Erzeugung von murinen primären Dickdarmepithel-Monoschichten aus Darmkrypten

Zusammenfassung

In diesem Protokoll beschreiben wir, wie man murine primäre epitheliale Dickdarmmonoschichten direkt aus Darmkrypten erzeugt. Wir bieten experimentelle Ansätze zur Erzeugung konfluenter Monoschichten auf permeablen Filtern, konfluente Monoschichten für die Kratzwundeheilung und biochemische Studien sowie spärliche und konfluente Monoschichten für die Immunfluoreszenzanalyse.

Zusammenfassung

Das Darmepithel besteht aus einer einzigen Zellschicht, die als Barriere zwischen dem Darmlumen und dem Inneren des Körpers fungiert. Eine Störung der Kontinuität dieser Barriere kann zu entzündlichen Erkrankungen wie entzündlichen Darmerkrankungen führen. Eine der Einschränkungen bei der Untersuchung der intestinalen Epithelbiologie war das Fehlen primärer Zellkulturmodelle, die die Forscher gezwungen haben, Modellzelllinien aus Karzinomen zu verwenden. Das Aufkommen dreidimensionaler (3D) Enteroide hat Epithelbiologen ein leistungsfähiges Werkzeug zur Erzeugung primärer Zellkulturen an die Nagel gegeben, dennoch sind diese Strukturen in extrazelluläre Matrix eingebettet und haben nicht die Reife, die für differenzierte Darmepithelzellen charakteristisch ist. Mehrere Techniken zur Erzeugung von intestinalen epithelialen Monoschichten wurden veröffentlicht, aber die meisten stammen von etablierten 3D-Enteroiden, die den Prozess mühsam und teuer machen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung primärer epithelialer Dickdarmmonoschichten direkt aus murinen Darmkrypten. Wir beschreiben auch experimentelle Ansätze, die mit diesem Modell verwendet werden können, wie die Erzeugung von Konfluentkulturen auf permeablen Filtern, konfluente Monoschichten für Kratzwundenheilungsstudien und spärliche und konfluente Monoschichten für die Immunfluoreszenzanalyse.

Einleitung

Darmepithelzellen (IEC) säumen den Darm und bilden eine selektiv durchlässige Barriere, die die Aufnahme von Nährstoffen und Wasser ermöglicht und gleichzeitig verhindert, dass Mikroorganismen und Toxine in den Körper gelangen ¹. Die Darmschleimhaut besteht aus luminalen Projektionen, die Zotten genannt werden (nur im Dünndarm vorhanden) und Invaginationen, die Krypten genannt werden. Zotten und die Oberfläche von Dickdarmkrypten sind von differenzierten Epithelzellen bedeckt, während die Basis der Krypten aus Stammzellen besteht, die die schnelle Erneuerung des Darmepithels ausmachen, das einen Umsatz von 3 bis 7 Tagen hat. Darmstammzellen (ISC) sind nicht nur wichtig für die Aufrechterhaltung der Darmöostase, sondern auch für eine angemessene Reparatur geschädigter^{Epithelien 2}.

