Die automatisierten Kristallographie-Pipelines in der EMBL HTX-Anlage in Grenoble

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir, wie die automatisierten makromolekularen Kristallographie-Pipelines für Protein-zu-Struktur, schnelle Liganden-Protein-Komplex-Analyse und großflächiges Fragment-Screening basierend auf der CrystalDirect-Technologie im HTX-Labor in EMBL Grenoble verwendet werden können.

Zusammenfassung

Das EMBL Grenoble betreibt das High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), eine Großverbrauchereinrichtung, die Anwendern weltweit Kristallographie-Dienstleistungen mit hohem Durchsatz anbietet. Das HTX-Labor hat einen starken Fokus auf die Entwicklung neuer Methoden in der makromolekularen Kristallographie. Durch die Kombination einer Hochdurchsatz-Kristallisationsplattform, der CrystalDirect-Technologie für vollautomatische Kristallmontage und Kryokühlung und der CRIMS-Software haben wir vollautomatische Pipelines für die makromolekulare Kristallographie entwickelt, die über das Internet ferngesteuert werden können. Dazu gehören eine Protein-zu-Struktur-Pipeline zur Bestimmung neuer Strukturen, eine Pipeline zur schnellen Charakterisierung von Protein-Liganden-Komplexen zur Unterstützung der medizinischen Chemie und eine groß angelegte, automatisierte Fragment-Screening-Pipeline, die die Auswertung von Bibliotheken von über 1000 Fragmenten ermöglicht. Hier beschreiben wir, wie Sie auf diese Ressourcen zugreifen und diese verwenden können.

Einleitung

Die Automatisierung wurde in allen Schritten des experimentellen Prozesses der makromolekularen Kristallographie eingeführt, von der Kristallisation bis zur Gewinnung und Verarbeitung von Beugungsdaten^{1,2,3,4,5,6,7,8,9}, einschließlich einer Reihe von Technologien für die Probenmontage^{10,11,12 ,13,14,15,16,17}. Dies hat nicht nur das Tempo beschleunigt, mit dem kristallographische Strukturen erhalten werden, sondern auch dazu beigetragen, Anwendungen wie das strukturgesteuerte Arzneimitteldesign^{18,19,20,21,22,23},^24zurationalisieren. In diesem Manuskript beschreiben wir einige Aspekte der automatisierten Kristallographie-Pipelines, die im HTX-Labor in Grenoble verfügbar sind, sowie die zugrunde liegenden Technologien.

Das HTX-Labor am EMBL Grenoble ist eine der größten akademischen Einrichtungen für Kristallisationsscreening in Europa. Es befindet sich auf dem European Photon and Neutron (EPN) Campus zusammen mit der European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), die einige der brillantesten Röntgenstrahlen der Welt erzeugt, und dem Institut Laue Langevin (ILL), das Neutronenstrahlen mit hohem Fluss bereitstellt. Seit der Inbetriebnahme im Jahr 2003 hat das HTX-Labor über 800 Wissenschaftler betreut und verarbeitet mehr als 1000 Proben pro Jahr. Das HTX-Labor konzentriert sich stark auf die Entwicklung neuer Methoden in der makromolekularen Kristallographie, einschließlich Methoden zur Probenbewertung und Qualitätskontrolle^25,26 und der CrystalDirect-Technologie, die eine vollautomatische Kristallmontage und -verarbeitung ermöglicht^15,16,17. Das HTX-Labor hat auch das Crystallographic Information Management System (CRIMS) entwickelt, ein webbasiertes Laborinformationssystem, das eine automatisierte Kommunikation zwischen Kristallisations- und Synchrotrondatenerfassungseinrichtungen ermöglicht und einen ununterbrochenen Informationsfluss über den gesamten Probenzyklus vom reinen Protein bis zu den Beugungsdaten ermöglicht. Durch die Kombination der Kapazitäten der HTX-Anlage, der CrystalDirect-Technologie und der CRIMS-Software haben wir vollautomatische Protein-zu-Struktur-Pipelines entwickelt, die Kristallisationsscreening, Kristalloptimierung, automatisierte Kristallernteverarbeitung sowie Kryokühlung und Röntgendatenerfassung an mehreren Synchrotrons in einem einzigen und kontinuierlichen Workflow integrieren, der über einen Webbrowser ferngesteuert werden kann. Diese Pipelines können eingesetzt werden, um die schnelle Bestimmung neuer Strukturen, die Charakterisierung von Protein-Liganden-Komplexen und das großflächige Screening von Verbindungen und Fragmenten durch Röntgenkristallographie zu unterstützen.

