Induction dirigée d’organoïdes rétiniens à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Résumé

En utilisant une méthode d’auto-organisation, nous développons un protocole avec l’ajout de COCO qui pourrait augmenter considérablement la génération de photorécepteurs.

Résumé

La transplantation de cellules rétiniennes est une approche thérapeutique prometteuse, qui pourrait restaurer l’architecture rétinienne et stabiliser ou même améliorer les capacités visuelles de la rétine dégénérée. Néanmoins, les progrès dans la thérapie de remplacement cellulaire se heurtent actuellement aux défis de la nécessité d’une source standard de rétines humaines standardisées et de haute qualité. Par conséquent, un protocole facile et stable est nécessaire pour les expériences. Ici, nous développons un protocole optimisé, basé sur une méthode d’auto-organisation avec l’utilisation de molécules exogènes et de réactif A ainsi que l’excision manuelle pour générer les organoïdes tridimensionnels de la rétine humaine (RO). L’OI dérivée des cellules souches pluripotentes humaines (CSP) exprime des marqueurs spécifiques pour les photorécepteurs. Avec l’ajout de COCO, un antagoniste multifonctionnel, l’efficacité de différenciation des précurseurs et des cônes photorécepteurs est considérablement augmentée. L’utilisation efficace de ce système, qui présente les avantages des lignées cellulaires et des cellules primaires, et sans les problèmes d’approvisionnement associés à ces dernières, pourrait produire des cellules rétiniennes confluentes, en particulier des photorécepteurs. Ainsi, la différenciation des CSP en OI fournit une plate-forme optimale et biopertinente pour la modélisation des maladies, le dépistage de médicaments et la transplantation cellulaire.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes (CSP) se caractérisent par leur auto-renouvellement et leur capacité à se différencier en toutes sortes de cellules somatiques. Ainsi, les organoïdes dérivés des CSP sont devenus une ressource importante dans la recherche en médecine régénérative. La dégénérescence rétinienne est caractérisée par la perte de photorécepteurs (bâtonnets et cônes) et de pigment rétinien épithélium. Le remplacement des cellules rétiniennes pourrait être un traitement encourageant pour cette maladie. Cependant, il n’est pas possible d’obtenir des rétines humaines pour la recherche et le traitement des maladies. Par conséquent, les organoïdes rétiniens (RO) dérivés des CSP, qui récapitulent efficacement et avec succès les cellules rétiniennes natives multicouches, sont bénéfiques pour la recherche fondamentale et translationnelle ^1,2,3. Nos recherches portent sur la différenciation de l’OI afin de fournir des cellules suffisantes et de qualité pour étudier la dégénérescence rétinienne⁴.

Les méthodes de différenciation des OI émergent continuellement, avec la différenciation tridimensionnelle (3D) des suspensions mise au point par le laboratoire Sasai en 2012⁵. Nous avons introduit le marqueur CRX-tdTomato dans les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) pour suivre spécifiquement les cellules précurseurs des photorécepteurs et modifié la méthode avec l’ajout de COCO, un antagoniste multifonctionnel des voies Wnt, TGF-β et BMP⁶. Il a été démontré que COCO améliore efficacement l’efficacité de différenciation des précurseurs et cônes de photorécepteurs ^6,7.

Dans l’ensemble, en modifiant la méthode classique de différenciation, nous avons développé un protocole accessible pour récolter des précurseurs et des cônes de photorécepteurs abondants à partir d’OI humaines pour analyser la maladie rétinienne associée aux photorécepteurs par des investigations en laboratoire et pour une application clinique / transplantation ultérieure.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique institutionnel de l’hôpital Tongren de Beijing et de la Capital Medical University. Les CSEh H9 ont été obtenues auprès du WiCell Research Institute et génétiquement modifiées sur une lignée cellulaire marquée par tdTomato.