Die Untersuchung der Darmepithelbiologie war durch das Fehlen primärer Zellkulturen begrenzt, wobei transformierte Zelllinien das einzige verfügbare Werkzeug waren. Intestinale Epithelmodellzelllinien sind nicht in der Lage, die Physiologie des normalen Darmepithels genau zu replizieren. Die Entwicklung von 3D-Kulturen, die von ISC abgeleitet wurden, lieferte Darmschleimhautbiologen In-vitro-Modelle, die in vivo Darmschleimhautbedingungen ähneln³. Krypten können leicht aus murinen Proben isoliert, in ein Basalmembranmatrixmedium (z. B. Matrigel) eingebettet und in konditionierten Medien gezüchtet werden, die Wnt3a, R-Spondin und Noggin enthalten, wodurch 3D-Strukturen erzeugt werden, die als Enteroide (Dünndarm) oder Koloreide (Dickdarm) bekannt^{sind 4}. Enteroide und Koloreide sind polarisierte sphäroidale Strukturen, bei denen die apikale Domäne einem internen Lumen zugewandt ist und die basolaterale Region in direktem Kontakt mit der extrazellulären Matrix steht. Enteroide und Kolooide enthalten alle wichtigen differenzierten intestinalen epithelialen Subtypen wie Enterozyten / Kolonozyten, Paneth-, Enteroendokrin- und Speisebletzellen und sie erscheinen in relativ den gleichen Anteilen wie in dem Abschnitt des Darms, in dem sie aus⁵isoliert wurden. Obwohl 3D-Enteroide und Koloide einen großen Fortschritt in der Erforschung der Darmentwicklung und Physiologie darstellen, zeigen diese Modelle bestimmte Nachteile wie den begrenzten Zugang zur apikalen Oberfläche der Epithelzellen (Lumen) und die Fähigkeit, Kulturen nach oben oder unten zu skalieren, um ein Hochdurchsatz-Screening von Molekülen von Interesse zu erreichen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden Protokolle zur Gewinnung primärer 2D-Kulturen von IEC aus 3D-Enteroiden/Kolonoiden generiert. 2D-Enteroide / Kolooide wachsen als Zellschicht genau wie Modellzelllinien und sind ideal, um unter anderem darmwundreparaturen, Wirt-Pathogen-Interaktionen und regenerative Medizin zu untersuchen. Mehrere veröffentlichte Arbeiten beschreiben, wie man 2D-Monoschichten aus 3D-Strukturen oder direkt aus Darmkrypten erzeugt (siehe^{6,7,8,9,10,11}), aber diese Methoden neigen dazu, arbeitsintensiv und schwer zu reproduzieren. Eine schnelle, einfache und reproduzierbare Methode, um Monoschichten direkt aus frisch isolierten Darmkrypten der Maus zu erhalten, wird in diesem Protokoll beschrieben.

Hier erklären wir im Detail den Prozess zur Kryptenextraktion mit minimaler Ablagerungserzeugung, extrazelluläre Matrixauswahl und verschiedene Oberflächen und Anwendungen für diese Technik. Dieser experimentelle Ansatz wurde für Dickdarmkrypten optimiert, aber ähnliche Ergebnisse werden erzielt, wenn sie für Dünndarm angewendet werden.

Protokoll

Alle unten beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der University of Michigan genehmigt und durchgeführt.