Das HTX-Labor ist mit einem nicht-volumenförmigen Kristallisationsroboter (einschließlich eines LCP-Moduls, das die Kristallisation von löslichen und Membranproteinen ermöglicht), Kristallfarmen (bei 5 ° C und 20 ° C), zwei Roboter-Liquid-Handling-Stationen zur Vorbereitung von Kristallisationssieben und zwei automatisierten CrystalDirect-Kristallerntemaschinen mit der Kapazität zur Herstellung und Lagerung von bis zu 400 gefrorenen Probenstiften pro Betriebszyklus ausgestattet. Die Wissenschaftler senden ihre Proben per Expresskurier an die Einrichtung, die dann von engagierten Technikern im HTX-Labor verarbeitet werden. Wissenschaftler können Kristallisations-Screening- und Optimierungsexperimente über eine vom CRIMS-System bereitgestellte Webschnittstelle aus der Ferne entwerfen. Über diese Schnittstelle können sie aus einer Vielzahl von Parametern und experimentellen Protokollen wählen, die in der Einrichtung verfügbar sind, um ihre spezifischen Probenanforderungen zu erfüllen. Die Ergebnisse werden den Anwendern zusammen mit allen experimentellen Parametern in Echtzeit über CRIMS zur Verfügung gestellt. Alle erhaltenen Proben werden mit einer speziell entwickelten Methode untersucht, die es ermöglicht, die Kristallisationswahrscheinlichkeit der Probe^25,26,27abzuschätzen. Basierend auf den Ergebnissen dieses Assays werden den Anwendern spezifische Empfehlungen bezüglich der optimalen Inkubationstemperatur und möglicher Probenoptimierungsexperimente gegeben. Sobald Kristallisationsexperimente eingerichtet sind, können Wissenschaftler die Ergebnisse auswerten, indem sie Kristallisationsbilder betrachten, die zu verschiedenen Zeitpunkten über das Internet gesammelt wurden. Wenn Kristalle identifiziert werden, die für Röntgenbeugungsexperimente geeignet sind, können Wissenschaftler eine dedizierte Schnittstelle verwenden, um einen Kristallmontageplan zu erstellen, der dann vom CrystalDirect-Roboter ausgeführt wird.

