JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים כיצד להשתמש בצינורות הקריסטלוגרפיה המקרומולקולרית האוטומטית לניתוח מורכב של חלבון למבנה, ניתוח מורכב מהיר של חלבון ליגנד והקרנת שברים בקנה מידה גדול המבוססת על טכנולוגיית CrystalDirect במעבדת HTX ב- EMBL Grenoble.

Abstract

EMBL Grenoble מפעילה את המעבדה להתגבשות בתפוקה גבוהה (מעבדת HTX), מתקן משתמשים בקנה מידה גדול המציע שירותי קריסטלוגרפיה בתפוקה גבוהה למשתמשים ברחבי העולם. למעבדת HTX יש דגש חזק בפיתוח שיטות חדשות בקריסטלוגרפיה מקרומולקולרית. באמצעות השילוב של פלטפורמת התגבשות תפוקה גבוהה, טכנולוגיית CrystalDirect להרכבה והקפאה אוטומטיות לחלוטין ותוכנת CRIMS פיתחנו צינורות אוטומטיים לחלוטין לקריסטלוגרפיה מאקרומולקולרית שניתן להפעיל מרחוק דרך האינטרנט. אלה כוללים צינור חלבון למבנה לקביעת מבנים חדשים, צינור לאפיון מהיר של מתחמי ליגנד חלבונים לתמיכה בכימיה רפואית, וצינור סינון שברים אוטומטי בקנה מידה גדול המאפשר הערכה של ספריות של מעל 1000 שברים. כאן אנו מתארים כיצד לגשת למשאבים אלה ולהשתמש בהם.

Introduction

אוטומציה הוצגה בכל השלבים של תהליך הניסוי של קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית, החל מהתגבשות וכלה באיסוף ועיבוד נתוני עקיפה1,2,3,4,5,6,7,8,9, כולל מספר טכנולוגיות להרכבה מדגם10,11,12 ,13,14,15,16,17. זה לא רק האיץ את הקצב שבו מבנים קריסטלוגרפיים מתקבלים, אלא תרם לייעל יישומים כמו עיצוב תרופה מונחית מבנה18,19,20,21,22,23,24. בכתב יד זה אנו מתארים כמה מההיבטים של צינורות הקריסטלוגרפיה האוטומטיים הזמינים במעבדת HTX בגרנובל, כמו גם בטכנולוגיות הבסיסיות.

מעבדת HTX ב- EMBL Grenoble היא אחד המתקנים האקדמיים הגדולים ביותר להקרנת התגבשות באירופה. הוא ממוקם במשותף בקמפוס האירופי פוטון וניוטרון (EPN) יחד עם מתקן הקרינה הסינכרוטרוני האירופי (ESRF), המייצר כמה מקורות הרנטגן המבריקות ביותר בעולם והמכון לאו לנגווין (ILL), המספק קרני נויטרונים בשטף גבוה. מאז תחילת הפעילות בשנת 2003 סיפקה מעבדת HTX שירותים ליותר מ-800 מדענים ומעבדת יותר מ-1,000 דגימות בשנה. למעבדת HTX יש מיקוד חזק בפיתוח שיטות חדשות בקריסטלוגרפיה מקרומולקולרית, כולל שיטות להערכת מדגם ובקרת איכות25,26 וטכנולוגיית CrystalDirect, המאפשרות הרכבה ועיבוד קריסטל אוטומטיים לחלוטין15,16,17. מעבדת HTX פיתחה גם את מערכת ניהול המידע הקריסטלוגרפית (CRIMS), מערכת מידע מעבדתית מבוססת אינטרנט המספקת תקשורת אוטומטית בין מתקני התגבשות ואיסוף נתונים סינכרוטרון, ומאפשרת זרימת מידע ללא הפרעה לאורך כל מחזור המדגם מחלבון טהור לנתוני עקיפה. באמצעות השילוב של היכולות של מתקן HTX, טכנולוגיית CrystalDirect ותוכנת CRIMS, פיתחנו צינורות אוטומטיים לחלוטין מחלבון למבנה המשלבים סינון התגבשות, אופטימיזציה של קריסטלים, עיבוד אוטומטי של קצירת קריסטלים ואיסוף נתוני קריוקולינג ורנטגן בסינכרוטרונים מרובים לזרימת עבודה אחת ורציפה שניתן להפעיל מרחוק באמצעות דפדפן אינטרנט. צינורות אלה ניתן ליישם כדי לתמוך בקביעה מהירה של מבנים חדשים, אפיון של מתחמי חלבון-ליגנד והקרנת תרכובת ורסיסים בקנה מידה גדול באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן.