1. Herstellung von Reagenzien zur Kryptenisolierung und -kultur (in Gewebekulturhaube vorbereiten)

1. 50 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA): 50 ml 0,5 m Schaft zu 450 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Calcium (Ca²⁺⁾und Magnesium^(Mg2+)hinzufügen, um 500 ml zuzubereiten. In diesem Protokoll bezieht sich PBS auf PBS ohne Kalzium und Magnesium, sofern nicht anders angegeben.
2. Schüttelpuffer: 7,4 g Saccharose (43,3 mM) und 5 g Sorbit (54,9 mM) in PBS auflösen, um 500 ml vorzubereiten.
3. L-WRN (L-Wnt-3A, R-Spondin und Noggin) Medien: Ergänzung Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (DMEM/F12) (780 mL) mit 20% Fetal Bovine Serum (FBS) (200 ml), 1x handelsübliches Glutaminpräparat (10 ml), 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin (10 ml) und Filtersterilisation mit 0,22 μm Filter.
   1. Holen Sie sich L-WRN-Zellen durch ATCC, wachsen Sie in T175-Kolben und wählen Sie mit Geneticin und Hygromycin. Medienwechsel und -sammlung für 12 Tage.
      HINWEIS: Jede Charge von Medien wird mit einem TOPflash Wnt Reporter-Assay auf Wnt-Aktivität getestet. In diesem Fall wurden die Michigan Medicine Translational Tissue Modeling Laboratory Protokolle (https://www.umichttml.org/protocols) befolgt. Die TOPflash HEK 293 Zelllinie wird in einem T75-Kolben bis zur Konfluenz gezüchtet, trypsinisiert und auf eine 96-Well-Platte plattiert. Am nächsten Tag werden verschiedene Verdünnungen der gesammelten Medien in die Zellen eingelegt und in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37 °C über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag werden die Zellen lysiert und der Firefly Luciferase-Assay wird gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Der Assay wird mit rekombinantem Wnt-3A normalisiert. Das Medium wird in 25 mL Aliquoten in 50 mL konischen Rohren aufgeteilt und bei -80 °C gelagert.
4. Basismedien: Für 500 ml, Ergänzung Advanced DMEM/F12 (448 ml) mit 2x handelsüblichem Glutaminpräparat (10 ml), 20 mM HEPES (10 ml), 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin (10 ml), 2 mM N-Acetyl-L-Cystein (2 ml), N2 Ergänzung (10 ml) und B27 Ergänzung (20 ml), Filter sterilisieren mit 0,22 μm Filter. Teilen Sie das Medium in 25 ml Aliquoten in 50 ml konischem Rohr und lagern Sie es bei -80 °C.
5. LWRN-Komplettmedien: Kombinieren Sie 25 ml LWRN-Medien mit 25 ml Basismedien und ergänzen Sie sie mit 200 ng/ml Epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) (20 μL) und 2x antibiotisch-antimykotische Lösung (1 ml). Lagern Sie das komplette Medium bei 4 °C.
6. Kollagen und Laminin: 5 mg Pulver in 5 ml filtersterilisierter 100 mM Essigsäure auflösen (60 μL Essigsäurestock zu 9,94 ml molekularem Wasser hinzufügen), um eine Stammkonzentration von 1 mg / ml zu erzeugen. Drehen Sie bei 4 °C für 4 h und machen Sie 100 μL Aliquoten in 0,2 ml Röhrchen. Bei -20 °C einfrieren. Laminin wird in einer Lagerkonzentration von 100 μg/ml gekauft.
7. Komplette Medien ohne Wachstumsfaktoren (CMGF-): Supplement Advanced DMEM/F12 (500 mL) mit 1x handelsüblichem Glutaminpräparat (5 mL), 10 mM HEPES (5 mL), 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin (5 ml).
8. Differenzierungsmedien: Zu 9,2 ml CMGF-Medien werden 200 μL B27-Ergänzung, 100 μL N2-Ergänzung, 20 μL N-Acetyl-L-Cystein, 500 μL Noggin-Medium¹² (aus Noggin-produzierenden Zellen) und 2 μL EGF hinzugefügt, um 10 ml Differenzierungsmedien herzustellen.

2. Vorbereitung von Platten, Kammerträgern und Zellkulturmembraneinsätzen

1. Beschichtung von 48-Well-Platten- und Kammerträgern zur Beschichtung von 2D-Monoschichten: Verwenden Sie die Beschichtungslösung, die Aus Laminin (1:40 Verdünnung, siehe Materialtabelle)und Kollagen (1:30 Verdünnung) in kalter Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Ca²⁺ und Mg²⁺ (DPBS) besteht. Fügen Sie 200 μL Beschichtungslösung zu jeder Vertiefung hinzu und bebrüten Sie den Platten-/Kammerträger in einem 5% CO 2-Inkubator bei 37 °C für mindestens 2 h vor.
2. Beschichtung von 0,4 μm Zellkulturmembraneinsätzen: Kollagen in molekularem Wasser in 1:30 verdünnen und jedem Einsatz 200 μL hinzufügen. Halten Sie die Platte mit dem Membraneinsatz 30 min lang bei Eis bei 4 °C. Nach 30 min Inkubation die Platte in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37 °C für 1,5-2 h aufbewahren. Polyester- und Polycarbonat-Membraneinsätze liefern vergleichbare Ergebnisse.
   HINWEIS: Jede Gewebekulturplatte kann mit diesem Protokoll ausgesät werden (Up- und Downscaling kann durchgeführt werden), indem das Kollagen- / Lamininvolumen angepasst wird, um eine vollständige Abdeckung der Beschichtungsoberfläche zu erhalten.

3. Krypto-Isolation

HINWEIS: Bevor Sie mit der Dissektion beginnen, bereiten Sie kollagen- und/oder lamininbeschichtete Platten-/Membraneinsätze/Kammerträger vor und lassen Sie sie in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37 °C. Bereiten Sie eine saubere Werkbank und sterile chirurgische Instrumente vor, die für die Operation geeignet sind, sowie eine biologische Sicherheitswerkbank für die Kultivierung von 2D-Monoschichten. Bestätigen Sie, dass alle anderen Standardgeräte für die 2D-Monoschichtkultur wie befeuchteter CO 2-Inkubator, Tischzentrifugen (bei 4 °C gehalten), Mikroskop und Pipetten (einschließlich serologischer Pipetten) fertig sind.

1. Verwenden Sie C57Bl/6 Mäuse, 8-12 Wochen alt. Euthanasiern Sie Mäuse mit einer zugelassenen Methode der Euthanasie.
2. Besprühen Sie die Mäusekadaver mit 70% igem Ethanol (EtOH) -Lösung, um den Sezierbereich zu reinigen und überschüssiges EtOH mit Papiertaschentüchern zu entfernen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Kryptationsreagenzien (z. B. PBS, 50 mM EDTA, Schüttelpuffer) kalt gehalten werden. Diese Reagenzien können einen Tag vorher zubereitet werden und sind bei Lagerung bei 4 °C mindestens 3 Monate gut einsetzbar. Stellen Sie außerdem sicher, dass das LWRN-Komplettmedium bis zur Verwendung in einem Perlen-/Wasserbad bei 37 °C aufbewahrt wird.
3. Sezieren Sie mit einer sauberen Dissektionsschere und Einer Zette den Dickdarm vom Rektum bis zum Blinddarm. Halten Sie das Ende des Dickdarms mit einer Zette und spülen Sie den Kot sehr vorsichtig mit eiskaltem PBS in einer 10-ml-Spritze ab, die mit einem 20-G-Ernährungsröhrchen ausgestattet ist (Abbildung 1A). Stellen Sie sicher, dass Sie den Dickdarm nicht reißen.
   1. Entfernen Sie den proximalen Dickdarm. Dies ist der Teil des Dickdarms, der der ileozekalen Verbindung am nächsten ist.
4. Mit einer Zette den distalen Dickdarm vorsichtig auf die 20 G-Zuführsonde schieben und den Dickdarm am Ende des Sondens durch die Spitze mit 4-0 Seidennähtfaden abkneiden (Abbildung 1B).
5. Kehren Sie den Dickdarm von innen nach außen mit den Fingern über das abgebundene Ende und binden Sie das andere Ende mit 4-0 Seidennähtfaden. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere den Dickdarm unterhalb der Spitze der Ernährungssonde ab (Abbildung 1C,D, E).
6. Öffnen Sie mit dem Kolben einer 1,25 ml Wiederholungsspritze vorsichtig das ungebundene Ende des invertierten Dickdarms auf die Spitze einer 1,25 ml Wiederholungsspritze. Schieben Sie den umgekehrten Doppelpunkt auf das Ende der Spritze und binden Sie ihn fest mit 4-0 Seidennähtgewinde (Abbildung 1F, G).
7. Führen Sie den Kolben in die Spritze ein und blasen Sie den Dickdarm auf, um eine Wurst zu bilden. Aufblasen, bis die Darmwurst ohne sichtbare Falten turgen aussieht (Abbildung 1H).
8. Legen Sie die Spritze/ den Dickdarm in ein 15-ml-Röhrchen mit 5 ml Zellrückgewinnungslösung für 20 minuten auf Eis, blasen Sie den Dickdarm einmal alle 5 Minuten auf und entleeren Sie sie (Abbildung 1I). Die Wurst muss während der Inkubation aufgeblasen bleiben.
9. Mit 4-0 Seidennähtfaden unterhalb der Spitze der Wiederholungsspritze mit aufgeblasenen Dickdarm abbinden. Schneiden Sie die Wurst von der Wiederholungsspritze ab und geben Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen mit 10 ml 50 mM (2 mM für Dünndarm) EDTA für 40 min und drehen Sie es bei 4 °C (Abbildung 1J, K).
10. Dekantieren Sie die EDTA-Lösung und ersetzen Sie sie durch 5 ml Schüttelpuffer. Schütteln Sie die Wurst manuell in vertikaler Position (kräftig) für 2 min.
11. Dekantieren Sie die Schüttellösung in ein neues 15-ml-Röhrchen und wiederholen Sie den Schüttelschritt für insgesamt 10 ml Krypten im Schüttelpuffer.
12. Nehmen Sie 20 μL der Kryptensuspension in einer Petrischale und zählen Sie die Anzahl der Krypten unter einem Mikroskop. Berechnen Sie die Kryptenkonzentration in Krypten/μL. Je nach Konzentration verdünnen Sie die Proben, um zum Zeitpunkt der Beschichtung 5Krypten/μL (1000 Krypten/cm2) zu erhalten.
13. Drehen Sie das Röhrchen mit isolierten Krypten mit einer Tischzentrifuge bei 400 x g für 10 min bei 4 °C.
14. In der Zwischenzeit 48-Well-Platte/Insert/Kammerträger aus dem Inkubator entfernen und in die Biosicherheitswerkbank legen. Saugen Sie die Beschichtungslösung mit P200 an und lassen Sie die Platte mit dem Deckel leicht versetzt, bis die Zellen bereit sind, plattiert zu werden.

4. Kultivierung von 2D-Monolayern

HINWEIS: Für ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von Intestinalepithel-Monoschichten aus 3D-Kolonoiden überprüfen Sie die Protokolle von Estes und Kovbasnjuk Labs (^7,11).

1. Entfernen Sie den Schüttelpuffer mit einer serologischen Pipette von 10 ml. Stellen Sie sicher, dass das Pellet intakt ist und möglicherweise P1000 verwendet, um die verbleibende Flüssigkeit zu entfernen. Suspendieren Sie das Pellet in 3 ml LWRN-Komplettmedium erneut und pipetten Sie es mit P1000 auf und ab. 200 μL Krypten zu jeder Vertiefung eines vorbeschichteten 48-Well-Platten-/Kammerschlittens geben und in einem 5%igen CO 2-Inkubator bei 37 °C inkubieren.
2. Am nächsten Tag saugen Sie das Medium mit P200 an und fügen Sie frische Medien hinzu. Die Zellen konfluenten in 24-48 h.
3. Für Zellkulturmembraneinsätze fügen Sie 200 μL Krypten (5 Krypten/μL) an der Oberseite der Einsätze und 600 μL vollständige L-WRN-Medien an der Unterseite hinzu. Am nächsten Tag das Medium mit P200 absaugen und frisches Medium nur in die obere Kammer geben. Inkubieren Sie die Platte in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37 °C. Der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) wird täglich mit dem Epithelial Volt/Ohm-Messgerät (EVOM) gemessen.
   HINWEIS: Wenn die Kultur einen TEER-Wert von mehr als 300 Ω,cm²hat, sollen sie konfluent sein. Die Konfluenz wird in 3-4 Tagen erreicht. Wechseln Sie die Medien alle 2 Tage.

Ergebnisse

Um die Zuverlässigkeit der primären epithelialen Dickdarm-Monolayer-Kulturen zu veranschaulichen, wird eine Zusammenfassung der Krypta-Isolation und repräsentative Bilder aus dem Protokoll gezeigt. Der Benutzer muss bedenken, dass die isolierten Krypten unter sterilen Bedingungen kultiviert werden, so dass eine korrekte Dissektion und Reinigung des Dickdarms eine Priorität ist. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Schritte während der Kryptoisolation. Isolierte Krypten (Abbildung 2A) werden nun gezählt und konzentriert (Abbildung 2B), um eine Konzentration von 5 Krypten/μL zu erhalten. Nach einer konzentrierten Aufbereitung der Krypten werden die Zellen im gewünschten Format (Kulturschale, Membraneinsätze oder Kammerträger) plattiert und je nach experimentellem Bedarf mit den entsprechenden Medien inkubiert. Abbildung 3 zeigt den Kulturverlauf nach 24 und 48 Stunden Kultur in 48-Well-Platten. Die Zellen werden inkubiert, bis die gewünschte Konfluenz erreicht ist. Um mögliche Anwendungen dieser Methode zu veranschaulichen, haben wir 48-Well-Plattenbrunnen die Konfluenz erreichen lassen und einen Kratz-Wund-Assay durchgeführt. Abbildung 4 zeigt einen frisch erzeugten Kratzer (Abbildung 4A) in einer 2D-Kolonoid-Monoschicht und die gleiche Wunde 24 h danach (Abbildung 4B). Es ist klar, dass die Kultur immer noch gesund und lebensfähig ist und es eine Wundreparatur gibt. Um differenzierte Monolayer zu erzeugen, werden Medien von LWRN auf Differenzierungsmedien umgestellt. Die Differenzierung wird durch hohe TEER-Werte (Abbildung 5A), Abnahme der ISC-Marker ((Leucin-reiche, wiederholungshaltige g-Protein-gekoppelter Rezeptor 5 (Lgr5) und Achaete-Scute wie 2 (Ascl2)) und Erhöhung der Differenzierungsmarker ((Alanylaminopeptidase (Anpep), Mucin 2 (Muc2), Lysozym 1 (Lyz1), Saccharose iso-maltase (Sis) und Chrmogranin A (Chga)) (Abbildung 5B,C) durch PCR erreicht. Weitere Marker wie CDX2 und KRT20 können ebenfalls in dieses Panel aufgenommen werden. Neben den mRNA-Expressionsniveaus wird das Auftreten von Subtypen differenzierter Epithelzellen in 2D-Kolonoiden, die unter Differenzierungsbedingungen gezüchtet wurden, auch durch Immunfluoreszenz (Muc2 und Chga; Abbildung 5D).

Abbildung 1: Probenvorbereitung für die Erzeugung gesunder Monoschichten. Die Probenvorbereitung ist entscheidend für die Erzeugung gesunder Monoschichten. Die wichtigsten Schritte des Isolationsprozesses sind in dieser Abbildung dargestellt, um es dem Leser zu erleichtern. Der Dickdarm wird von der Maus entfernt, um sicherzustellen, dass keine Fellreste vorhanden sind. Entfernen Sie vorsichtig den Kot und stellen Sie sicher, dass Sie den Dickdarm nicht perforieren; Dies ist von entscheidender Bedeutung, da der Dickdarm in der Lage sein muss, Luft zu halten und aufgeblasen und entleert zu werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2:Anzahl und Konzentration der Kryptaisolation. (A) Kolonkrypten nach dem Schütteln der Darmwürste. Das Bild zeigt ein Feld mit einem Tropfen von 20 μL. (B) Kryptenkonzentration, um 5 Krypten/μL zu erhalten. Maßstabsleiste: 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3:Primäres IEC-Monoschichtwachstum. (A) 2D-IEC-Monoschichten nach 24 h Beschichtung und Entfernung von Zellabfällen. (B) Konfluente 2D IEC Monolayer 48 h nach der Beschichtung. Maßstabsleiste: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4:Kratzwunde-Assays mit muriner Primär-IEC. Bilder, die die Wundheilung nach einem Kratzer in der epithelialen Dickdarmmonoschicht zeigen. Maßstabsleiste: 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Differenzierung von epithelialen Dickdarmmonoschichten. (A) Differenzierungsmedien erzeugen enge epitheliale Barrieren, wie TEER zeigt. Differenzierungsmedien verursachen einen Rückgang der mRNA-Expression von (B) Stammzellmarkern und eine Hochregulation von (C) Differenzierungsmarkern. (D) Marker von spezialisierten differenzierten Epithelzellen wie Muc2 und Chromogranin-A können auch über Immunfluoreszenz von direkten 2D-Kolonoiden nachgewiesen werden. Maßstabsleiste: 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Unser Protokoll bietet eine schnelle, reproduzierbare und zuverlässige Methode zur Erzeugung direkter primärer 2D-IEC-Monoschichten. Einer der Hauptunterschiede in unserem Protokoll im Vergleich zu zuvor veröffentlichten Protokollen zur Erzeugung von Dickdarmepithel-Monoschichten besteht darin, dass wir den Dickdarm nicht in kleine Stücke schneiden, um die Krypten zu befreien. Stattdessen passten wir ein Protokoll an, um Darmepithel von Mesenchym¹³ durch eine Kombination chemischer und mechanischer Kräfte zu trennen, um Krypten in einem extrem sauberen Präparat freizusetzen (Abbildung 2), und lieferten dem Forscher ideales Material, um Primärkulturen zu erzeugen. Unsere Isolationsmethode kann auch verwendet werden, um 3D-Enteroide und Koloide zu erzeugen. Es ist wichtig, jedes Mal, wenn ein Experiment durchgeführt wird, eine Kryptozählung durchzuführen, um die Anzahl der Krypten zu normalisieren, die plattiert werden. Variablen wie Colon Sausage Turgor, Isolationsgeschwindigkeit, Benutzerwissen können die Anzahl der isolierten Krypten beeinflussen. Die im Protokoll erwähnte vorgeschlagene Beschichtungskryptenkonzentration ist ein Ausgangspunkt, aber jeder Benutzer, der benutzergesteuerte Variablen berücksichtigt, muss sie optimieren. Wir haben diese Technik bei männlichen und weiblichen WT-Mäusen im Alter von 8 bis 20 Wochen angewendet und wir haben keine großen Unterschiede im Zellüberleben gesehen, theoretisch haben Krypten, die von jüngeren Mäusen isoliert wurden, bessere Überlebenschancen. Krypten sind im Übermaß plattiert, da nur ein kleiner Prozentsatz von ihnen an der Oberfläche haftet und überlebt. Ein Gleichgewicht, bei dem es genug Krypten gibt, um einen Tag nach dem Plattieren eine 50% ige Konfluenz zu haben, aber nicht zu viele Krypten, in denen die sterbenden Krypten eine zytotoxische Wirkung haben, ist das Ziel. LWRN-Medien müssen 24 Stunden nach der Beschichtung sorgfältig entfernt werden, um tote Krypten und Ablagerungen zu entfernen, dies muss sorgfältig erfolgen, um zu vermeiden, dass Zellen, die bereits als Monoschicht wachsen, abgelöst werden.

Nach der erstmaligen Entfernung von LWRN-Medien muss der Anwender entscheiden, ob die experimentellen Bedingungen primäre IEC-Monoschichten erfordern, die näher an Stammzellen bleiben und frische LWRN-Medien hinzufügen, oder wenn eine Differenzierung der Monoschicht gewünscht wird, durch Differenzierungsmedien ersetzen. Der wichtigste Faktor in diesem Protokoll ist die Sicherstellung der Integrität des Dickdarms während des Isolationsprozesses. Wenn ein Bruch auftritt, kann die Wurst verkürzt werden, um die beschädigte Stelle zu beseitigen. Bevor Sie die Wurst in EDTA geben, achten Sie darauf, dass die Knoten so dicht wie möglich sind. Wird die Wurst nach der EDTA-Inkubation entleert, kann das Protokoll mit wenig bis gar keinen Auswirkungen auf den gesamten Kryptenertrag fortgesetzt werden. Wenn die Wiederholungsspritze nicht verfügbar ist, kann eine normale Mikropipettenspitze, die an einer normalen Spritze befestigt ist, auch für den Prozess der Inflation und Deflation verwendet werden. Wenn keine Zellwiederherstellungslösung verfügbar ist, können die Inflations- und Deflationsschritte in EDTA (2mM Dünndarm, 50 mM Dickdarm) durchgeführt werden, aber diese Substitution wird nicht empfohlen. Wenn keine Konfluenz erforderlich ist, können Krypten in Platten wachsen, die nur mit Kollagen beschichtet sind, und sogar in unbeschichteten Platten. Verwenden Sie nur unbeschichtete Platten, es gibt keine andere Option, aber die Zellen werden nicht gesund wachsen, wie sie es in kollagenbeschichteten Platten tun würden. Wenn es um die Gesundheit und Stabilität der Kultur geht, sind in Kunststoff plattierte Monoschichten für 4 bis 5 Tage gesund, während Monoschichten, die in Transwells plattiert sind, bis zu 8 Tage lang getragen werden können.

Eine der Haupteinschränkungen dieser Methode sind die Zellmedien, die zum Züchten der epithelialen Dickdarmmonoschichten erforderlich sind. LWRN-Zellen sind am ATCC verfügbar, aber die LWRN-bedingte Mediengenerierung ist arbeitsintensiv und erfordert den Zugang zu einem fluoreszierenden Spektrometer, um die Wnt-Aktivität zu bestimmen. Differenzierungsmedien erfordern eine Reihe von Reagenzien, die vor der Verwendung frisch zugegeben werden, was es zu einem langwierigen Prozess macht. Schließlich sind die meisten dieser Reagenzien teuer und es ist einfach, die Reagenzien in einem schnellen Tempo zu verbrennen. Wenn ein Labor diese Technik ohne vorherige intestinale Primärzellkultur etablieren möchte, wird dringend empfohlen, einen Mitarbeiter / eine Hochschule mit Erfahrung zu finden und eines ihrer Mitglieder zu schulen.

Die Wartung der 3D-Kultur könnte aufgrund der Kosten für die Grundmembranmatrix mittlere und hohe Mengen konditionierter Medien, die für Organoidkulturen benötigt werden, teuer sein, aber es hat den Vorteil, dass eine reduzierte Anzahl von Mäusen verwendet wird und die erzeugten Strukturen viele Male passieren können. Enteroide (aus dem Dünndarm gewonnen) sind relativ einfach zu isolieren und zu pflegen, während Koloroide empfindlicher sind, langsamer wachsen und eine begrenztere Durchgangskapazität haben. Die Monolayer-Generierung aus 3D-Kolonoiden erfordert eine unverhältnismäßig große Menge an 3D-Strukturen, die diese Art von Experimenten zeitaufwendig und kostspielig machen. Im Gegenteil, die direkte Vorbereitung der epithelialen Dickdarm-Monoschicht ist schnell und ein schneller Weg, um die Ergebnisse zu erzielen. Eine Dickdarmvorbereitung kann 2 bis 3 Tage nach der Beschichtung eine konfluente Fläche von 75 cm² (10 bis 15 ml konditionierte Medien, wird einmal ersetzt) erzeugen (dieser Bereich würde 144 Vertiefungen von 3D-Kolonoiden erfordern, was fast 6 ml Matrigel und mehr als 250 ml konditionierte Medien bedeutet). Der geringere Medienverbrauch, die kostengünstige Wartung der Zellkultur und die Fähigkeit, Funktionstests durchzuführen und eine schnelle Nachbearbeitung sind große Vorteile von epithelialen Dickdarmmonoschichten.

Dieses Protokoll ist ein wertvolles Werkzeug bei der Untersuchung der Darmepithelzellbiologie in Bereichen wie Zelladhäsion, Polarität und Differenzierung. Es bietet den Vorteil, primäre Zellkulturen aus genetisch veränderten Mäusen (Knock-out, Overexpressing, Reporter) zu erzeugen. Die primären intestinalen epithelialen Monoschichten ermöglichen einen einfachen Zugang zu den apikalen und basolateralen Oberflächen (wenn sie auf Transwells plattiert sind), was die Untersuchung der Permeabilität, Barriere und transepithelialen Migration verschiedener Zelltypen ermöglicht. Schließlich kann dieses Modell in verschiedenen Bereichen wie Wirt-Pathogen-Interaktionen, Epithelschäden und -reparatur sowie Arzneimittelforschung nützlich sein.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
Antibiotic Antimycotic solution	Corning	30-004CI
B27 supplement (50X)	Gibco	12587-010
Cell Recovery Solution	Corning	354253
Collagen from human placenta (type IV)	Sigma-Aldrich	C5533
D-Sorbitol	Sigma	85529-250G
D-Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
Dulbecco’s phosphate buffered saline, with Ca2+ and Mg2+ (DPBS)	Corning	21-030-CV
Epithelial Volt/Ohm meter	World Precision Instruments	0-10KΩ with STX2 (EVOM2)
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Lonza	51201
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-016-CV
Firefly Luciferase assay	Biotium	30085-2
Geneticin	Gibco	10131-035
GlutaMAX (100X)	Gibco	35050-061
HEPES (1M)	Corning	25060CI
Human recombinant EGF	R&D systems	236-EG	Stock Concentration: 500µg/mL
Human recombinant Wnt-3A	R&D systems	W3a-H-005
Hygromycin B	Invitrogen	10687010
LWRN cells	ATCC	CRL-3276
Molecular grade water	Corning	46-000-CV
N2 supplement (100X)	Gibco	17502-048
N-acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G	Stock Concentration: 500mM
Noggin	Conditioned media	-
Nunc Lab-Tek Chamber slide system	Sigma-Aldrich	C7182-1PAK
Pencillin-Streptomycin (10,000U/mL)	Corning	30002CI
Phospahte buffered saline, Ca2+ and Mg2+ free (PBS)	Corning	21-040-CV
Plastic 20G feeding tube	Fisher Scientific	50-810-46
rh-laminin-521	Gibco	A29248	Stock concentration: 100µg/mL
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided 100YD	Fisher Scientific	NC9452680
TOPflash HEK293 cells	ATCC	CRL-3249
Transwell Permeable supports (0.4µm)	Corning	3470