Die CrystalDirect-Technologie basiert auf der Verwendung einer modifizierten Dampfdiffusionskristallisationsmikroplatte und eines Laserstrahls zur Montage und Kryokühlung von Kristallproben in beugungskompatiblen Trägern, die die Automatisierungslücke zwischen Kristallisation und Datenerfassung^{schließen 15,16,17}. Kurz gesagt, Kristalle werden in einer modifizierten Dampfdiffusionsplatte, der CrystalDirect-Mikroplatte, gezüchtet. Sobald Kristalle erscheinen, wendet der CrystalDirect-Ernteroboter automatisch einen Laserstrahl an, um ein Filmstück, das den Kristall enthält, zu schneiden, es an einem Standard-Beugungsdatenerfassungsstift zu befestigen und es in einem Stickstoffgasstrom kryogekühlt zu kühlen (siehe Zander et al. 2016 und https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8 ). Diese Technologie hat eine Reihe zusätzlicher Vorteile gegenüber manuellen oder halbautomatischen Kristallmontageprotokollen. Zum Beispiel ist die Größe und Form der Kristalle kein Problem, so dass es ebenso einfach ist, große Kristalle oder Mikrokristalle zu ernten, es ist oft möglich, die Verwendung von Kryoschutzmitteln zu vermeiden, aufgrund der besonderen Art und Weise, in der die Technologie funktioniert (siehe Referenz 17, Zander et al.), was die Röntgenbeugungsanalyse viel einfacher macht. Der Laserstrahl kann auch als chirurgisches Werkzeug verwendet werden, um die besten Teile einer Probe auszuwählen, wenn Kristalle auf Clustern wachsen oder beispielsweise epitaktisches Wachstum zeigen. Die CrystalDirect-Technologie kann auch für automatisierte Einweichexperimente verwendet werden¹⁷. Lieferung von Lösungen mit kleinen Molekülen oder anderen Chemikalien an Kristalle. Dadurch ermöglicht es die Unterstützung eines vollautomatischen, großflächigen Compound- und Fragment-Screenings. Sobald die Kristalle vom CrystalDirect-Roboter geerntet und kryokooliert wurden, werden sie entweder auf SPINE- oder Unipuck-Pucks übertragen, die mit den meisten synchronen makromolekularen Kristallographie-Beamlines auf der ganzen Welt kompatibel sind. Das System kann bis zu 400 Pins (die Kapazität des kryogenen Speichers Dewar) völlig autonom ernten. CRIMS kommuniziert während des Prozesses mit dem Harvesterroboter und ermöglicht die automatisierte Verfolgung von Kristallproben (Pucks und Pins). Pucks sind sowohl mit Barcodes als auch mit RFID-Tags gekennzeichnet, um das Probenmanagement zu erleichtern^21,28.

CRIMS bietet eine Anwendungsprogrammierschnittstelle (API), die die automatisierte Kommunikation mit dem ISPyB-System unterstützt und die Verwaltung und Verarbeitung von Röntgendaten an vielen Synchrotrons in Europa und der Welt unterstützt²⁹. Nach Abschluss der automatisierten Kristallernte können Wissenschaftler Kristallproben (Pucks) auswählen und Probensendungen für die makromolekularen Kristallographie-Beamlines entweder an den ESRF (Grenoble, Frankreich)^7,8,9 oder Petra III Synchrotrons (Hamburg, Deutschland)^18,19erstellen . CRIMS übertragen die Den ausgewählten Beamline-Proben entsprechenden Daten zusammen mit vorausgewählten Datenerfassungsparametern an das Synchrotron-Informationssystem. Sobald die Proben an der ausgewählten Synchrotron-Beamline angekommen sind, erfolgt die Röntgendatenerfassung entweder manuell, durch Fern-Beamline-Betrieb oder vollautomatisch (d.h. an der MASSIF-1-Beamline der ESRF^8, die von der gemeinsamen EMBL ESRF Joint Structural Biology Group (JSBG) betrieben wird). Nach der Datenerfassung ruft CRIMS automatisch Informationen über die Ergebnisse der Datenerhebung zusammen mit den ersten Datenverarbeitungsergebnissen der Synchrotron-Datenverarbeitungssysteme ab und präsentiert sie dem Wissenschaftler über eine komfortable Benutzeroberfläche.

Das HTX-Labor wendet diese automatisierten Pipelines an, um drei verschiedene Anwendungen zu unterstützen: schnelle Bestimmung neuer Strukturen, schnelle Charakterisierung von Protein-Liganden-Komplexen und großflächiges Compound- und Fragment-Screening. Im Folgenden beschreiben wir, wie sie zu verwenden und zu bedienen sind.