מעבדת HTX מצוידת ברובוט התגבשות nonvolume (כולל מודול LCP המאפשר התגבשות של חלבונים מסיסים וממברנה), חוות קריסטל (ב 5 °C (5 °C ו 20 °C), שתי תחנות טיפול נוזלי רובוטי להכנת מסכי התגבשות, ושני קוצרי קריסטל CrystalDirect אוטומטיים עם יכולת לייצר ולאחסן עד 400 סיכות מדגם קפואות לכל מחזור פעולה. מדענים שולחים את הדגימות שלהם למתקן באמצעות שליח אקספרס, אשר מעובדים לאחר מכן על ידי טכנאים ייעודיים במעבדת HTX. מדענים יכולים לתכנן מרחוק סינון התגבשות וניסויי אופטימיזציה באמצעות ממשק אינטרנט המסופק על ידי מערכת CRIMS. באמצעות ממשק זה, הם יכולים לבחור מתוך מגוון רחב של פרמטרים ופרוטוקולים ניסיוניים הזמינים במתקן כדי להתאים לדרישות המדגם הספציפיות שלהם. תוצאות יחד עם כל הפרמטרים הניסיוניים נעשים זמינים למשתמשים בזמן אמת באמצעות CRIMS. כל הדגימות שהתקבלו נמענות בשיטה שפותחה במיוחד המאפשרת להעריך את סבירות ההתגבשות של המדגם25,26,27. בהתבסס על התוצאות של זה בדיקות המלצות ספציפיות נעשות למשתמשים לגבי טמפרטורת הדגירה האופטימלית וניסויי אופטימיזציה מדגם אפשריים. לאחר שנקבעו ניסויי התגבשות, המדען יכול להעריך את התוצאות על ידי התבוננות בתמונות התגבשות שנאספו בנקודות זמן שונות דרך האינטרנט. כאשר מזהים גבישים המתאימים לניסויי עקיפה של קרני רנטגן, מדענים יכולים להשתמש בממשק ייעודי כדי להקים תוכנית הרכבה גבישית שתבוצע לאחר מכן על ידי הרובוט CrystalDirect.

טכנולוגיית CrystalDirect מבוססת על שימוש במיקרו-לוח התגבשות אדים שונה וקרן לייזר להרכבה ודגימות קריסטל קריו-קרירות לתביעות עקיפה תומכת בסגירת פער האוטומציה הקיים בין התגבשות לאיסוף נתונים15,16,17. בקצרה, גבישים גדלים בלוח דיפוזיה אדים שונה, microplate CrystalDirect. ברגע שהקריסטלים מופיעים רובוט הקציר CrystalDirect מחיל באופן אוטומטי קרן לייזר כדי לחתוך קטע סרט המכיל את הגביש, לחבר אותו סיכת איסוף נתוני עקיפה סטנדרטית, וקורר אותה בזרם גז חנקן (ראה זנדר ואח '2016 ו- https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8 ). לטכנולוגיה זו יש מספר יתרונות נוספים על פני פרוטוקולי הרכבה ידניים או אוטומטיים למחצה של קריסטל. לדוגמה, הגודל והצורה של הגבישים אינם בעיה, מה שהופך אותו קל באותה מידה לקצור גבישים גדולים או microcrystals, לעתים קרובות ניתן להימנע משימוש של קריו-מגן, בשל האופן המיוחד שבו הטכנולוגיה פועלת (ראה התייחסות 17, זנדר ואח '), מה שהופך ניתוח עקיפה רנטגן הרבה יותר פשוט. קרן הלייזר יכולה לשמש גם ככלי כירורגי לבחירת החלקים הטובים ביותר של מדגם כאשר גבישים גדלים על אשכולות או להראות צמיחה אפיטקסית למשל. טכנולוגיית CrystalDirect יכולה לשמש גם לניסויי השריה אוטומטיים17. אספקת פתרונות עם מולקולות קטנות או כימיקלים אחרים לגבישים. ובכך הוא מאפשר לתמוך אוטומטית לחלוטין, בקנה מידה גדול תרכובת הקרנה קטע. לאחר גבישים נקצרים ומוקפאים על ידי הרובוט CrystalDirect, הם מועברים ל- SPINE או דיסקיות Unipuck התואמות לרוב קווי הקרן של הקריסטלוגרפיה המקרומולקולרית הסינכרונית ברחבי העולם. המערכת יכולה לקצור עד 400 פינים (הקיבולת של אחסון קריוגני דיואר) באופן אוטונומי לחלוטין. CRIMS מתקשר עם רובוט הקוצר במהלך התהליך ומספק מעקב אוטומטי אחר דגימות קריסטל (דיסקיות וסיכות). דיסקיות מסומנות הן בברקודים והן בתגי RFID כדי להקל על ניהול מדגם21,28.

