Verwendung von Organkulturen vom Trowell-Typ zur Untersuchung der Regulation von dentalen Stammzellen

Zusammenfassung

Die Trowell-Typ-Organkulturmethode wurde verwendet, um komplexe Signalnetzwerke zu entschlüsseln, die die Zahnentwicklung steuern, und in jüngerer Zeit zur Untersuchung der Regulation von Stammzellen des kontinuierlich wachsenden Mausschneidezahns. Fluoreszenzreporter-Tiermodelle und Live-Imaging-Verfahren ermöglichen eingehende Analysen von dentalen Stammzellen und ihrer spezifischen Nischenmikroumgebung.

Zusammenfassung

Organentwicklung, -funktion und -regeneration hängen von Stammzellen ab, die sich in diskreten anatomischen Räumen befinden, die als Stammzellnischen bezeichnet werden. Der kontinuierlich wachsende Mausschneidezahn bietet ein hervorragendes Modell, um gewebespezifische Stammzellen zu untersuchen. Die epithelgewebespezifischen Stammzellen des Schneidezahns befinden sich am proximalen Ende des Zahnes in einer Nische, der sogenannten Zervixschleife. Sie sorgen für einen kontinuierlichen Zellzustrom, um den ständigen Abrieb der selbstschärfenden Zahnspitze auszugleichen. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Kultur des proximalen Endes des Mausschneidezahns vorgestellt, in dem sich Stammzellen und ihre Nische befinden. Dies ist ein modifiziertes Organkulturprotokoll vom Typ Trowell, das die In-vitro-Kultur von Gewebestücken (Explantaten) sowie der dicken Gewebescheiben an der Flüssig-Luft-Grenzfläche auf einem Filter ermöglicht, der von einem Metallgitter unterstützt wird. Das hier beschriebene Organkulturprotokoll ermöglicht Gewebemanipulationen, die in vivo nicht durchführbar sind, und in Kombination mit der Verwendung eines fluoreszierenden Reporters bietet es eine Plattform für die Identifizierung und Verfolgung diskreter Zellpopulationen in lebenden Geweben im Laufe der Zeit , einschließlich Stammzellen. Verschiedene regulatorische Moleküle und pharmakologische Verbindungen können in diesem System auf ihre Wirkung auf Stammzellen und deren Nischen getestet werden. Dies ist letztendlich ein wertvolles Werkzeug, um die Regulation und Aufrechterhaltung von Stammzellen zu untersuchen.

Einleitung

Mausschneidezähne wachsen kontinuierlich aufgrund der lebenslangen Erhaltung der Stammzellen (SC), die die unaufhörliche Produktion von Zahnkomponenten unterstützen. Dazu gehören epitheliale SCs, die unter anderem schmelzproduzierende Ameloblasten erzeugen, und mesenchymale Stammzellen (MSCs), die Dentin produzierende Odontoblasten erzeugen¹. Die epithelialen SCs in den kontinuierlich wachsenden Schneidezähnen wurden zunächst als markierungserhaltende Zellen^2,3 identifiziert und es wurde seitdem gezeigt, dass sie eine Reihe bekannter Stammnessgene^, einschließlich Sox2^4....

Protokoll

Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von Tieren und alle Verfahren wurden von den Ethikkommissionen für die Verwendung und Pflege von Tieren und der Tiereinrichtung der Universität Helsinki genehmigt.

1. Zubereitung der Organkulturschale

1. Führen Sie alle Verfahren in einer Laminar-Flow-Haube durch. Reinigen Sie Arbeitsflächen mit 70% Ethanol und verwenden Sie Instrumente und Lösungen aus autoklaviertem Glas. Sterilisieren Sie Scheren und andere Metallgeräte in einem Glasperlensterilisator.
2. Bereiten Sie Filter vor, die normalerweise in 70% Ethanol gelagert werden, indem Sie sie dreimal in 1x PBS waschen, um Ethanol z....

Ergebnisse

Die epithelialen SCs befinden sich in einer Nische, die als zervikale Schleife bezeichnet wird und sich am proximalen Ende des Schneidezahns befindet (Abbildung 3A). Zervikale Schleifen sind morphologisch unterschiedliche Strukturen, die aus innerem und äußerem Schmelzepithel bestehen und das Sternretikulum, einen Kern locker angeordneter Epithelzellen, umhüllen (Abbildung 3B,C). Es gibt zwei zervikale Schleifen in jedem Schneidezahn (

Diskussion

In-vitro-Organkultur wurde ausgiebig verwendet, um induktives Potenzial und epithelial-mesenchymale Wechselwirkungen zu untersuchen, die das Organwachstum und die Morphogenese steuern. Das Thesleff-Labor hat gezeigt, wie die Saxén-Modifikation der Organkultur vom Trowell-Typ angepasst und zur Untersuchung der Zahnentwicklung verwendet werden kann¹⁴. Die reproduzierbaren Bedingungen und Fortschritte bei fluoreszierenden Reportern haben dies zu einer nützlichen Methode zur Überwachung de.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-mL plastic syringes
Disposable 20/26 gauge hypodermic needles	Terumo
DMEM	Gibco	61965-026
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14287
Extra Fine Bonn Scissors	F.S.T.	14084-08
F-12	Gibco	31765-027
FBS South American (CE)	LifeTechn.	10270106	divide in aliquotes, store at -20°C
Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer	Simon Keller Ltd	4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	35050-038
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter	MerckMillipore	VCTP02500	Store in 70% ethanol at room temperature.
L-Ascobic Acid	Sigma	A4544-25g	diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C
Low melting agarose	TopVision	R0801
Metal grids			Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.
Micro forceps	Medicon	07.60.03
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich
Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.	Gibco	15140-148
Petri dishes, Soda-Lime glass	DWK Life Sciences	9170442
Petridish 35 mm, with vent	Duran	237554008
Petridish 90 mm, no vent classic	Thermo Fisher	101RT/C
Small scissors