Protokoll

HINWEIS: Der finanzierte Zugang zu diesen Pipelines für Wissenschaftler weltweit wird durch eine Reihe von Förderprogrammen unterstützt. Zum Zeitpunkt der Abfassung dieses Manuskripts werden Anträge auf Zugang entweder über das iNEXT Discovery-Programm (https://inext-discovery.eu), ein europäisches Einrichtungsnetzwerk zur Förderung der translationalen Strukturbiologie^20, das durch das Horizon 2020-Programm der Europäischen Kommission finanziert wird, oder über INSTRUCT-Eric (https://instruct-eric.eu/) angenommen. Wenden Sie sich an den entsprechenden Autor, um die aktuellen Modalitäten und Routen für den finanzierten Zugang zu einem bestimmten Zeitpunkt zu erhalten. Dieses Protokoll beschreibt den Betrieb der Protein-zu-Struktur-Pipeline und enthält Schritte, die allen unseren Pipelines gemeinsam sind, während die Besonderheiten für die beiden anderen Pipelines im folgenden Abschnitt erörtert werden. Die Anleitung hier bezieht sich auf CRIMS V4.0.

1. Hochdurchsatz-Kristallisationslabor

1. Bevor Sie beginnen, bitten Sie um Registrierung im HTX-Labor über das CRIMS-System https://htxlab.embl.fr/#/. Die Benutzeranmeldeinformationen ermöglichen den Fernzugriff auf alle experimentellen Design- und Evaluierungsschnittstellen.
   1. Melden Sie sich über einen Web-Navigator bei CRIMS an (Firefox, Chrome und Safari werden unterstützt). Der CRIMs-Webserver ist verschlüsselt, um zu verhindern, dass Dritte auf Daten zugreifen, während sie durch das Internet reisen. Einmal in CRIMS, hilft eine Reihe von Menüs auf der linken Seite des Screenings, Proben zu verwalten und zu erstellen, Kristallisationsexperimente anzufordern, Platten zu verwalten und zu visualisieren usw. Eine Reihe von Video-Tutorials finden Sie unter https://medias01-web.embl.de/Mediasite/Showcase/embl/Channel/a2168bcaa36b4564851663e5b69594014d.
      HINWEIS: Benutzer, die Proben per Kurier versenden, müssen die Proben und die angeforderten Kristallisationsexperimente vor dem Senden der Probe über CRIMS registrieren, um sicherzustellen, dass sie bei der Ankunft unverzüglich verarbeitet werden können. Bitte senden Sie die Sendungsdetails an htx@embl.fr.
2. Loggen Sie sich mit einem Webbrowser in CRIMS (https://htxlab.embl.fr ) ein und klicken Sie auf das Beispielmenü. Dadurch wird eine Schnittstelle zu Projekt- und Probenverwaltungstools geöffnet.
3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neues Beispiel und geben Sie die angeforderten Informationen ein. CRIMS ermöglicht es, Proben unter verschiedenen Projekten, Zielen und Konstrukten zu organisieren. Weisen Sie das Beispiel vorhandenen Beispielen zu oder erstellen Sie an dieser Stelle neue.
4. Sobald die angeforderten Informationen eingegeben wurden, klicken Sie auf Speichern & Anfrage stellen. Wählen Sie das Kristallisationsprotokoll, die zu verwendenden Kristallisationssiebe, die Inkubationstemperatur und den gewünschten Termin für die Experimente.
   1. Verwenden Sie die Kommentarfelder, um Hinweise auf die Proben zu geben, die für die HTX-Laborbetreiber wichtig sind. Es können auch benutzerdefinierte Bildschirme ausgewählt werden (siehe unten). Nach dem Absenden der Kristallisationsanfrage wird diese vom HTX Lab Team validiert und eine Bestätigung über die Planung der Experimente per E-Mail verschickt. Stellen Sie sicher, dass Sie Testdaten auswählen, die mit den für den Probenversand erforderlichen Zeiten kompatibel sind.
5. Sobald die Proben in der Anlage eingetroffen sind, führen die Bediener im HTX-Labor die Experimente wie gewünscht durch. Sobald Kristallisationsexperimente eingerichtet sind, wird eine Bestätigung per E-Mail gesendet und Kristallisationsschalen werden an die automatisierten Imager übertragen. CRIMS bietet Zugriff auf alle experimentellen Parameter und verfolgt automatisch neue Bildgebungssitzungen. E-Mail-Benachrichtigungen werden automatisch gesendet, wenn neue Bilder verfügbar sind. Ein thermofluorbasiertes Experiment zur Qualitätsbewertung von³⁰ Proben auf der Grundlage eines in der Einrichtung^25,26 entwickelten Protokolls wird mit jeder Probe zu diesem Zeitpunkt durchgeführt und wird über CRIMS verfügbar sein.
6. Bilder der Kristallisationsexperimente zusammen mit den Ergebnissen der Probenqualitätsbewertung werden kurz nach dem Aufbau der Kristallisationsschalen in CRIMS verfügbar sein. Klicken Sie auf das Menü Thermofluor und navigieren Sie zur Probe, um die Ergebnisse des Experiments zur Bewertung der Probenqualität anzuzeigen.
   1. Klicken Sie auf das Menü Platten, um die Bilder der Kristallisationsplatten anzuzeigen. Navigieren Sie zum Beispiel und klicken Sie entweder auf Ansicht, um die letzte Imaging-Sitzung anzuzeigen, oder auf das + (erweitern)-Symbol, um eine andere Imaging-Sitzung auszuwählen. Eine Reihe von Tools hilft, die Beispiele leicht zu finden und zu navigieren. Wenn Sie beispielsweise in ein Projektfeld oben auf den Bildschirmen klicken, werden Beispiele für dieses Projekt gefiltert, und suchfunktionen sind für die meisten Tabellenspalten verfügbar.
7. Verwenden Sie die Plate View-Schnittstelle, um die Ergebnisse der Kristallisationsexperimente zu bewerten und zu bewerten. Es ermöglicht beispielsweise die Navigation durch die verschiedenen Vertiefungen der Kristallisationsplatten, die Auswahl von Bildtypen (z. B. Vis, UV), die Auswahl der Bildauflösung oder die Aufzeichnung von Werten. Diese Grenzfläche liefert auch alle experimentellen Parameter, die für die Kristallisationsexperimente verwendet werden, einschließlich der Zusammensetzung der Kristallisationslösungen.
8. Klicken Sie auf das Menü Verfeinerung, um Kristalloptimierungsbildschirme basierend auf den primären Trefferbedingungen zu entwerfen, die durch das erste Screening identifiziert wurden. Die Untermenüs Chemicals und Stock Solutions ermöglichen es, die Kristallisationsbestandslösungen zu registrieren und zu verwalten. Das Untermenü Bildschirme bietet Zugriff auf eine Benutzeroberfläche, um Eigene Optimierungs- oder benutzerdefinierte Bildschirme zu entwerfen.
   1. Wählen Sie den Plattentyp, die Standardlösungen oder die Gradientenkonfigurationen aus, die am besten zum experimentellen Design passen. Es ist möglich, CRIMS zu bitten, eine Datei auszugeben, die direkt mit dem Formulator Robot (Formulatrix) kompatibel ist, um die Bildschirme automatisch in die Platte zu pipettieren oder ein druckbares Dokument mit den Bänden für den manuellen Betrieb auszugeben.
9. Durchlaufen Sie die Schritte 1.2-1.8, um Kristalloptimierungsexperimente durchzuführen.
10. Sobald Kristalle identifiziert sind, die für Röntgenbeugungsexperimente geeignet sind, navigieren Sie zur Oberfläche der Platte View und wählen Sie das Bild aus, das dem richtigen Kristallisationstropfen entspricht. Vorgespeicherte Partituren helfen Ihnen dabei, dies einfach zu tun.
    1. Klicken Sie entweder auf Crystal Harvesting, um einen automatisierten Kristallernteplan für den CrystalDirect-Harvesterroboter aufzuzeichnen, oder auf Manual Harvesting für die herkömmliche manuelle Kristallmontage, wenn SIE CRIMS in einer Einrichtung verwenden, die nicht mit CrystalDirect ausgestattet ist. Beide Schnittstellen führen den Benutzer durch den Kristallgewinnungsprozess. CRIMS zeichnet automatisch den Standort der geernteten Kristalle auf und speichert sie entweder in SPINE oder Unipucks²¹.
11. Wählen Sie in CRIMS das Menü Crystal Manager aus. Klicken Sie auf das Untermenü Geerntete Kristalle, um die gefrorenen Proben zu inspizieren. Bei Verwendung des CrystalDirect-Harvesters werden Bilder des Ernteprozesses angezeigt, einschließlich Bilder der Pins mit den geernteten Kristallen.
12. Wählen Sie das Menü Sendungen aus, um eine Verbindung zu ESRF- oder Petra III-Synchrotrons herzustellen und Probensendungen für die Röntgenbeugungsanalyse zu erstellen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Sendung erstellen und wählen Sie das Synchrotron aus, das Sie verwenden möchten, und die Taschennummer (das Taschenpasswort am Synchrotron ist hier erforderlich). Die nächste Reihe von Schnittstellen wird verwendet, um die Pukcs auszuwählen, die in die Lieferung aufgenommen werden sollen. Das System ermöglicht es, Kommentare zur Unterstützung der Datenerfassung bereitzustellen und Datenerfassungsparameter für automatisierte Beamlines wie MASSIF-1 zu bestimmen.
13. Wenn die Datenerhebung im ESRF- oder Petra III HTX-Labor durchgeführt wird, übertragen die Betreiber die Proben an die Beamline, die Datenerfassung an anderen Synchrotrons erfolgt auf eigene Kosten des Benutzers. Es ist möglich, Daten zu sammeln, indem man zum Synchrotron reist, durch Fern-Beamline-Betrieb oder bei MASSIF-1. Im letzteren Fall ist der Datenerfassungsprozess vollständig automatisiert. Am Synchrotron ermöglichen spezifische Schnittstellen in ISPyB²⁹ den Benutzern, die von CRIMS gesendeten Informationen wiederherzustellen und Ihm Probenpucks zuzuordnen, so dass die Ergebnisse der Datenerfassung automatisch verfolgt werden. Für die hier beschriebenen Experimente wurde die Datenerfassung an Synchrotrons typischerweise mit der Software MXcube³¹ durchgeführt, während die Datenverarbeitung und Strukturverfeinerung mit atuoPROC³², Staraninso³³, BUSTER³³, Pipedream^32,33 und Coot³⁵durchgeführt wurde.
14. Sobald Datenerfassungsexperimente durchgeführt wurden, ruft CRIMS zusammenfassende Informationen zusammen mit Ergebnissen der anfänglichen Datenverarbeitung am Synchrotron aus dem ISPyB^29-System ab. Gehen Sie zum CRIMS Crystal Manager-Menü und klicken Sie auf das Untermenü Crystal Diffraction Data. Alle Informationen und Metadaten zur Beugungsdatenerfassung sind verfügbar. Es ist auch möglich, verarbeitete Daten aus dem Synchrotron sowie rohe Beugungsbilder herunterzuladen. Zeigen Sie mehrere Datensammlungen an, oder wählen Sie bestimmte Datasets aus. Beispielverwaltungstools ermöglichen das Navigieren und Auswählen von Beispielen für bestimmte Projektkonstrukte.
    HINWEIS: Diese Pipeline ermöglicht den vollautomatischen Betrieb über das Internet von reinen Protein- bis hin zu Röntgenbeugungsergebnissen und kann mit einer oder mehreren Proben gleichzeitig betrieben werden. Es kann auf verschiedene Kontexte und Projekttypen in der Strukturbiologie angewendet werden.