CRIMS מספקת ממשק תוכנית יישומים (API) התומך בתקשורת אוטומטית עם מערכת ISPyB התומכת בניהול ועיבוד של איסוף נתונים ברנטגן בסינכרוטרון רבים באירופה ובעולם29. לאחר השלמת קצירת הגבישים האוטומטית, מדענים יכולים לבחור דגימות קריסטל (דיסקיות) וליצור משלוחי מדגם עבור קווי הקרן הקריסטלוגרפיים המקרומולקולריים ב- ESRF (גרנובל, צרפת)7,8,9 אופטרה III סינכרוטרון (המבורג, גרמניה)18,19. CRIMS מעבירים את הנתונים המתאימים לדגימות קו הקרן שנבחרו למערכת המידע של סינכרוטרון יחד עם פרמטרי איסוף נתונים שנבחרו מראש. ברגע שהדגימות מגיעות לקו הקרן הסינכרוטרוני שנבחר, איסוף נתוני רנטגן מתבצע באופן ידני, באמצעות פעולת קו קרן מרחוק או באופן אוטומטי לחלוטין (כלומר, בקו הקרן MASSIF-1 של ESRF8 המופעל על ידי קבוצת הביולוגיה המבנית המשותפת EMBL ESRF (JSBG)). לאחר איסוף נתונים CRIMS מאחזר מידע אוטומטי על תוצאות איסוף הנתונים יחד עם תוצאות עיבוד נתונים ראשוניות המבוצעות על ידי מערכות עיבוד הנתונים של סינכרוטרון ומציג אותו למדען באמצעות ממשק משתמש נוח.

מעבדת HTX מיישמת צינורות אוטומטיים אלה כדי לתמוך בשלושה יישומים שונים, קביעות מהירות של מבנים חדשים, אפיון מהיר של מתחמי ליגנד חלבונים והקרנת תרכובת ורסיסים בקנה מידה גדול. להלן אנו מתארים כיצד להשתמש ולהפעיל אותם.

Protocol

הערה: גישה ממומנת לצינורות אלה עבור מדענים ברחבי העולם נתמכת באמצעות סדרה של תוכניות מימון. ברגע כתיבת כתב יד זה בקשות לגישה מתקבלות באמצעות תוכנית דיסקברי iNEXT (https://inext-discovery.eu), רשת מתקנים אירופית להמרצת ביולוגיה מבנית תרגומית20 במימון תוכנית Horizon 2020 של הנציבות האירופית או INSTRUCT-Eric (https://instruct-eric.eu/). פנה אל המחבר המתאים עבור הדרכים והמסלולים הנוכחיים לקבלת גישה ממומנת בזמן מסוים. פרוטוקול זה מתאר את פעולת צינור החלבון-למבנה וכולל שלבים המשותפים לכל הצינורות שלנו בעוד פרטים עבור שני הצינורות האחרים נדונים בסעיף הבא. ההוראות כאן מתייחסות ל- CRIMS V4.0.

1. מעבדת התגבשות תפוקה גבוהה

  1. לפני שתתחיל, בקש רישום במעבדת HTX באמצעות מערכת CRIMS https://htxlab.embl.fr/#/. אישורי המשתמש מספקים גישה מרחוק לכל ממשקי העיצוב וההערכה הניסיוניים.
    1. היכנס ל- CRIMS באמצעות נווט אינטרנט (Firefox, Chrome ו- Safari נתמכים). שרת האינטרנט CRIMs מוצפן כדי למנוע מגורמי צד שלישי לגשת לנתונים בזמן שהוא נוסע דרך האינטרנט. פעם אחת ב CRIMS, סדרה של תפריטים משמאל להקרנה לעזור לנהל וליצור דוגמאות, לבקש ניסויים התגבשות, לנהל לדמיין לוחות, וכו '. סדרה של ערכות לימוד בווידאו זמינות ב- https://medias01-web.embl.de/Mediasite/Showcase/embl/Channel/a2168bcaa36b4564851663e5b69594014d.
      הערה: משתמשים השולחים דגימות באמצעות שליח צריכים לרשום את הדגימות ואת ניסויי ההתגבשות המבוקשים באמצעות CRIMS לפני שליחת המדגם כדי להבטיח שניתן יהיה לעבד אותם ללא דיחוי עם ההגעה. אנא שלחו את פרטי המשלוח htx@embl.fr.
  2. היכנס ל- CRIMS (https://htxlab.embl.fr) באמצעות דפדפן אינטרנט ולחץ על תפריט דוגמאות. פעולה זו תפתח ממשק עם כלי ניהול פרוייקטים ודוגמאות.
  3. לחץ על לחצן מדגם חדש וספק את המידע המבוקש. CRIMS מאפשר לארגן דוגמאות תחת פרויקטים, יעדים ומבנים שונים. הקצה את המדגם לדגימה קיימת או צור מדגם חדש בשלב זה.
  4. לאחר הזנת המידע המבוקש לחץ על שמור והגיש בקשה. בחר את פרוטוקול ההתגבשות, את מסכי ההתגבשות שישמשו, את טמפרטורת הדגירה ואת התאריך הרצוי לניסויים.
    1. השתמש בשדות ההערה כדי לספק אינדיקציות לגבי הדגימות החשובות למפעילי מעבדת HTX לדעת. ניתן גם לבחור מסכים מותאמים אישית (ראה להלן). לאחר הגשת בקשת ההתגבשות היא תאומת על ידי צוות המעבדה של HTX ואישור על תזמון הניסויים יישלח באמצעות דואר אלקטרוני. הקפד לבחור תאריכי ניסוי התואמים לזמנים הנדרשים למשלוח לדוגמה.
  5. ברגע שהדגימות יגיעו למפעילי המתקן במעבדת HTX יבצעו את הניסויים כמבוקש. לאחר הגדרת ניסויי התגבשות, האישור יישלח באמצעות דואר אלקטרוני ומגשי התגבשות יועברו לדימויים האוטומטיים. CRIMS מספקת גישה לכל הפרמטרים הניסיוניים ותעקוב באופן אוטומטי אחר הפעלות הדמיה חדשות. הודעות דואר אלקטרוני יישלחו באופן אוטומטי כאשר תמונות חדשות יהיו זמינות. ניסוי הערכת איכותמדגם המבוסס על תרמופלור המבוסס על פרוטוקול שפותח במתקן25,26 מתבצע עם כל דגימה בשלב זה ויהיה זמין באמצעות CRIMS.
  6. תמונות של ניסויי ההתגבשות יחד עם תוצאות הערכת איכות המדגם יהיו זמינות ב- CRIMS זמן קצר לאחר הגדרת מגשי ההתגבשות. לחץ על תפריט Thermofluor ולנווט אל המדגם כדי לראות את התוצאות של ניסוי הערכת איכות המדגם.
    1. לחץ על תפריט צלחות כדי לראות את התמונות מלוחות ההתגבשות. נווט אל המדגם ולחץ על הצג כדי לראות את הפעלת ההדמיה האחרונה או בסימן + (הרחב) כדי לבחור הפעלת הדמיה אחרת. סדרה של כלים מסייעת למצוא ולנווט בקלות בין הדגימות. לדוגמה, לחיצה בתיבת פרוייקט בחלק העליון של המסכים מסננת דוגמאות עבור פרוייקט זה ופונקציות חיפוש זמינות עבור רוב עמודות הטבלה.
  7. השתמש בממשק תצוגת הצלחת כדי לעזור להעריך ולהבקיע את התוצאות של ניסויי ההתגבשות. הוא מאפשר ניווט דרך בארות שונות של לוחות התגבשות, בחר סוגי תמונות (כלומר, Vis, UV), בחר רזולוציית תמונה או ציוני שיא, למשל. ממשק זה מספק גם את כל הפרמטרים הניסיוניים המשמשים לניסויי ההתגבשות כולל הרכב פתרונות ההתגבשות.