1. Génération d’OI humaines

1. Culture des CSEh dans des conditions sans mangeoire.
   1. Enduire un puits d’une plaque à 6 puits de 1 mL de 0,1 mg/mL du réactif A (tableau des matières) à 37 °C pendant au moins une demi-heure en suivant les instructions du fabricant. Décongeler une partie aliquote de 1x10⁶ CSEh.
      REMARQUE : Préparer 3 mL de réactif B préchauffé (Table des matières) et transférer les cellules cryoconservées (1 mL) dans 3 mL de milieu frais. Ne pipetez pas les CSEh sur des cellules individuelles.
   2. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min et retirer le surnageant.
   3. Ensemencer les cellules dans la plaque recouverte de réactif A avec 2 mL de réactif B et changer 2 mL de réactif B par jour. Cellules de passage lorsqu’elles atteignent environ 80% de confluence (généralement autour de 4 jours).
2. Jour 0
   1. Dissocier les CSEh en une suspension unicellulaire en utilisant le milieu I (tableau 1). Préparer le milieu I en mélangeant les éléments suivants : 20 % (v/v) de remplacement du sérum knockOut (KSR), 0,1 mM de solution d’acides aminés non essentiels MEM (NEAA), 1 mM de pyruvate, 3 μM d’IWR-1-endo (IWR1e), 30 ng/mL de COCO, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine (PS), 0,1 mM de β-mercaptoéthanol et le milieu essentiel minimal (GMEM) Eagle’s de Glasgow.
      REMARQUE : Avant le début de la dissociation, préparer le milieu I et transférer 12 mL de milieu I avec 20 μM Y-27632 dans une boîte de Petri de 10 cm, 500 μL de réactif C (Table des matières) contenant 0,05 mg/mL de réactif D (Table des matériaux) et 20 μM Y-27632 dans un tube de 1,5 mL. Effectuez les étapes ci-dessus dans l’obscurité, car le composant IWR1e dans le milieu I est sensible à la lumière.
   2. Lavez les CSEh avec 1x tampon de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco préchauffé.
   3. Ajouter le réactif préparé de 500 μL (dans le tube de 1,5 mL) et incuber les CSEh pendant 3,5 min à 37 °C et 5 % de CO₂.
   4. Détacher les cellules en remuant le côté et le fond de la plaque pendant quelques secondes et ajouter 500 μL de milieu I préparé de la boîte de Petri dans la plaque de CSEh.
      REMARQUE: Préparez un tube de 1,5 mL avec 900 μL de 1x DPBS et utilisez un hémocytomètre pour le comptage cellulaire.
   5. Récoltez les cellules dans un nouveau tube de 1,5 mL et pipettez la suspension cellulaire de haut en bas, puis retirez 100 μL du tube, puis ajoutez dans le tube 900 μL de DPBS pour le comptage cellulaire.
   6. Disperser la suspension cellulaire gauche de 900 μL, puis diluer les cellules avec le milieu I préparé dans la boîte de Petri à 9 x 10⁴ cellules/mL.
      REMARQUE : Le volume total du milieu est de 12 mL; 1,08 x 10⁶ cellules sont nécessaires au total.
   7. Ajouter 100 μL de suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque non adhérente à fond en V de 96 puits (Tableau des matériaux).
      REMARQUE: Utilisez une pipette multicanal pour raccourcir le temps et vous assurer que chaque puits contient un numéro de cellule équivalent. Secouez la boîte de Petri à chaque fois avant de retirer les portions de 100 μL. Il est important que les cellules soient uniformément réparties.
   8. Faire tourner légèrement la plaque de 96 puits dans un agitateur à basse vitesse pendant 5 minutes, puis incuber à 37 °C et 5 % de CO₂.
      REMARQUE: Gardez la plaque dans l’obscurité. Définissez le jour comme jour 0.
3. Jour 2
   1. Ajouter 1% de réactif A (Tableau des matériaux). Préparer le réactif A (concentration de protéines de 10 mg/mL) en ajoutant 133,4 μL de réactif A dans 2 mL de milieu I.
      NOTE: Maintenir le réactif A à 4 ° C pendant une nuit avant utilisation pour obtenir une fusion complète et uniforme. Veuillez noter les informations sur le produit et rechercher le numéro de catalogue et le numéro de lot sur le site officiel de la société pour avoir la concentration en protéines du réactif A car chaque bouteille de réactif A est à une concentration de protéine différente. Si la concentration en protéines est faible, un volume accru de réactif A serait utile.
   2. Ajouter 20 μL de réactif A préparé à chaque puits et pipeter deux fois au centre pour disperser les cellules mortes.
      REMARQUE : Entretenez le réactif A et la plaque de 96 puits dans des conditions fraîches et suivez toutes les étapes sur la glace. Placez l’assiette dans l’obscurité.
4. Jour 2-12
   1. Nettoyez le fond de la plaque de 96 puits et incuber à 37 °C et 5 % de CO₂ jusqu’au jour 6. Au jour 6, changer la moitié du milieu en retirant 58 μL du milieu de chaque puits et en ajoutant 60 μL de milieu I.
      REMARQUE: Utilisez une pipette multicanal pour effectuer le changement de demi-moyen. Effectuez cette étape avec douceur pour vous assurer qu’aucune pastille de cellule n’est retirée du puits. Aspirer le milieu dans une boîte de Petri propre de 10 cm. S’il y a des pastilles de cellules à l’intérieur, ajoutez-les à la plaque de 96 puits.
5. Jour 12- 18
   1. Changez le milieu à moyen II (tableau 1) au jour 12. Préparer le milieu II en utilisant le réactif A à 1 % (v/v) en mélangeant les éléments suivants : sérum fœtal bovin à 10 % (FBS), 0,1 mM de NEAA, 1 mM de pyruvate, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,1 mM de β-mercaptoéthanol, 100 nM de dichlorhydrate de SAG et GMEM. Conservez-le dans des conditions fraîches et sombres.
   2. Récolter les granulés cellulaires dans un tube conique de 15 ml de la plaque de 96 puits et laisser les granulés se déposer naturellement pendant 5 minutes à température ambiante.
      REMARQUE: Retirez le milieu et les granulés doucement sous la surface pour éviter les bulles.
   3. Retirez le surnageant tout en prenant soin des organoïdes. Transférer les agrégats cellulaires dans une capsule de suspension de 10 cm contenant 18 mL de milieu II préparé avec le réactif A.
      NOTE: Ne pas ajouter le milieu II préparé dans la capsule de 10 cm à l’avance, car le réactif A doit être à 4 °C.
   4. Incuber à 37 °C et 5% de CO₂ jusqu’au jour 18.
6. À partir du jour 18
   1. Remplacez le moyen par le moyen III (tableau 1). Préparer le milieu III dans des conditions sombres en mélangeant les éléments suivants : 10 % de FBS, 1xsupplément 1, 0,5 μM d’acide rétinoïque (PR), 100 μM de taurine, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 1:1 de mélange de milieu aigle modifié (DMEM)/mélange nutritif F-12 de Dulbecco.
   2. Le jour 18, lorsqu’une vésicule optique semi-transparente est générée, coupez les organoïdes à l’aide d’un couteau microchirurgical.
      NOTE: Fendre l’organoïde, généralement en quatre morceaux, dans une boîte de Pétri avec le milieu II. Chaque pièce devrait devenir une coupe optique intacte dans les semaines suivantes.
   3. Agrégez tous les granulés au centre du plat. Récoltez les cellules dans un tube conique de faucon de 15 ml et laissez la décantation naturelle. Retirez ensuite délicatement le surnageant.
      REMARQUE: En raison de leur taille, les organoïdes peuvent être agrégés au centre en faisant pivoter la boîte de Petri dans une direction sur 90 ° sur un plan horizontal plusieurs fois.
   4. Suspendre et disperser les granulés dans deux boîtes de Petri de 10 cm, avec 18 ml de milieu III par boîte, et transférer doucement les boîtes dans l’incubateur pour éviter l’agrégation cellulaire. Poursuivre la culture dans le milieu III à 37 °C et 5% de CO₂ et changer le milieu chaque semaine. Le CRX exprimé après le jour 45 et jusqu’au jour 120, nous avons pu détecter le segment externe du photorécepteur.

2. Analyse des RO humaines

1. Analyse FACS
   1. Assembler trois organoïdes CRX-tdTomato et trois organoïdes dérivés de H9 ES à partir des plats en utilisant les embouts coupés de 1 mL. Laver les organoïdes avec 1 mL de DPBS préchauffé (température ambiante).
   2. Préparer le tampon de digestion en mélangeant une solution de trypsine-EDTA à 0,25 % avec 0,05 mg/mL de réactif D.
   3. Dissocier les organoïdes en cellules individuelles en utilisant le tampon de digestion préparé pendant 8 min à 37 °C. Ajoutez ensuite le même volume de DPBS avec 10% FBS et 0,05 mg / mL de réactif D pour inactiver la réaction.
   4. Suspendre et disperser légèrement les cellules, puis filtrer à l’aide d’une crépine cellulaire de 100 μm et utiliser un système de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) à la ligne laser d’excitation de 561 nm et au filtre 780/60 pour analyser les signaux positifs CRX-tdTomato.
      NOTE: CRX s’exprime initialement au jour 45 et augmente avec la maturation des organoïdes. Dix mille cellules sont utilisées pour chaque test, pour chaque point temporel, au moins trois répétitions sont effectuées.
2. Quantification de l’intensité de fluorescence des OI
   1. Préparer les organoïdes viables au hasard pour l’imagerie.
      REMARQUE: Définissez les paramètres et utilisez les mêmes filtres et paramètres pour tous les moniteurs d’intensité de fluorescence.
   2. Capturez des images et analysez l’intensité moyenne de fluorescence à l’aide d’un logiciel approprié (p. ex., ImageJ).
   3. Importez les images, puis convertissez-les en 8 bits à l’aide d’Image | Type.
   4. Ajustez le seuil à l’aide des paramètres par défaut par Image | Ajuster | Seuil.
   5. Déterminez la zone mesurée, puis évaluez la valeur de gris à l’aide de l’option Analyser | Mesurer.
      NOTE: Les valeurs moyennes dans le panneau de résultats sont l’intensité de fluorescence moyenne de la zone mesurée.

Résultats

L’illustration schématique illustre le protocole de différenciation pour améliorer les cellules précurseurs avec COCO (Figure 1). Des PSC aux RO, de nombreux détails peuvent entraîner des variations de résultats. Il est recommandé d’enregistrer chaque étape et même le numéro de catalogue et le numéro de lot de chaque support pour suivre l’ensemble de la procédure.

Ici, nous fournissons des images en champ clair pour les jours 6, 12, 18 et 45 (

Discussion

La différenciation organoïde rétinienne est une méthode souhaitable pour la génération de cellules rétiniennes fonctionnelles amples. L’OI est un composite de différentes cellules rétiniennes, telles que les cellules ganglionnaires, les cellules bipolaires et les photorécepteurs, générés par les cellules souches pluripotentes vers la rétine neurale 4,5,8,9. Bien que les OI confl...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
COCO	R&D Systems	3047-CC-050	DAN Domain family of BMP antagonists
DMEM/F-12	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells	Biological Industry	04-002-1A
GMEM	Gibco	11710-035
KnockOut Serum Replacement-Multi-Species	Gibco	A3181502
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)	sigma	M7145
Pen Strep	Gibco	15140-122
Primesurface 96 V-plate	Sbio	MS9096SZ	Cell aggregation in 1.2.7
Pyruvate	Sigma	S8636
Reagent A	BD	356231	Matrigel in 1.1.1
Reagent B	StemCell	5990	mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2
Reagent C	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2
Reagent D	Roche	11284932001	DNase I , in 1.2
Retinoic acid	Sigma	R2625-100MG
SAG	Enzo Life Science	ALX-270-426-M001
Supplement 1	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056	organoids dissociation in 2.1.3
Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem	Sigma	681669	Wnt inhibitor
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049