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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Es wird eine Methodik zur Bestimmung des Bestäubungsbedarfs bei japanischen Pflaumen-Hybriden beschrieben, die Feld- und Laborbestäubungen und Beobachtungen von Pollenröhren unter der Fluoreszenzmikroskopie mit der Identifizierung von S-Genotypen mittels PCR und der Überwachung der Blüte für die Auswahl von Bestäubern kombiniert.

Zusammenfassung

Die üblicherweise angebauten japanischen Pflaumensorten sind interspezifische Hybriden, die aus Kreuzungen zwischen dem ursprünglichen Prunus salicina und anderen Prunus-Arten stammen. Die meisten Hybriden weisen eine gametophytische Selbstinkompatibilität auf, die durch einen einzelnen und hochpolymorphen S-Locus gesteuert wird, der mehrere Allele enthält. Die meisten kultivierten Hybriden sind selbstinkompatibel und benötigen Pollen von einem kompatiblen Spender, um ihre Blüten zu befruchten. Die Etablierung von Bestäubungsanforderungen in japanischen Pflaumen wird aufgrund der hohen Anzahl neuer Sorten mit unbekanntem Bestäubungsbedarf immer wichtiger. In dieser Arbeit wird eine Methodik zur Bestimmung des Bestäubungsbedarfs in japanischen Pflaumen-Hybriden beschrieben. Die Selbst(in)Verträglichkeit wird durch Handbestäubungen sowohl im Feld als auch im Labor bestimmt, gefolgt von der Überwachung der Pollenröhrenverlängerung mit Fluoreszenzmikroskopie und der Überwachung der Fruchtreifung im Feld. Die Auswahl der Bestäubersorten wird bewertet, indem die Identifizierung von S-Genotypen durch PCR-Analyse mit der Überwachung der Blütezeit im Feld kombiniert wird. Die Kenntnis der Bestäubungsanforderungen von Sorten erleichtert die Auswahl von Sorten für die Gestaltung neuer Obstgärten und ermöglicht die frühzeitige Erkennung von Produktivitätsproblemen im Zusammenhang mit Bestäubungsmangel in etablierten Obstgärten.

Einleitung

Japanische Pflaume (Prunus salicina Lindl.) stammt aus China1. Im19. Jahrhundert wurde diese Ernte von Japan in die Vereinigten Staaten eingeführt, wo sie mit anderen nordamerikanischen diploiden Pflaumen gekreuzt wurde2. Im20. Jahrhundert wurden einige dieser Hybriden in gemäßigte Regionen auf der ganzen Welt verbreitet. Heutzutage bezieht sich der Begriff "japanische Pflaume" auf eine breite Palette von interspezifischen Hybriden, die aus Kreuzungen zwischen der ursprünglichen P. salicina und bis zu 15 anderen diploiden Prunus spp.3,4,5abgeleitet sind.

Die japanische Pflaume weist wie andere Arten der Rosaceae-Familie eine gametophytische Selbstinkompatibilität (GSI) auf, die von einem einzelnen und hochgradig polymorphen S-Locuskontrolliert wird, der mehrere Alleleenthält 6. Der S-Locus enthält zwei Gene, die für eine im Stempel exprimierte Ribonuklease(S-RNase)und ein im Pollenkorn exprimiertes F-Box-Protein (SFB)kodieren 7. In der Selbstinkompatibilitätsreaktion, wenn das im Pollenkorn (haploid) exprimierte S-Allel mit einem der beiden im Stempel (diploid) exprimierten ist, wird das Wachstum des Pollenrohrs über den Stil aufgrund des Abbaus der Pollenröhren-RNA durch die Wirkung der S-RNase8gestoppt. Da dieser Prozess die Befruchtung des weiblichen Gametophyten in der Eizelle verhindert, fördert GSI die Auskreuzung zwischen den Sorten.

Obwohl einige japanische Pflaumensorten selbstkompatibel sind, sind die meisten derzeit angebauten Sorten selbstinkompatibel und benötigen Pollen von interkompatiblen Spendern, um ihre Blüten zu düngen3. Bei Steinobstarten der Gattung Prunus wie Mandel9,Aprikose10,11,12 und Süßkirsche13können die Bestäubungsanforderungen von Sorten durch verschiedene Ansätze festgestellt werden. Die Selbst(in)kompatibilität kann durch Selbstbestäubung von Blüten im Feld und anschließende Überwachung des Fruchtansatzes oder durch semi-in vivo Selbstbestäubungen unter kontrollierten Bedingungen in einem Labor und die Beobachtung von Pollenröhrchen unter dem Mikroskop bestimmt werden14,15,16,17,18 . Inkompatibilitätsbeziehungen zwischen Sorten können durch Kreuzbestäubungen im Feld oder im Labor unter Verwendung von Pollen der potenziellen Bestäubersorte und durch die Identifizierung von S-Allelenjeder Sorte durch PCR-Analyse bestimmt werden14,15,16,19,20,21,22 . Bei Arten wie Süßkirsche oder Mandel kann die Selbstverträglichkeit auch durch die Identifizierung bestimmter S-Allele beurteilt werden, die mit der Selbstkompatibilität assoziiert sind, wie S4' in Süßkirsche13 oder Sf in Mandel23.

Mehrere Pflaumenzuchtprogramme aus den wichtigsten Erzeugerländern setzen eine Reihe neuer Sorten2,14frei, von denen viele unbekannte Bestäubungsanforderungen haben. In dieser Arbeit wird eine Methodik zur Bestimmung des Bestäubungsbedarfs in japanischen Pflaumen-Hybriden beschrieben. Die Selbst(in)Verträglichkeit wird durch Selbstbestäubungen sowohl im Feld als auch im Labor bestimmt, gefolgt von Beobachtungen von Pollenröhren unter der Fluoreszenzmikroskopie. Die Selektion von Bestäubersorten kombiniert die Identifizierung von S-Genotypen durch PCR-Analyse mit der Überwachung der Blütezeit im Feld.

Protokoll

1. Handbestäubung im Feld

  1. Pollengewinnung
    1. Um Pollen zu erhalten, sammeln Sie Blütenknospen im Stadium D24gemäß Stadium 57 auf der BBCH-Skala25,26.
      HINWEIS: Bei japanischen Pflaumen sind mehr Blütenknospen notwendig als bei anderen Prunus-Arten, da ihre Staubbeutel weniger Pollen produzieren.
    2. Entfernen Sie die Staubbeutel mit einem Kunststoffnetz (2 mm x 2 mm Porengröße) und legen Sie sie bei Raumtemperatur für 24 h auf Papier, bis die Staubbeutel dehiszen.
    3. Die Pollenkörner durch ein feines Netz (0,26 mm x 0,26 mm Porengröße) sieben und in einem 10 mL Glasröhrchen mit einer Kappe bei 4 °C bis zum Gebrauch konservieren.
  2. Bestäubung entmannter Blüten
    1. Wenn zwischen 10% und 20% der Blüten geöffnet sind, wählen und beschriften Sie mehrere Zweige. Entfernen Sie offene Blüten und junge Knospen und lassen Sie nur Blütenknospen im Stadium D24, gemäß Stadium 57 auf der BBCH-Skala25,26.
    2. Entfernen Sie die Blütenblätter, Kelchblätter und Staubblätter zwischen 800 und 1.000 Blütenknospen pro Behandlung entweder mit Fingernägeln oder einer Pinzette.
    3. Bestäuben Sie die Stempel mit Hilfe eines feinen Pinsels 24 h nach der Entmannung von Hand. Einige Zweige enthalten die Hälfte der Stempel mit Pollen der gleichen Sorte und die andere Hälfte mit kompatiblen Pollen aus anderen Sorten als Kontrolle. Achten Sie darauf, die Fingerspitze oder den Pinsel nicht mit Pollenkörnern anderer Sorten zu kontaminieren.
    4. Zeichnen Sie die wöchentliche Anzahl von Blüten und sich entwickelnden Früchten auf, um das Fruchttropfenmuster zu charakterisieren und den endgültigen Fruchtansatz bei jeder Bestäubungsbehandlung zu quantifizieren.
  3. Ergänzende Bestäubung im Feld
    1. Schließen Sie einige Tage vor dem Öffnen der ersten Blüten ausgewählte Bäume in einen 0,8 mm maschen Käfig ein, um die Ankunft bestäubender Insekten zu vermeiden.
    2. Wenn 10% -20% der Blüten geöffnet sind, wählen und beschriften Sie mehrere Zweige pro Bestäubungsbehandlung, so dass 1.000-1.500 Blüten pro Behandlung verbleiben.
    3. Am nächsten Tag, wenn die Blüten geöffnet sind, bestäuben Sie jede Blume mit Hilfe eines Pinsels mit dem entsprechenden Pollen (Pollen von derselben Sorte zur Selbstbestäubung und von anderen kompatiblen Sorten als Kreuzbestäubungskontrolle).
    4. Bestäuben Sie jeden zweiten Tag, bis sich alle Blüten öffnen.
    5. Zeichnen Sie die wöchentliche Anzahl von Blüten und sich entwickelnden Früchten von der Anthese bis zur Ernte auf, um das Fruchttropfenmuster zu charakterisieren und den endgültigen Fruchtansatz bei jeder Bestäubungsbehandlung zu quantifizieren.

2. Handbestäubung im Labor

  1. Sammle 50–100 Blüten im Stadium D24, gemäß Stadium 57 auf der BBCH-Skala25,26.
  2. Im Labor 30 Blüten pro Behandlung entmannen (Selbst- und Fremdbestäubung).
    HINWEIS: Die Entmannung sollte sorgfältig durchgeführt werden, um Schäden an den Stempeln zu vermeiden.
  3. Machen Sie einen frischen Schnitt auf der Basis jedes Blumenstiels unter Wasser, bevor Sie ihn auf ein Stück nassen Floristenschaum legen (ein Stück Schaum für jede Bestäubungsbehandlung).
  4. Jeden Stempel 24 h später mit einem feinen Pinsel mit zuvor gesammeltem Pollen von Hand bestäuben (siehe Abschnitt 1.1). Bestäuben Sie einen Satz Stempel mit Pollen aus derselben Sorte und den anderen Satz mit Pollen aus einer kompatiblen Sorte als Kontrolle.
  5. Lassen Sie die bestäubten Stempel 72 h nach der Bestäubung bei Raumtemperatur stehen. Der Blütenschaum sollte kontinuierlich mit Wasser benetzt werden.
  6. Die Stempel werden in einer fixierenden Lösung von Ethanol/Essigsäure (3:1) für mindestens 24 h bei 4 °C fixiert. Ersetzen Sie das Fixiermittel durch 75% Ethanol. Proben können in dieser Lösung bei 4 °C bis zur Verwendung27konserviert werden.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Proben vollständig in die Lösung eingetaucht sind.

3. Mikroskopische Beobachtungen

  1. Bewertung der In-vitro-Pollenkeimung
    1. Um das Pollenkeimmedium zu erarbeiten, lösen Sie 25 g Saccharose auf 250 ml destilliertem Wasser auf, fügen Sie dann 0,075 g Calciumnitrat [Ca(NO3)2] und 0,075 g Borsäure (H3BO3)hinzu.
    2. 2 g Agar in die Lösung geben und mischen, bis sie vollständig gelöstist 28.
    3. Um das Medium zu sterilisieren, autoklavieren Sie es bei 120 ° C für 20 minuten. Kühlen Sie das Medium ab und verteilen Sie vor der Erstarrung 3 ml pro steriler Petrischale (55 mm x 12 mm) in einer sterilen Laminar-Flow-Haube. Nach mittlerer Erstarrung die in Alufolie eingewickelten Petrischalen bei 4 °C bis zum Gebrauch konservieren.
    4. Verteilen Sie die Pollen jeder zuvor als Pollenspender verwendeten Sorte in den kontrollierten Bestäubungen in zwei Petrischalen und inkubieren Sie sie bei 25 °C für 24 h.
      HINWEIS: Die geimpften Kulturmedien können unmittelbar danach mit der Mikroskopie beobachtet oder bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert werden. Dazu sollten die Petrischalen 24 h vor Mikroskopiebeobachtungen vom Gefrierschrank in den Kühlschrank gewechselt werden.
    5. Um die Pollenkörner zu beobachten, bereiten Sie 1% (v / v) Anilinblaue Lösung vor, die Kalluse färbt. Zunächst wird eine 0,1 N Kaliumphosphat-Tribasislösung(K3PO4)hergestellt, indem 7,97 gK3PO4 in 1.000 mL destilliertem Wasser gelöst werden. Um die 1% (v/v) Anilinblaulösung herzustellen, lösen Sie 1 mL Anilinblau in 100 mL 0,1 NK3PO4auf.
    6. Geben Sie 2–3 Tropfen Anilinblaulösung auf jede Petrischalenplatte und beobachten Sie nach 5 min unter einem UV-Epifluoreszenzmikroskop mit dem Erregerfilter BP340-390 und dem Barrierefilter LP425. Zählen Sie lebensfähige und nicht lebensfähige Pollenkörner in drei Feldern pro Platte, jedes Feld enthält 100-200 Pollenkörner, in zwei Petrischalen für jede Sorte.
  2. Pollenröhrenwachstum
    1. Die fixierten Stempel dreimal mit destilliertem Wasser (je 1 h, insgesamt 3 h) abspülen und bei 4 °C für24h auf 5% (w/v) Natriumsulfit(Na2SO3)überführen. Um diese Lösung herzustellen, lösen Sie 5 g Natriumsulfit in 100 ml destilliertem Wasser auf.
    2. Autoklavieren Sie die Stempel bei 120 °C für 8 min in 5% (w/v) Natriumsulfit, um das Gewebe weicher zu machen.
    3. Zerquetschen Sie erweichte Stempel in einem Tropfen von 1% (v / v) anilinblauer Lösung unter einem Deckglas auf einem Objektträger, um Hornhaut zu färben.
    4. Beobachten Sie das Pollenröhrenwachstum entlang des Stils unter einem Mikroskop mit UV-Epifluoreszenz mit dem Erregerfilter BP340-390 und dem Barrierefilter LP425.

4. Inkompatibilitätsbeziehungen ermitteln

  1. DNA-Extraktion aus Blättern
    1. Um DNA zu extrahieren, sammeln Sie 3-4 junge Blätter jeder Sorte im Feld, vorzugsweise im Frühjahr.
      HINWEIS: DNA kann auch aus reifen Blättern extrahiert werden, aber DNA aus jungen Blättern hat weniger phenolische Verbindungen.
    2. Isolieren Sie DNA mit einem kommerziellen Kit und befolgen Sie das mitgelieferte Protokollkit (siehe Tabelle der Materialien).
    3. Quantifizieren Sie die DNA-Konzentration und bewerten Sie die Qualität der DNA jeder Probe bei 260 nm in einem UV-Vis-Mikrovolumen-Spektralphotometer. Stellen Sie die DNA-Konzentration auf 10 ng/μL ein.
  2. PCR-Bedingungen für die Fragmentamplifikation
    1. Etikettieren Sie 0,2 ml PCR-Röhrchen und -Kappen.
    2. Die PCR-Reagenzien gemäß Tabelle 1 vorbereiten und auf Eis auftauen lassen.
    3. Richten Sie ein Volumen der Mastermischung jedes Primerpaares in einem 1,5 ml Mikroröhrchen entsprechend der Anzahl der Reaktionen plus 10% des Überschusses ein, wobei ein Volumen von 16 μL pro Reaktion berücksichtigt wird. Fügen Sie die Reagenzien in der Reihenfolge in Tabelle 1 hinzu und mischen Sie sie gründlich.
    4. Aliquot 16 μL Mastermischung in jedes 0,2 mL PCR-Röhrchen mit 4 μL DNA-Vorlage oder 4 μL sterilisiertem destilliertem Wasser als Negativkontrolle (C-). Verwenden Sie DNA von Sorten mit bekanntem Genotyp als Positivkontrollen. Vorsichtig mischen, die Reaktionsröhrchen mit den Kappen verschließen und bei 2.000 x g für 30 s zentrifugieren, um das gesamte Volumen am Boden des Reaktionsrohrs aufzufangen.
    5. Legen Sie die Reaktionsröhrchen in den Thermocycler und richten Sie das PCR-Programm mit folgendem Temperaturprofil ein: ein erster Schritt von 3 min bei 94 °C, 35 Zyklen von 1 min bei 94 °C, 1 min bei 56 °C und 3 min bei 72 °C und ein letzter Schritt von 7 min bei 72 °C20.
  3. Elektrophorese und Abschätzung der Fragmentgröße
    1. Zur Herstellung eines 1,7% (w/v) Agarose-Minigels werden 0,68 g Agarose und 40 ml 1x TGU-Puffer in einem 100 mL Erlenmeyerkolben gelöst. Schmelzen Sie die Lösung durch Erhitzen in einer Mikrowelle bei 600 W in Abständen von 30 s, um ein Sieden zu vermeiden.
    2. Lassen Sie die Lösung auf der Bank bleiben, um abzukühlen, und fügen Sie dann 3,5 μL Nukleinsäure-Färbelösung hinzu.
    3. Legen Sie die Gelschale in den Gießständer und legen Sie den ausgewählten Kamm in die Gelform. Stellen Sie sicher, dass Sie genügend Vertiefungen für jedes PCR-Produkt und jede DNA-Leiter haben.
    4. Gießen Sie die Agaroselösung in die Gelform und lassen Sie sie bis zur Polymerisation abkühlen. Entfernen Sie den Kamm des polymerisierten Gels. Legen Sie das Gel in das horizontale Elektrophoresesystem, das genügend 1x FSME-Puffer enthält, um die Oberfläche des Gels zu bedecken.
    5. Laden Sie die erste und letzte Vertiefung mit 2 μL der DNA-Molekulargewichtsleiter (1 kb DNA-Leiter). Belastung 3 μL jedes Produkts der PCR in den anderen Vertiefungen. Schließen Sie die Kammer, schalten Sie die Stromversorgung ein und lassen Sie das Gel 30 Minuten lang bei 100 V laufen.
    6. Beobachten Sie das Gel unter UV-Licht mit einem Gel-Dokumentationssystem. Verwenden Sie die DNA-Molekulargewichtsleiter, um die Größe des amplifizierten Fragments zu bestimmen und es mit den Positivkontrollen zu vergleichen, um die entsprechenden Allele zu identifizieren.

5. Überwachung der Blumentermine

  1. Überwachen Sie die Phänologie verschiedener Bäume jeder Sorte bei der Blüte über verschiedene Jahre. Bestimmen Sie die Länge der Blütezeit von der ersten (ca. 5%) bis zur letzten offenen Blüte (ca. 95%). Die volle Blüte wird berücksichtigt, wenn sich mindestens 50% der Blüten im Stadium F24befinden, gemäß Stadium 65 auf der BBCH-Skala25,26.
  2. Um die Blühdaten von interkompatiblen Sorten zu vergleichen und diejenigen zu bestimmen, die jedes Jahr zur Blütezeit zusammenfallen, erstellen Sie einen Kalender der Blütezeiten mit Daten aus mehreren Jahren.

Ergebnisse

Jede japanische Pflaumenblütenknospe enthält einen Blütenstand mit 1–3 Blüten. Wie bei anderen Steinobstarten besteht jede Blume aus vier Wirbeln: Karpell, Staubblätter, Blütenblätter und Kelchblätter, die an der Basis der Blüte zu einer Tasse verschmolzen sind. Blütenstrukturen sind kleiner als andere Steinfrüchte, mit einem kurzen und zerbrechlichen Stempel, der von den Staubblättern umgeben ist, die eine kleine Menge Pollenkörner enthalten. Bei voller Blüte erscheinen die Blüten jedes Blütenstandes a...

Diskussion

Die hierin beschriebene Methodik für den Bestäubungsbedarf japanischer Pflaumensorten erfordert die Bestimmung der Selbst-(Un-)Kompatibilität jeder Sorte durch kontrollierte Bestäubungen im Feld oder im Labor und die anschließende Beobachtung des Pollenröhrenwachstums mit Fluoreszenzmikroskopie. Die Inkompatibilitätsbeziehungen werden durch die Charakterisierung der S-Allele durch molekulare Genotypisierung hergestellt. Schließlich wird die Auswahl der Bestäuber von der Überwachungsphänologie durchgef...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Diese Forschung wurde vom Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 und RTA2017-00003-00) finanziert. Gobierno de Aragón – Europäischer Sozialfonds, Europäische Union (Grupo Consolidado A12-17R) und Junta de Extremadura – Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero wurde durch ein Stipendium des Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología von Mexiko (CONACYT, 471839) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic Acid GlacialPanreac131008.1611
AgariNtRON Biotechnology25999
Aniline blueDifco8504-88
Boric Acid (H3BO4)Panreac131015.1210
Calcium Nitrate 4-hydrate (Ca(NO3)2·4H2O)Panreac131231.1211
CoverglassDeltalabD10246024 mm x 60 mm
Digital CameraImaging Developmet SystemsUI-1490SE
Digital Camera Software SuiteImaging Developmet Systems4.93.0.
DNA OligosThermoFisher Scientific
dNTP Mix, 10 mM eachThermoSischer ScientificR0193
DreamTaq Green DNA polymeraseThermoFisher ScientificEP0713
Ethanol 96°VWR-Chemicals83804.360
1Kb DNA Ladder (U.S. Patent No. 4.403.036) (500pb-12Kb)Invitrogen15615-016Size: 250µg; Conc: 1.0 µg/µl
Gel Documentation SystemBio-Rad1708195
Hand CounterTamacoTM-4
Image Lab SoftwareBio-RadImage Analyse System for Gel Documentation System
MetaPhor AgaroseLonza50180
Microcentrifuge 5415 REppendorfZ605212
Microscope with UV epiflurescenceLeicaDM2500Exciter filter BP340-390, Barrier filter LP425
MicroslidesDeltalabD10000426 mm x 76 mm
Mini Electrophoresis SystemFisherbrand14955170
MinicentrifugeThermoFisher Scientific15334204
NanoDrop 1000 SpectrophotometerThermoFisher ScientificND1000
Petri DishesDeltalab20020155 mm x 14 mm
Potassium Phosphate Tribasic (K3PO4·1.5H2O)Panreac141513
Primer forward 'Pru C2'ThermoFisher Scientific
Primer forward Pru T2'ThermoFisher Scientific
Primer reverse 'PCER'ThermoFisher Scientific
RedSafe Nucleic Acid Staining SolutioniNtRON Biotechnology21141
SaccharosePanreac131621.1211
Sodium sulphite anhydrous (Na2SO3)Panreac131717.1211
Speedtools plant DNA extraction KitBiotools21272
TBE Buffer (10X)PanreacA0972,5000PE
Thermal Cycler T100Bio-Rad1861096
Thermomixer comfortEppendorfT1317
Vertical Autoclave Presoclave IIJP Selecta4001725
VortexFisherbrand11746744

Referenzen

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