  8. לחץ על תפריט עידון כדי לעצב מסכי אופטימיזציה קריסטל המבוססים על תנאי פגיעה ראשוניים שזוהו באמצעות ההקרנה הראשונית. תפריט המשנה לכימיקלים ופתרונות מלאי מאפשר להירשם ולנהל את פתרונות מלאי התגבשות. תפריט המשנה מסכים מספק גישה לממשק לעיצוב מיטוב משלך או מסכים מותאמים אישית.
    1. בחר את סוג הלוח, פתרונות מלאי או תצורות הדרגתיות המתאימות ביותר לעיצוב הניסיוני. ניתן לבקש מ-CRIMS להפיק פלט של קובץ התואם ישירות לרובוט Formulator (Formulatrix) כדי להעביר באופן אוטומטי את המסכים לצלחת או להפיק פלט של מסמך הניתן להדפסה עם אמצעי האחסון לפעולה ידנית.
  9. יש לחזור על שלבים 1.2-1.8 כדי לבצע ניסויי אופטימיזציה של קריסטל.
  10. לאחר זיהוי גבישים המתאימים לניסויי עקיפה של קרני רנטגן, נווטו אל הצלחת הצג ממשק ובחר את התמונה המתאימה לירידה הנכונה בגיבש. ציונים מאוחסנים מראש יעזרו לך לעשות זאת בקלות.
    1. לחץ על קריסטל קציר כדי להקליט תוכנית קציר קריסטל אוטומטית עבור רובוט קוצר CrystalDirect או על קציר ידני עבור הרכבה קריסטל ידני מסורתי, אם באמצעות CRIMS במתקן שאינו מצויד CrystalDirect. שני הממשקים ינחו את המשתמש בתהליך קצירת הגבישים. CRIMS יתעד באופן אוטומטי ולאחסן את המיקום של גבישים שנקטפו לתוך עמוד השדרה או Unipucks21.
  11. בחר בתפריט מנהל הגבישים ב- CRIMS. לחץ על תפריט המשנה קריסטלים שנקטפו כדי לבדוק את הדגימות הקפואות. בעת שימוש בקציר CrystalDirect, מוצגות תמונות של תהליך הקציר, כולל תמונות של הסיכות עם הגבישים שנקטפו.
  12. בחר בתפריט משלוחים כדי להתחבר לסינכרון ESRF או פטרה III וליצור משלוחים לדוגמה עבור ניתוח עקיפה של קרני רנטגן. לחץ על לחצן צור משלוח ובחר את הסינכרוטרון בו ברצונך להשתמש ואת מספר התיק (סיסמת התיק בסינכרוטרון נחוצה כאן). סדרת הממשקים הבאה משמשת לבחירת המחשבים שייכללו במשלוח. המערכת מאפשרת לספק הערות לתמיכה באיסוף נתונים ולקבוע פרמטרים של איסוף נתונים עבור קווי קרן אוטומטיים כמו MASSIF-1.
  13. אם איסוף הנתונים מתבצע במעבדת ESRF או פטרה III HTX, המפעילים יעבירו את הדגימות לקו הקרן, איסוף נתונים בסינכרוטרונים אחרים ייעשה על חשבון המשתמש עצמו. ניתן לאסוף נתונים על ידי נסיעה לסנכרון, באמצעות פעולת קו קרן מרחוק או ב MASSIF-1. במקרה האחרון, תהליך איסוף הנתונים הוא אוטומטי לחלוטין. בסינכרוטרון, ממשקים ספציפיים ב- ISPyB29 מאפשרים למשתמשים לשחזר את המידע שנשלח על ידי CRIMS ולשייך אליו דיסקיות לדוגמה כך שתוצאות איסוף הנתונים יתקשו באופן אוטומטי. עבור הניסויים המתוארים כאן, איסוף נתונים בסינכרוטרונים בוצע בדרך כלל עם תוכנת MXcube31, בעוד עיבוד נתונים ועידון מבנה בוצע עם atuoPROC32, Staraninso33, BUSTER33, Pipedream32,33 ו Coot35.
  14. לאחר ביצוע ניסויים באיסוף נתונים CRIMS מאחזר מידע סיכום יחד עם תוצאות של עיבוד נתונים ראשוני בסינכרוטרון ממערכת ISPyB29. עבור לתפריט CRIMS קריסטל מנהל ולחץ על תפריט המשנה נתוני עקיפה קריסטל. כל המידע והמטא-נתונים לגבי איסוף נתוני עקיפה זמינים. ניתן גם להוריד נתונים מעובדים מן synchrotron, כמו גם תמונות עקיפה גלם. הצג אוספי נתונים מרובים או בחר ערכות נתונים ספציפיות. כלי ניהול לדוגמה מאפשרים לנווט ולבחור דוגמאות עבור מבנים ספציפיים של פרוייקטים.
    הערה: צינור זה מספק פעולה אוטומטית לחלוטין דרך האינטרנט מחלבון טהור לתוצאות עקיפה של קרני רנטגן וניתן להפעילו עם דוגמה אחת או מרובה בו זמנית. זה יכול להיות מיושם על הקשר שונה וסוגי פרויקטים בביולוגיה מבנית.

תוצאות

צינור הקריסטלוגרפיה האוטומטי שתואר לעיל יושם כדי לתמוך במספר רב של פרויקטים פנימיים וחיצוניים בהצלחה יוצאת דופן. כמה דגשים כוללים את הפרויקט של ג'ינוביץ'-קארוגו ושותפיו למעבדות מקס פרוץ (וינה) המתמקד בניתוח מבני ותפקודי של מפטידג דיפטידיל החיוני לצמיחה של פתוגן חיידקי. הרצף המהיר של הקרנת התגבשות, הערכת עקיפה, אופטימיזציה של קריסטל ומחזורי איסוף נתוני רנטגן (עד 8 איטרציות לפרויקט זה) אפשרו להשיג מודלים מבניים לשלושה מצבים קונפורמציה שונים של החלבון תוך שבועות ספורים, שסיפקו הבנה מכנית מרכזית על הפונקציה של סוג זה של חלבונים36 (ראו איור 1).

דוגמה נוספת היא ממאסיאס ושותפיו לעבודה מהמכון למחקר ביו-רפואי (IRB, ברצלונה) ששילבו כלים ביואינפורמטיים וגישות מבניות לזיהוי מוטיבים חדשים של DNA מחייב עבור גורמי התמלול SMAD3 ו- SMAD4 המעורבים בוויסות גורל התא. עבודה זו הפיקה 6 מבנים ברזולוציה גבוהה של SMAD3 ו -4 מורכבים עם מוטיבים כריכות DNA שונים37,38 חושף יכולת בלתי צפויה עד כה של גורמי שעתוק אלה לזהות ולאגד למגוון רחב של רצפי DNA, שהוא המפתח לפרשנות תפקידם בהקשרים ביולוגיים שונים. טכנולוגיות אלה יושמו גם כדי לתמוך במחקר קנייני בהקשר של פרויקטים של תכנון תרופות מקבוצות מחקר בחברות פארמה וביוטכנולוגיה. לדוגמה, הודות למהירות שתרמה צינורות אלה, ניתן להשיג ניתוח מבני של מתחמי יעד ליגנד מרובים בתוך ימים, וזה בעל ערך רב לתמיכה באופטימיזציה של כימיה רפואית סבבים רצופים בהקשר של פיתוח תרופות. לבסוף יישמנו גם תשתית זו להקרנת קטעים בקנה מידה גדול המבוססת עלקרני רנטגן 39.

figure-results-1624
איור 1: צינור קריסטלוגרפיה אוטומטי. הפעלה משולבת של מעבדת EMBL HTX כולל טכנולוגיית CrystalDirect ותוכנת CRIMS עם קו הקרן MASSIF-1 ב- ESRF ותקשורת אוטומטית בין תוכנת CRIMS ו- ISPyB מאפשרת לתמוך בצינור אוטומטי לחלוטין, נשלט מרחוק של חלבון למבנה המשלב סינון ואופטימיזציה של התגבשות, קצירת קריסטלים אוטומטית וקירור קריו ואיסוף ועיבוד נתונים אוטומטיים. המודלים המבניים תואמים לשלושה מצבים קונפורמציה שונים של פרוטאז מחיידק פתוגניים שזוהה בזמן שיא על ידי יישום צינור36. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

צינורות הקריסטלוגרפיה האוטומטיים המתוארים כאן זמינים לחוקרים ברחבי העולם באמצעות תוכניות מימון שונות. נכון לעכשיו, גישה ממומנת לניסויי התגבשות וטכנולוגיית CrystalDirect ניתן להשיג על ידי החלה על תוכנית גילוי iNEXT ו INSTRUCT-ERIC, בעוד גישה לקורות קרן קריסטלוגרפיה מאקרומולקולרית ב- ESRF נתמכת באמצעות תוכנית הגישה למשתמש ESRF. גישה זו ממזערת את העיכוב בין צמיחת הגביש למדידה, מאיצה את התקדמותם של פרויקטים מאתגרים מאוד הדורשים אופטימיזציה מבוססת עקיפה של תנאי ייצור וגיבוש חלבונים ומשחררת מדענים מפעולות מורכבות הקשורות להתגבשות, טיפול בגבישים ותפעול קו קרן, מה שהופך את הקריסטלוגרפיה לנגישת יותר לקבוצות שאינן מומחים. זה יכול לשמש גם לחקירה מהירה של תוספי התגבשות, סוכניphasing או עבור הקרנה מורכבת באמצעות ניסויים התגבשות משותפת. בעוד שרוב פרויקטי הקריסטלוגרפיה עשויים להפיק תועלת מגישה זו, דגימות מסוימות עשויות לדרוש פרוטוקולים מיוחדים שאינם מקובלים על אוטומציה או על הצינורות המוצגים כאן, למשל אלה הדורשים מערכות מיקרופלואידיות או התקני התגבשות מיוחדים מאוד או דגימות שהם מאוד שפתיים ולא יסבלו משלוח.

טכנולוגיית CrystalDirect מאפשרת גם השריית קריסטל אוטומטית17 לאפיון מתחמי מטרות מולקולות קטנות. בשביל זה, צמצם קטן נוצר עם הלייזר לפני תהליך הקציר וטיפה של פתרון המכיל את הכימיקלים הרצויים (כלומר, סוכניphasing או ליגנדים פוטנציאליים) מתווסף על גבי, כך שהוא נכנס במגע עם, ומתפזר לתוך פתרון התגבשות בסופו של דבר להגיע גבישי. פתרונות כימיים יכולים להיות מנוסחים במים, DMSO או ממיסים אורגניים אחרים. לאחר זמן דגירה מסוים ניתן לקצור ולנתח את הגבישים על ידי עקיפה כמתואר לעיל. גישה זו יושמה על אפיון מהיר של מתחמי חלבון ליגנד בהקשר של עיצוב תרופות מבוססות מבנה, כמו גם על הקרנת תרכובת ורסיסים בקנה מידה גדול. במקרה האחרון ניתן לנתח במהירות ספריות קטעים עם מאות עד למעלה מאלף שברים. ממשקי CRIMS ספציפיים שאינם מוצגים כאן מאפשרים תכנון ומעקב אוטומטי אחר ניסויי השריית קריסטל, תוך שילוב בין תוכנת CRIMS וחבילת התוכנה Pipedream, שפותחה על ידי Global Phasing Ltd (בריטניה) ומאפשר עיבוד נתונים אוטומטי, פיזות, זיהוי ליגנד ועידון מבנה על פני מאות ערכות נתונים במקביל, ייעול ניתוח נתונים ופרשנות32,33 . לדוגמה, צינור זה הוחל לאחרונה על זיהוי שברים המחייבים הן לאתר הפעיל והן למספר אתרים אלוסטריים של טריפנוסומה ברוסי פרנסיל פירופוספט סינתאז, אנזים מרכזי של הטפיל הגורם טריפנוזומיהזיס אפריקאי אנושי.

הצינורות המוצגים כאן יכולים לתרום להאצת קצב הגילוי בביולוגיה מבנית ולהפוך את הקריסטלוגרפיה המקרומולקולרית לנגישת יותר למספר גדול יותר של קבוצות מחקר. יתר על כן, על ידי הקלת תרכובת בקנה מידה גדול הקרנת שבר הם יכולים לתרום לטפח מחקר תרגום ולהאיץ את תהליך גילוי התרופה, תורם כדי להקל על פיתוח של תרופות טובות ובטוחות יותר נגד מספר גדול יותר של מטרות.

Disclosures

JAM הוא מחבר שותף של פטנט על מערכת CrystalDirect

Acknowledgements

אנו רוצים להודות לקבוצת הביולוגיה המבנית המשותפת EMBL-ESRF (JSBG) על התמיכה בשימוש ובתפעול של קווי הקרן המקרומולקולריים של ESRF. אנו מודים למת'יו בולר על התמיכה באיסוף נתונים בקו הקרן MASSIF-1 של ESRF ותומאס שניידר וצוות EMBL המבורג על תמיכה מצוינת עם איסוף נתונים ב- P14 של סינכרוטרון פטרהייל (DESY, המבורג, גרמניה). קוצר CrystalDirect פותח בשיתוף עם צוות המכשור ב- EMBL גרנובל. פרויקט זה נתמך במימון תוכנית הקהילה האירופיתH2020 במסגרת הפרויקטים iNEXT (Grant No 653706) ו- iNEXT דיסקברי (Grant No 871037) וכן מתוכנית Région Auvergne-Rhône-Alpes באמצעות תוכנית Booster.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CrystalDirect harvesterArinaxAutomated crystal mounting and cryocooling
CrystalDirect Crystallization plateMitegenSKU: M-XDIR-96-296-well crytsallization microplate
Formulator 16FormulatrixFor the autoamted preparation of crystallization screens
Mosquito crystallization RobotSPT LabtechFor the preparation of crystallization experiments
Tecan Evo Liquid handling stationTecanFor the preparation of crystallization solutions
Spine PucksMitegenSKU: M-SP-SC3-1SPINE-compatible cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers
UniPucksMitegenSKU: M-CP-111-021Universal cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers

References

  1. Abola, E., Kuhn, P., Earnest, T., Stevens, R. C. Automation of X-ray crystallography. Nature Structural Biology. 7, 973-977 (2000).
  2. Banci, L., et al. First steps towards effective methods in exploiting high-throughput technologies for the determination of human protein structures of high biomedical value. Acta crystallographica. Section D, Biological. 62 (10), 1208-1217 (2006).
  3. Edwards, A. Large-scale structural biology of the human proteome. Annual Review in Biochemistry. 78, 541-568 (2009).
  4. Rupp, B., et al. The TB structural genomics consortium crystallization facility: towards automation from protein to electron density. Acta crystallographica. Section D, Biological. 58 (10), 1514-1518 (2002).
  5. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  6. Cusack, S., et al. Small is beautiful: protein micro-crystallography. Nature Structural and Molecular Biology. 5, 634-637 (1998).
  7. McCarthy, A. A., et al. ID30B – a versatile beamline for macromolecular crystallography experiments at the ESRF. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 1249-1250 (2018).
  8. Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
  9. von Stetten, D., et al. ID30A-3 (MASSIF-3) – a beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam. Journal of Synchrotron Radiation. 27 (3), 844-851 (2020).
  10. Viola, R., et al. First experiences with semi-autonomous robotic harvesting of protein crystals. Journal of Structural and Functional Genomics. 12, 77-82 (2011).
  11. Khajepour, M. Y. H., et al. REACH: Robotic Equipment for Automated Crystal Harvesting using a six-axis robot arm and a micro-gripper. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69 (3), 381-387 (2013).
  12. Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. . Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69, 1297-1302 (2006).
  13. Collins, P. M. Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing. Acta crystallographica. D73, 246-255 (2017).
  14. Deller, M. C., Rupp, B. Approaches to automated protein crystal harvesting. Acta crystallographica. F70, 133-155 (2014).
  15. Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (10), 1393-1399 (2012).
  16. Márquez, J. A., Cipriani, F. CrystalDirectTM: A Novel Approach for Automated Crystal Harvesting Based on Photoablation of Thin Films. Structural Genomics. 1091, 197-203 (2014).
  17. Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
  18. Cianci, M., et al. P13, the EMBL macromolecular crystallography beamline at the low-emittance PETRA III ring for high- and low-energy phasing with variable beam focusing. Journal of Synchrotron Radiation. 24 (1), 323-332 (2017).
  19. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).
  20. iNEXT Consortium . iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology. FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).
  21. Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
  22. Whittle, P. J., Blundell, T. L. Protein Structure-Based drug design. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 349-375 (1994).
  23. Blundell, T. L., Jhoti, H., Abell, C. High-throughput crystallography for lead discovery in drug design. Nature Reviews Drug Discovery. 1, 45-54 (2002).
  24. Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein–ligand structure determination. Acta Crystallographica. D73, 267-278 (2017).
  25. Mariaule, V., Dupeux, F., Márquez, J. A. Estimation of Crystallization Likelihood Through a Fluorimetric Thermal Stability Assay. Structural Genomics. 1091, 189-195 (2014).
  26. Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).
  27. Dimasi, N., Dupeux, F., Marquez, J. A. Expression, crystallization and X-ray data collection from microcrystals of the extracellular domain of the human inhibitory receptor expressed on myeloid cells IREM-1. Acta Crystallographica. F63, 204-208 (2007).
  28. Hiraki, M., Matsugaki, N., Yamada, Y., Hikita, M., Yamanaka, M., Senda, T. . RFID tag system for sample tracking at structural biology beamlines. , 060074 (2019).
  29. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  30. Ericsson, U., et al. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  31. Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17, 700-707 (2010).
  32. Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).
  33. Smart, O. S., et al. Exploiting structure similarity in refinement: automated NCS and target-structure restraints in BUSTER. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (4), 368-380 (2012).
  34. Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
  35. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica. D66, 486-501 (2010).
  36. Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
  37. Martin-Malpartida, P., et al. Structural basis for genome wide recognition of 5-bp GC motifs by SMAD transcription factors. Nature Communications. 8 (1), 2070 (2017).
  38. Aragón, E., et al. Structural basis for distinct roles of SMAD2 and SMAD3 in FOXH1 pioneer-directed TGF-β signaling. Genes & Development. 33 (21-22), 1506-1524 (2019).
  39. Münzker, L., et al. Fragment‐Based Discovery of Non‐bisphosphonate Binders of Trypanosoma brucei Farnesyl Pyrophosphate Synthase. ChemBioChem. 21 (21), 3096-3111 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

172

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved