Gerichtete Induktion retinaler Organoide aus humanen pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Mit einer selbstorganisierenden Methode entwickeln wir ein Protokoll mit dem Zusatz von COCO, das die Bildung von Photorezeptoren signifikant erhöhen könnte.

Zusammenfassung

Die retinale Zelltransplantation ist ein vielversprechender Therapieansatz, der die Netzhautarchitektur wiederherstellen und die Sehfähigkeit der degenerierten Netzhaut stabilisieren oder sogar verbessern könnte. Dennoch steht der Fortschritt in der Zellersatztherapie derzeit vor der Herausforderung, eine handelsübliche Quelle für qualitativ hochwertige und standardisierte menschliche Netzhäute zu benötigen. Daher ist ein einfaches und stabiles Protokoll für die Experimente erforderlich. Hier entwickeln wir ein optimiertes Protokoll, basierend auf einer selbstorganisierenden Methode unter Verwendung von exogenen Molekülen und Reagenz A sowie manueller Exzision zur Erzeugung der dreidimensionalen menschlichen Netzhautorganoide (RO). Die von humanen pluripotenten Stammzellen (PSCs) abgeleiteten RO exprimieren spezifische Marker für Photorezeptoren. Mit der Zugabe von COCO, einem multifunktionalen Antagonisten, wird die Differenzierungseffizienz von Photorezeptorvorläufern und Zapfen signifikant erhöht. Die effiziente Nutzung dieses Systems, das die Vorteile von Zelllinien und Primärzellen hat, und ohne die damit verbundenen Beschaffungsprobleme, könnte konfluente Netzhautzellen, insbesondere Photorezeptoren, produzieren. Somit bietet die Differenzierung von PSCs zu RO eine optimale und biorelevante Plattform für Krankheitsmodellierung, Wirkstoffscreening und Zelltransplantation.

Einleitung

Pluripotente Stammzellen (PSCs) zeichnen sich durch ihre Selbsterneuerung und die Fähigkeit aus, sich in alle Arten von Körperzellen zu differenzieren. Daher sind Organoide, die von PSCs abgeleitet sind, zu einer wichtigen Ressource in der Forschung der regenerativen Medizin geworden. Die Netzhautdegeneration ist durch den Verlust von Photorezeptoren (Stäbchen und Zapfen) und des retinalen Pigmentepithels gekennzeichnet. Der retinale Zellersatz könnte eine ermutigende Behandlung für diese Krankheit sein. Es ist jedoch nicht möglich, menschliche Netzhäute für die Erforschung und Therapie von Krankheiten zu erhalten. Daher sind retinale Organoide (ROs), die von PSCs abgeleitet sind und die mehrschichtige native Netzhautzellen effektiv und erfolgreich rekapitulieren, für die Grundlagen- und translationale Forschung von Vorteil ^1,2,3. Unsere Forschung konzentriert sich auf die RO-Differenzierung, um ausreichend und qualitativ hochwertige Zellen für die Untersuchung der Netzhautdegeneration^{bereitzustellen 4}.

Methoden zur Differenzierung von ROs entstehen kontinuierlich, wobei das Sasai-Labor 2012 eine dreidimensionale (3D) Suspensionsdifferenzierung entwickelt hat⁵. Wir haben den CRX-tdTomato-Tag in die menschlichen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) eingeführt, um die Photorezeptor-Vorläuferzellen spezifisch zu verfolgen, und modifizierten die Methode durch den Zusatz von COCO, einem multifunktionalen Antagonisten der Wnt-, TGF-β- und BMP-Signalwege⁶. Es wurde gezeigt, dass COCO die Differenzierungseffizienz von Photorezeptorvorläufern und Zapfen effizient verbessert ^6,7.

Insgesamt haben wir durch die Modifikation der klassischen Differenzierungsmethode ein zugängliches Protokoll entwickelt, um reichlich Photorezeptorvorläufer und Zapfen aus menschlichen ROs zu gewinnen, um die mit den Photorezeptoren verbundenen Netzhauterkrankungen durch Laboruntersuchungen und für die weitere klinische Anwendung / Transplantation zu analysieren.

Protokoll

Diese Studie wurde von der institutionellen Ethikkommission des Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, genehmigt. H9 hESCs wurden vom WiCell Research Institute gewonnen und gentechnisch zu tdTomato-markierten Zelllinien verändert.

1. Erzeugung menschlicher ROs

1. Kultur der hESCs unter feederfreien Bedingungen.
   1. Beschichten Sie eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 1 ml 0,1 mg/ml Reagenz A (Table of Materials) bei 37 °C für mindestens eine halbe Stunde gemäß den Anweisungen des Herstellers. Ein Aliquot von 1x10⁶ hESC auftauen.
      HINWEIS: Bereiten Sie 3 ml vorgewärmtes Reagenz B (Tabelle der Materialien) vor und überführen Sie die kryokonservierten Zellen (1 ml) in 3 ml frisches Medium. Pipettieren Sie die hES-Zellen nicht zu einzelnen Zellen.
   2. Bei 200 x g 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
   3. Säen Sie die Zellen mit 2 ml Reagenz B in die mit Reagenz A beschichtete Platte und wechseln Sie täglich 2 ml Reagenz B. Durchgangszellen bei Erreichen einer Konfluenz von etwa 80% (normalerweise um 4 Tage).
2. Tag 0
   1. Dissoziieren Sie hES-Zellen zu einer Einzelzellsuspension unter Verwendung von Medium I (Tabelle 1). Bereiten Sie Medium I vor, indem Sie Folgendes mischen: 20% (v/v) KnockOut-Serumersatz (KSR), 0,1 mM MEM nicht-essentielle Aminosäurenlösung (NEAA), 1 mM Pyruvat, 3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ng/ml COCO, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin (PS), 0,1 mM β-Mercaptoethanol und Glasgows Eagle's Minimal Essential Medium (GMEM).
      HINWEIS: Vor Beginn der Dissoziation das Medium I vorbereiten und 12 ml Medium I mit 20 μM Y-27632 in eine 10 cm große Petrischale, 500 μL Reagenz C (Materialtabelle) mit 0,05 mg/ml Reagenz D (Materialtabelle) und 20 μM Y-27632 in ein 1,5-ml-Röhrchen überführen. Führen Sie die obigen Schritte im Dunkeln durch, da die Komponente IWR1e in Medium I lichtempfindlich ist.
   2. Waschen Sie die hESCs mit vorgewärmtem 1x Phosphat-gepufferter Kochsalzpuffer (DPBS) von Dulbecco.
   3. Das vorbereitete 500 μL Reagenz (im 1,5 ml) Röhrchen zugeben und die hES-Zellen 3,5 min bei 37 °C und 5%_CO2 inkubieren.
   4. Lösen Sie die Zellen, indem Sie die Seite und den Boden der Platte für einige Sekunden streichen und 500 μL des vorbereiteten Mediums I aus der Petrischale in die hESC-Platte geben.
      HINWEIS: Bereiten Sie ein 1,5-ml-Röhrchen mit 900 μL 1x DPBS vor und verwenden Sie ein Hämozytometer zur Zellzählung.
   5. Ernten Sie die Zellen in einem neuen 1,5-ml-Röhrchen und pipetten Sie die Zellsuspension nach oben und unten, nehmen Sie dann 100 μL aus dem Röhrchen heraus und fügen Sie dann 900 μL DPBS zur Zellzählung in das Röhrchen hinzu.
   6. Die linke 900 μL Zellsuspension wird dispergiert und dann die Zellen mit vorbereitetem Medium I in der Petrischale auf 9 x 10⁴ Zellen/ml verdünnt.
      HINWEIS: Das gesamte Volumen des Mediums beträgt 12 ml; Insgesamt werden 1,08 x 10⁶ Zellen benötigt.
   7. Fügen Sie 100 μL Zellsuspension in jede Vertiefung einer nicht haftenden 96-Well-Platte mit V-Boden (Table of Materials) hinzu.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die Zeit zu verkürzen und sicherzustellen, dass jede Vertiefung eine äquivalente Zellzahl enthält. Schütteln Sie die Petrischale jedes Mal, bevor Sie 100 μL Portionen entfernen. Wichtig ist, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind.
   8. Die 96-Well-Platte in einem Low-Speed-Shaker 5 min lang leicht herunterdrehen und dann bei 37 °C und 5% CO₂ inkubieren.
      HINWEIS: Halten Sie den Teller dunkel. Legen Sie den Tag als Tag 0 fest.
3. Tag 2
   1. Fügen Sie 1% Reagenz A hinzu (Tabelle der Materialien). Reagenz A (Proteinkonzentration von 10 mg/ml) wird durch Zugabe von 133,4 μL Reagenz A in 2 ml Medium I hergestellt.
      HINWEIS: Reagenz A vor Gebrauch über Nacht bei 4 °C halten, um ein vollständiges und gleichmäßiges Schmelzen zu erreichen. Bitte beachten Sie die Produktinformationen und suchen Sie die Katalognummer und die Chargennummer auf der offiziellen Website des Unternehmens, um die Proteinkonzentration von Reagenz A zu erhalten, da jede Flasche Reagenz A eine andere Proteinkonzentration aufweist. Wenn die Proteinkonzentration niedrig ist, wäre ein erhöhtes Volumen von Reagenz A hilfreich.
   2. Geben Sie 20 μL des vorbereiteten Reagenz A in jede Vertiefung und pipettieren Sie zweimal in der Mitte, um die toten Zellen zu streuen.
      HINWEIS: Bewahren Sie das Reagenz A und die 96-Well-Platte unter kühlen Bedingungen auf und führen Sie alle Schritte auf Eis aus. Stellen Sie den Teller dunkel.
4. Tag 2-12
   1. Reinigen Sie den Boden der 96-Well-Platte und inkubieren Sie bei 37 °C und 5% CO₂ bis Tag 6. An Tag 6 wechseln Sie die Hälfte des Mediums, indem Sie 58 μL des Mediums aus jeder Vertiefung entfernen und 60 μL Medium I hinzufügen.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um den Halbmediumwechsel abzuschließen. Führen Sie diesen Schritt vorsichtig durch, um sicherzustellen, dass keine Zellpellets aus dem Bohrloch entfernt werden. Das Medium in eine saubere 10 cm Petrischale einsaugen. Wenn sich Zellpellets darin befinden, fügen Sie sie wieder der 96-Well-Platte hinzu.
5. Tag 12- 18
   1. Ändern Sie das Medium auf Medium II (Tabelle 1) an Tag 12. Medium II wird unter Verwendung von 1% (v/v) Reagenz A hergestellt, indem Folgendes gemischt wird: 10% fetales Rinderserum (FBS), 0,1 mM NEAA, 1 mM Pyruvat, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,1 mM β-Mercaptoethanol, 100 nM SAG-Dihydrochlorid und GMEM. Lagern Sie es unter kühlen und dunklen Bedingungen.
   2. Ernten Sie die Zellpellets in einem 15-ml-konischen Röhrchen von der 96-Well-Platte und lassen Sie die Pellets 5 Minuten bei Raumtemperatur auf natürliche Weise absetzen.
      HINWEIS: Entfernen Sie das Medium und die Pellets vorsichtig unter der Oberfläche, um Blasen zu vermeiden.
   3. Entfernen Sie den Überstand, während Sie sich um die Organoide kümmern. Die Zellaggregate werden in eine 10 cm lange Suspensionsschale überführt, die 18 mL des vorbereiteten Mediums II mit Reagenz A enthält.
      HINWEIS: Geben Sie das vorbereitete Medium II nicht vorher in die 10 cm Schüssel, da das Reagenz A bei 4 °C stehen sollte.
   4. Bei 37 °C und 5% CO₂ bis zum 18. Tag inkubieren.
6. Ab Tag 18
   1. Ändern Sie das Medium auf Medium III (Tabelle 1). Bereiten Sie Medium III unter dunklen Bedingungen vor, indem Sie Folgendes mischen: 10% FBS, 1xsupplement 1, 0,5 μM Retinsäure (RA), 100 μM Taurin, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 1:1 Mischung aus Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM)/Nährstoffgemisch F-12.
   2. Am Tag 18, wenn ein halbtransparentes optisches Vesikel erzeugt wird, schneiden Sie die Organoide mit einem mikrochirurgischen Messer.
      HINWEIS: Spalten Sie das Organoid, normalerweise in vier Stücke, in einer Petrischale mit Medium II. Jedes Stück sollte in den folgenden Wochen zu einem intakten Sehbecher heranwachsen.
   3. Aggregieren Sie alle Pellets in der Mitte der Schale. Ernten Sie die Zellen in ein 15 ml konisches Falkenröhrchen und lassen Sie es natürlich absetzen. Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand.
      HINWEIS: Aufgrund ihrer Größe können Organoide in der Mitte aggregiert werden, indem die Petrischale einige Male in eine Richtung um 90° auf einer horizontalen Ebene gedreht wird.
   4. Suspendieren und dispergieren Sie die Pellets in zwei 10-cm-Petrischalen mit 18 ml Medium III pro Schale und geben Sie die Schalen vorsichtig in den Inkubator, um eine Zellaggregation zu vermeiden. Setzen Sie die Kultur in Medium III bei 37 °C und 5% CO₂ fort und wechseln Sie das Medium wöchentlich. Die CRX, die nach Tag 45 und bis Tag 120 exprimiert wurde, konnten wir das Out-Segment des Photorezeptors nachweisen.

2. Analyse menschlicher ROs

1. FACS-Analyse
   1. Setzen Sie drei CRX-tdTomato- und drei H9 ES-abgeleitete Organoide aus den Schalen zusammen, indem Sie die geschnittenen 1-ml-Spitzen verwenden. Waschen Sie die Organoide mit 1 ml vorgewärmtem DPBS (Raumtemperatur).
   2. Bereiten Sie den Verdauungspuffer vor, indem Sie 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung mit 0,05 mg/ml Reagenz D mischen.
   3. Die Organoide werden mit dem vorbereiteten Verdauungspuffer für 8 min bei 37 °C in einzelne Zellen dissoziiert. Dann fügen Sie das gleiche Volumen DPBS mit 10% FBS und 0,05 mg / ml Reagenz D hinzu, um die Reaktion zu inaktivieren.
   4. Suspendieren und streuen Sie die Zellen leicht und filtern Sie dann mit einem 100-μm-Zellsieb und verwenden Sie ein Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortiersystem (FACS) bei 561 nm Anregungslaserlinie und 780/60-Filter, um die positiven CRX-tdTomato-Signale zu analysieren.
      HINWEIS: CRX exprimiert sich zunächst am Tag 45 und nimmt mit der Reifung der Organoide zu. Zehntausend Zellen werden für jeden Test verwendet, für jeden Zeitpunkt werden mindestens drei Wiederholungen abgeschlossen.
2. Quantifizierung der Fluoreszenzintensität von ROs
   1. Bereiten Sie die lebensfähigen Organoide zufällig für die Bildgebung vor.
      HINWEIS: Stellen Sie die Parameter ein und verwenden Sie dieselben Filter und Parameter für alle Fluoreszenzintensitätsmonitore.
   2. Erfassen Sie Bilder und analysieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität mit geeigneter Software (z. B. ImageJ).
   3. Importieren Sie die Bilder und konvertieren Sie sie dann mithilfe von Image | in 8-Bit. Typ.
   4. Passen Sie den Schwellenwert mithilfe der Standardparameter von Image | Anpassen | Schwellenwert.
   5. Bestimmen Sie den gemessenen Bereich, und werten Sie dann den Grauwert mithilfe von Analyze | Messen.
      HINWEIS: Die Mittelwerte im Ergebnispanel sind die mittlere Fluoreszenzintensität der gemessenen Fläche.

Ergebnisse

Die schematische Darstellung zeigt das Differenzierungsprotokoll zur Verbesserung von Vorläuferzellen mit COCO (Abbildung 1). Von PSC bis ROs können zahlreiche Details zu Ergebnisschwankungen führen. Es wird empfohlen, jeden Schritt und sogar die Katalognummer und Chargennummer jedes Mediums aufzuzeichnen, um den gesamten Vorgang zu verfolgen.

Hier stellen wir Hellfeldbilder für die Tage 6, 12, 18 und 45 bereit (Abbildung 2). An T...

Diskussion

Die retinale Organoiddifferenzierung ist eine wünschenswerte Methode zur Erzeugung reichlich funktionsfähiger Netzhautzellen. Die RO ist ein Verbund aus verschiedenen Netzhautzellen, wie Ganglienzellen, bipolaren Zellen und Photorezeptoren, die von pluripotenten Stammzellen in Richtung der neuronalen Netzhaut 4,5,8,9 erzeugt werden. Obwohl konfluente ROs geerntet werden könnten, ist es zeita...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
COCO	R&D Systems	3047-CC-050	DAN Domain family of BMP antagonists
DMEM/F-12	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells	Biological Industry	04-002-1A
GMEM	Gibco	11710-035
KnockOut Serum Replacement-Multi-Species	Gibco	A3181502
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)	sigma	M7145
Pen Strep	Gibco	15140-122
Primesurface 96 V-plate	Sbio	MS9096SZ	Cell aggregation in 1.2.7
Pyruvate	Sigma	S8636
Reagent A	BD	356231	Matrigel in 1.1.1
Reagent B	StemCell	5990	mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2
Reagent C	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2
Reagent D	Roche	11284932001	DNase I , in 1.2
Retinoic acid	Sigma	R2625-100MG
SAG	Enzo Life Science	ALX-270-426-M001
Supplement 1	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056	organoids dissociation in 2.1.3
Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem	Sigma	681669	Wnt inhibitor
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049