Ergebnisse

Die oben beschriebene automatisierte Kristallographie-Pipeline wurde eingesetzt, um eine große Anzahl von internen und externen Projekten mit bemerkenswertem Erfolg zu unterstützen. Einige Highlights sind das Projekt von Djinović-Carugo und Mitarbeitern der Max Perutz Laboratories (Wien), das sich auf die strukturelle und funktionelle Analyse einer Dipeptidylpeptidase konzentriert, die für das Wachstum eines bakteriellen Krankheitserregers unerlässlich ist. Die schnelle Abfolge von Kristallisationsscreening, Beugungsbewertung, Kristalloptimierung und Röntgendatenerfassungszyklen (bis zu 8 Iterationen für dieses Projekt) ermöglichte es, in nur wenigen Wochen Strukturmodelle für drei verschiedene Konformationszustände des Proteins zu erhalten, die ein wichtiges mechanistisches Verständnis für die Funktion dieser Proteinklasse lieferten³⁶ (siehe Abbildung 1).

Ein weiteres Beispiel sind die von Macias und Mitarbeitern des Institute of Biomedical Research (IRB, Barcelona), die bioinformatische Werkzeuge und strukturelle Ansätze kombinierten, um neue DNA-Bindungsmotive für die SmAD3- und SMAD4-Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, die an der Regulation des Zellschicksals beteiligt sind. Diese Arbeit hat 6 hochauflösende Strukturen von SMAD3 & 4 in Komplexen mit verschiedenen DNA-Bindungsmotiven³⁷,^{38 produziert,}die eine bisher ungeahnte Fähigkeit dieser Transkriptionsfaktoren aufzeigen, eine Vielzahl von DNA-Sequenzen zu erkennen und an sie zu binden, was für die Interpretation ihrer Funktion in verschiedenen biologischen Kontexten von entscheidender Bedeutung ist. Diese Technologien wurden auch zur Unterstützung der proprietären Forschung im Rahmen von Arzneimitteldesignprojekten von Forschungsgruppen in Pharma- und Biotech-Unternehmen eingesetzt. Dank der Schnelligkeit, die diese Pipelines beitragen, kann beispielsweise die strukturelle Analyse mehrerer Liganden-Ziel-Komplexe innerhalb weniger Tage erreicht werden, was für die Unterstützung der optimierung der medizinischen Chemie im Rahmen der Arzneimittelentwicklung in aufeinanderfolgenden Runden von großem Wert ist. Schließlich haben wir diese Infrastruktur auch für das großflächige röntgenbasierte Fragmentscreening³⁹angewendet.

Abbildung 1: Automatisierte Kristallographie-Pipeline. Der integrierte Betrieb des EMBL HTX-Labors einschließlich der CrystalDirect-Technologie und der CRIMS-Software mit der MASSIF-1-Beamline bei ESRF und der automatisierten Kommunikation zwischen der CRIMS- und ISPyB-Software ermöglicht die Unterstützung einer vollautomatischen, ferngesteuerten Protein-zu-Struktur-Pipeline, die Kristallisationsscreening und -optimierung, automatisierte Kristallgewinnung und Kryokühlung sowie automatisierte Datenerfassung und -verarbeitung integriert. Die Strukturmodelle entsprechen drei verschiedenen Konformationszuständen einer Protease aus einem pathogenen Bakterium, die in Rekordzeit durch Anwendung dieser Pipeline^{identifiziert wurden 36}. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die hier beschriebenen automatisierten Kristallographie-Pipelines stehen Forschenden weltweit über verschiedene Förderprogramme zur Verfügung. Derzeit kann der finanzierte Zugang für Kristallisationsexperimente und die CrystalDirect-Technologie durch die Beantragung des iNEXT Discovery-Programms und INSTRUCT-ERIC erhalten werden, während der Zugang zu makromolekularen Kristallographie-Beamlines an der ESRF durch das ESRF-Benutzerzugriffsprogramm unterstützt wird. Dieser Ansatz minimiert die Verzögerung zwischen Kristallwachstum und -messung, beschleunigt den Fortschritt sehr anspruchsvoller Projekte, die eine beugungsbasierte Optimierung der Proteinproduktions- und Kristallisationsbedingungen erfordern, und befreit Wissenschaftler von komplexen Operationen im Zusammenhang mit Kristallisation, Kristallhandhabung und Beamline-Betrieb, wodurch die Kristallographie für Nicht-Expertengruppen zugänglicher wird. Es kann auch für die schnelle Exploration von Kristallisationsadditiven, Phasing-Agenten oder für das Compound-Screening durch Co-Kristallisationsexperimente verwendet werden. Während die meisten Kristallographieprojekte potenziell von diesem Ansatz profitieren könnten, erfordern einige Proben möglicherweise spezielle Protokolle, die nicht für die Automatisierung oder die hier vorgestellten Pipelines zugänglich sind, z. B. solche, die mikrofluidische Systeme oder hochspezialisierte Kristallisationsgeräte oder Proben erfordern, die extrem labil sind und den Versand nicht tolerieren würden.

Die CrystalDirect-Technologie ermöglicht auch das automatisierte Einweichen von^{Kristallen 17} zur Charakterisierung von kleinmolekularen Zielkomplexen. Dazu wird mit dem Laser vor dem Ernteprozess eine kleine Öffnung erzeugt und ein Tropfen einer Lösung, die die gewünschten Chemikalien (d.h. Phasing-Mittel oder potenzielle Liganden) enthält, wird oben hinzugefügt, so dass sie in Kontakt mit der Kristallisationslösung eintritt und in diese diffundiert und schließlich den Kristall erreicht. Chemische Lösungen können in Wasser, DMSO oder anderen organischen Lösungsmitteln formuliert werden. Nach einer gewissen Inkubationszeit können die Kristalle wie oben beschrieben geerntet und durch Beugung analysiert werden. Dieser Ansatz wurde sowohl auf die schnelle Charakterisierung von Liganden-Protein-Komplexen im Rahmen des strukturbasierten Wirkstoffdesigns als auch auf das großflächige Wirkstoff- und Fragmentscreening angewendet. Im letzteren Fall können Fragmentbibliotheken mit Hunderten bis über tausend Fragmenten schnell analysiert werden. Spezifische CRIMS-Schnittstellen, die hier nicht vorgestellt werden, erleichtern das Design und die automatisierte Verfolgung von Kristalleinweichexperimenten, während die Integration zwischen der CRIMS-Software und der von Global Phasing Ltd (UK) entwickelten Pipedream-Software-Suite eine automatisierte Datenverarbeitung, Phasenphasenbildung, Ligandenidentifikation und Strukturverfeinerung über Hunderte von Datensätzen parallel ermöglicht und die Datenanalyse und -interpretation rationalisiert^32,33 . Zum Beispiel wurde diese Pipeline kürzlich auf die Identifizierung von Fragmenten angewendet, die sowohl an das aktive Zentrum als auch an mehrere allosterische Stellen der Trypanosoma brucei Farnesylpyrophosphat-Synthase binden, einem Schlüsselenzym des Parasiten, der die menschliche afrikanische Trypanosomiasis verursacht.

Die hier vorgestellten Pipelines können dazu beitragen, das Entdeckungstempo in der Strukturbiologie zu beschleunigen und die makromolekulare Kristallographie für eine größere Anzahl von Forschungsgruppen zugänglicher zu machen. Darüber hinaus können sie durch die Erleichterung eines groß angelegten Wirkstoff- und Fragmentscreenings dazu beitragen, die translationale Forschung zu fördern und den Prozess der Arzneimittelentdeckung zu beschleunigen, was dazu beiträgt, die Entwicklung besserer und sichererer Arzneimittel gegen eine größere Anzahl von Zielen zu erleichtern.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CrystalDirect harvester	Arinax		Automated crystal mounting and cryocooling
CrystalDirect Crystallization plate	Mitegen	SKU: M-XDIR-96-2	96-well crytsallization microplate
Formulator 16	Formulatrix		For the autoamted preparation of crystallization screens
Mosquito crystallization Robot	SPT Labtech		For the preparation of crystallization experiments
Tecan Evo Liquid handling station	Tecan		For the preparation of crystallization solutions
Spine Pucks	Mitegen	SKU: M-SP-SC3-1	SPINE-compatible cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers
UniPucks	Mitegen	SKU: M-CP-111-021	Universal cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers