (100 μL/coverslip) içinde seyreltin.
   NOT: Proteaz konsantrasyonunun, ampirik optimizasyon yoluyla hücre tipleri, problar veya hedef nükleik asit (ler) deki farklılıklara bağlı olarak ayarlanması gerekebilir ( Bkz. Tartışma). Farklı viral sistemlerde en verimli RNA / DNA etiketlemesi için, aşağıdaki Tablo 2'de sunulan aşağıdaki seyreltmelerle, (1 ila 2 ) - (1 ila 15) (proteaz ila 1x PBS) arasında değişen seyreltmelerle başarı elde ettik.

Prob Hedefleri	1X PBS'de Proteaz Seyreltme (Proteaz III - 1X PBS)
HIV-1 DNA/RNA	1 ila 5
HTLV-1 DNA/RNA	1 ila 5
HBV pgRNA ve toplam HBV RNA	1 ila 15
IAV RNA	1 ila 15
ZIKV RNA	1 ila 2

Tablo 2: PBS'de viral nükleik asit hibridizasyonu için proteaz III dilüsyonları.

3. İmmobilizasyonu takiben 1x PBS'yi kapak kapağı üzerinde boşaltın ve seyreltilmiş Proteaz III'ü uygulayın.
4. Nemlendirilmiş bir fırında 40 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
5. Dekant proteaz çözeltisi ve daldırma slaytları 1x PBS'de. RT'de 2 dakika boyunca sallanan bir tabakla çalkalayın. Yeni 1x PBS ile tekrar yıkayın.
   1. Sadece DNA tespiti için, numuneleri her biri 2 dakika boyunca nükleaz içermeyen suyla üç kez yıkayın, ardından 37 ° C'de 30 dakika boyunca PBS'de seyreltilmiş 5 mg / mL RNaz A ile inkübasyon yapın.
   2. Decant RNase Bir çözelti ve ultra saf su ile 2 dakika boyunca 3x yıkayın. Hedef probun (lar) ın ISH ile devam edin.
      NOT: Hibridizasyon tamponu, sunulan sonuçlar için vRNA boyama verimliliğini etkilemeden vDNA tespitini geliştirir (Temsili Sonuçlar). DNA Kanal 1 (C1) probları 1:1'i hibridizasyon probu ile seyreltin. RNA C2 ve C3 problarını hibridizasyon tamponunda seyreltin. Görüntüleme çalışmalarımızda kullanılan C2 ve C3 probları 50X çözeltilerdedir (1:50; hibridizasyon tamponuna hedef prob).
6. Aşağıdaki adım adım prosedürü izleyerek nükleaz içermeyen suda hibridizasyon tamponunu hazırlayın:
   1. 15 mL'lik bir tüpte, 700 μL nükleaz serbest su, 300 μL% 50 (ağırlık / hacim (w / v)) dekstran sülfat, 300 μL 5 M NaCl, 125 μL 200 mM sodyum sitrat (pH 6.2) ve 375 mg (toz) etilen karbonat ekleyin.
   2. Etilen karbonatı çözmek için bir vorteks kullanarak iyice karıştırın (tüm tozun çözündüğünden ve berrak bir çözelti olduğundan emin olun).
   3. Ara-20'nin 25 μL'si (hacim/hacim (v/v)) %10 (hacim/hacim (v/v)) ve 2,5 mL'yi (2x çözelti) tamamlamak için yeterli nükleaz içermeyen su ekleyin.
      NOT: Sunulan hibridizasyon tamponunun tarifi aşağıdaki Tablo 3'te bulunabilir. Çözüm bir hafta boyunca kararlıdır. Çözeltinin köpürmesini önlemeye dikkat ederken, Tween-20 deterjanının yeterli miktarda karıştırıldığından emin olun.

Reaktif	Stok Konsantrasyonu	Ek Notlar
Nükleaz içermeyen su	NA
Dextran sülfat	%50 (w/d)	Çok viskoz
Sodyum klorür	5 milyon
Sodyum sitrat (pH 6.2)	200 mM	4 °C'de depolayın
Etilen karbonat	NA	Toz
Ara-20	%10 (d/d)

Tablo 3: Reaktiflerin hibridizasyon tampon listesi.

5. DNA / RNA hedef hibridizasyon probları ile inkübasyon: Hedef oligonükleotid probları, ilgilenilen bölgelere bağlanır ve ön amplifikatörlerin, amplifikatörlerin ve floresan probların bağlanması için moleküler bir iskele oluşturur.

NOT: DNA / RNA problarını 40 ° C'de 10 dakika boyunca (Hücre Geçirgenliği sırasında) ısıtın ve RNaz tedavisi dahil değilse en az 10 dakika boyunca RT'ye soğutun. Hedef prob hibridizasyonundan önce RNaz tedavisi veya daha fazla numune tedavisi gerekiyorsa, buna göre probları ısıtın. Isındıktan sonra C2 ve C3 problarını döndürün ve hibridizasyon tamponunda seyreltin. Seyreltmeden sonra, C2 ve C3 probları kısaca ısıtılabilir. Sıcak 50x yıkama tamponu (Daha fazla ayrıntı için Malzeme Tablosuna bakınız) 40 ° C'de 10-20 dakika boyunca ve moleküler biyoloji sınıfı suda 1x'e kadar seyreltin.

1. Hibridizasyon prob(lar)ının eklenmesinden önce 10 dakika boyunca 67 °C'de 200 μL hibridizasyon tamponunu inkübe edin. Probu hibridizasyon tamponunda seyreltin ( Tablo 2'de listelenen tarif). 50 μL/coverslip ekleyin.
2. Nemlendirilmiş fırında 40 °C'de 2 saat (s) boyunca inkübe edin. Dekant problar ve daldırma kızakları 1x yıkama tamponuna. RT'de 2 dakika boyunca tabağı sallayarak çalkalayın. Yeni 1x yıkama tamponu ile tekrar yıkayın.

6. Amplifikatör (Amper) 1-FL Hibridizasyonu: Hedef DNA / RNA problarının kuyruk dizisine tamamlayıcı olan ön amplifikatörün eklenmesi (Adım 5)

NOT: Amplifikatörler kullanılmadan önce RT'de olmalıdır. Her bir amplifikatörü kullanmadan 30 dakika önce buzdolabından çıkarın ve RT'deki bankta bırakın.

1. Slaytları 1x yıkama tamponundan çıkarın ve fazla sıvıyı gidermek için dokunun / emer.
2. Kapak kapağına 1 damla Amper 1-FL ekleyin. Nemlendirilmiş fırında 40 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
3. Decant Amp 1-FL ve 1x yıkama tamponuna daldırın. RT'de çanağı 2 dakika sallayarak çalkalayın. Yeni 1x yıkama tamponu ile yıkamayı tekrarlayın.

7. Amper 2-FL Hibridizasyonu: Ön amplifikatörlere konyak tanıma sırasına sahip sinyal amplifikatörü ile inkübasyon (Amp 1-FL)

1. Slaytları 1x yıkama tamponundan çıkarın ve fazla sıvıyı gidermek için dokunun / emer.
2. Kapak kapağına 1 damla Amp 2-FL ekleyin. Nemlendirilmiş fırında 40 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
3. Decant Amp 2-FL ve 1x yıkama tamponuna daldırın. RT'de çanağı 2 dakika sallayarak çalkalayın. Yeni 1x yıkama tamponu ile yıkamayı tekrarlayın.

8. Amper 3-FL Hibridizasyon: İkinci sinyal amplifikatörü ile inkübasyon

1. Slaytları 1x yıkama tamponundan çıkarın ve fazla sıvıyı gidermek için dokunun / emer.
2. Kapak kapağına 1 damla Amper 3-FL ekleyin. Nemlendirilmiş fırında 40 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
3. Decant Amp 3-FL ve 1x yıkama tamponuna daldırın. RT'de çanağı 2 dakika sallayarak çalkalayın. Yeni 1x yıkama tamponu ile yıkamayı tekrarlayın.

9. Amper 4-FL Hibridizasyon: Floresan etiket ve son hibridizasyon adımı

NOT: İlk olarak, hedef probun (lar) kanallarına göre uygun Amp 4 (A, B veya C) - FL'yi seçmek için Tablo 4'e bakın. İlgilenilen DNA / RNA'yı etiketlemek için hangi Amp 4-FL'nin gerekli olduğunu değerlendirin. Aşağıdaki tabloda bir örnek verilmiştir:

	A	B	C
DNA Kanal 1 (C1)	488	550	550
DNA/RNA Kanal 2 (C2)	550	488	647
RNA Kanal 3 (C3)	647	647	488

Tablo 4: Çoklanmış ISH için Amp 4 (A, B veya C)-FL floresan probu seçimi.

NOT: Çoğullanmış FISH (birden fazla hedef) için, doğru Amp 4 (A, B veya C)- FL'yi seçmek, ilgilendiğiniz hedefi (hedefleri) doğru şekilde etiketlemek için kritik öneme sahiptir. Hedef problar (Adım 5), seçilen Amp 4-FL'ye bağlı olarak ilgili floresan etiketlerini (Alexa 488, Atto 550 veya Alexa 647) dikte eden farklı renk kanallarına (C1, C2 veya C3) sahiptir. Çoklanmış görüntüleme için florofor kombinasyonlarının seçilmesine ilişkin örnekler Şekil 2 ve Şekil 3 açıklamalarında verilmiştir. Ek bir örnek olarak, Amp 4B-FL seçimi, DNA C1 problarını Atto 550 ile ve RNA C3 problarını Alexa 647 ile seçici olarak etiketleyecektir.

1. Slaytları 1x yıkama tamponundan çıkarın ve fazla sıvıyı gidermek için dokunun / emer.
2. Kapak kapağına 1 damla Amper 4-FL ekleyin. Nemlendirilmiş fırında 40 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
   NOT: Adım 9.2'yi takiben, örnekleri ışıktan korunarak kapalı tutun.
3. Decant Amp 4-FL ve 1x yıkama tamponuna daldırın. RT'de 2 dakika boyunca tabağı sallayarak çalkalayın. Yeni 1x yıkama tamponu ile tekrar yıkayın. 1x PBS (2 dakika) ile yıkayın ve PBS'de saklayın.

10. Protein immün boyama: İlgilenilen proteinleri etiketlemek için

1. PBS'yi boşaltın ve kapak kapağına 200 μL blokaj tamponu ekleyin (%1 BSA ile, %10 v/v FBS ile PBS'de %0,1 v/v Ara-20 (PBST)). RT'de 1 saat inkübe edin.
2. Dekant bloke edici tampon ve PBST'de seyreltilmiş 200 μL primer antikor + % 1 w / v BSA uygulayın. RT'de 1 saat inkübe edin.
3. Slaytı PBST ile RT'de sallayarak 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.
4. PBST'de RT'de 1 saat boyunca tercih edilen sekonder antikoru + BSA ile% 1 uygulayın.
5. Slaytı PBST ile RT'de sallayarak 10 dakika yıkayın.

11. Nükleer boyama: İmmün boyama sonrası karşı leke çekirdekleri

1. PBST'yi boşaltın ve RT'de 1 dakika boyunca DAPI veya nükleer leke seçin.
2. Slaytı PBS ile RT'de sallayarak 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.

12. Montaj

1. Yeni steril cam sürgü üzerine 1 damla antifade çözeltisi (örneğin, Uzatma Altın) yerleştirin (İlk olarak, EtOH ile kaydırağı temizleyin ve cam üzerinde kalıntı kalmamasını sağlamak için kurumaya bırakın). Aynı uçla, antifade çözeltisi damlasını, yaklaşık olarak kapak kaymasının büyüklüğünde bir alanı kaplayacak şekilde yayın.
   NOT: Antifade çözeltisi çok viskozdur ve pipet uygulaması zor olabilir. Pipetlemeden önce ucun 200 μL'lik bir uçtan kesilmesi bu sorunları hafifletebilir.
2. Slayttan hücre örneği içeren kapak kaymasını çıkarın ve forseps ve PBS kullanarak arkadaki artık ojeyi çıkarmak için PBS'ye batırın. Kuru forseps ve bir Kimwipe kullanarak kapak kaymasının arkası.
3. Antifade çözeltisinin damlasına hafifçe yerleştirilmiş örtü kayması, damla üzerine kapak kaymasının numune tarafını (hücre tabakası ile yan taraf) yerleştirin).
4. Numunelerin gece boyunca kurumasını bekleyin.

13. Görüntüleme

1. Epifloresan mikroskoplu görüntü.

Sonuçlar

MICDDRP'nin bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. DNA ve RNA'nın etiketlenmesini immün boyama izler. Dallanma yükselteçlerinin kullanımı sinyali arttırır ve tek nükleik asit moleküllerinin tespit edilmesini sağlar.

Şekil 1: MICDDRP şeması ve adım adım iş akışı. (A) bDNA sinyali, viral DNA (1) ve...

Tartışmalar

RNA, DNA ve proteinin eşzamanlı olarak görselleştirilmesi genellikle kapsamlı optimizasyon gerektirir. Yaygın olarak kullanılan iki yöntem 5-etinil-2-deoksiüridin (EdU) etiketleme ve DNA FISH'tir. EdU etiketlemesi, viral DNA ve proteini aynı anda görselleştirmek için uygulanmıştır, çünkü EdU yeni ortaya çıkan DNA'ya dahil edilir ve daha sonra tıklama kimyası yoluyla azid içeren floresan boyalarla etiketlenir. Bu nedenle EdU etiketlemesi, DNA virüslerinin veya virüslerin yerel virüs rep...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% PFA
50% dextran sulfate	Amreso	198	For DNA hybridization buffer
50X wash buffer	ACD Bio	320058
6-well plates
Amplifier 1-FL	ACD Bio
Amplifier 2-FL	ACD Bio
Amplifier 3-FL	ACD Bio
Amplifier 4-FL	ACD Bio		Consult Amp-4 table in protocol
Anti-HCV NS5a antibody	Abcam	ab13833	Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4
Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody	NIH AIDS Reagent Program	3537
Anti-Mov10 antibody	Abcam	ab80613	Rabbit polyclonal
Anti-PB1 antibody	GeneTex	GTX125923	Antibody against flu protein
Bovine serum albumin			Blocking reagent for immunostaining
Cell media with supplements			Media appropriate for cell model
Coverslips
DAPI	ACD Bio		Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio)
Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS)	Gibco	14190250	No calcium and magnesium
Ethylene carbonate	Sigma	E26258
Fetal bovine serum (FBS)			Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS)
Fisherbrand colorfrost plus microscope slides	Fisher Scientific	12-550-17/18/19	Precleaned
HCV-GT2a-sense-C2 probe	ACD Bio	441371	HCV(+) sense RNA probe
HIV-gagpol-C1	ACD Bio	317701	HIV-1 cDNA probe
HIV-nongagpol-C3	ACD Bio	317711-C	HIV-1 RNA probe
HybEZ hybridization oven	ACD Bio	321710/321720
ImmEdge hydrophobic barrier pen	Vector Laboratories	H-4000
Nail polish			For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment
Nuclease free water	Ambion	AM9937
Poly-d-lysine (PDL)			Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes
Probe diluent	ACD Bio	300041	For diluting RNA C2 or C3 probes
Prolong gold antifade	Invitrogen	P36930
Protease III	ACD Bio	322337
RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP	ACD Bio	436221
RNase A	Qiagen
Secondary antibodies
Slides
Sodium chloride			For DNA hybridization buffer
Sodium citrate, pH 6.2			For DNA hybridization buffer
Tween-20			For DNA hybridization buffer and PBS-T
V-HBV-GTD	ACD Bio	441351	Total HBV RNA
V-HBV-GTD-01-C2	ACD Bio	465531-C2	HBV pgRNA probe
V-HCV-GT2a probe	ACD Bio	441361	HCV(-) sense RNA probe
V-HTLV-HBZ-sense-C3	ACD Bio	495071-C3	HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ
V-HTLV1-GAG-C2	ACD Bio	495051-C2	HTLV-1 DNA probe
V-HTLV1-GAG-POL-sense	ACD Bio	495061	HTLV-1 (+) sense RNA probe
V-Influenza-H1N1-H5N1-NP	ACD Bio	436221	IAV RNA probe
V-ZIKA-pp-O2	ACD Bio	464531	Zika(+) sense RNA probe
V-ZIKA-pp-O2-sense-C2	ACD Bio	478731-C2	Zika(-) sense RNA probe