Transiente Transduktion der strobatierten Formen von Echinococcus granulosus

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine schnelle transiente Transduktionstechnik in verschiedenen Entwicklungsstadien von Echinococcus granulosus unter Verwendung von lentiviralen Vektoren der dritten Generation.

Zusammenfassung

Die zystische Echinokokkose oder Hydatiden-Krankheit ist eine der wichtigsten zoonotischen parasitären Erkrankungen, die durch Echinococcus granulosus , einen kleinen Bandwurm, der im Darm von Hunden untergebracht ist, verursacht wird. Es besteht ein dringender Bedarf an angewandter genetischer Forschung, um die Mechanismen der Pathogenese und der Krankheitsbekämpfung und -prävention zu verstehen. Das Fehlen eines effektiven Genbewertungssystems behindert jedoch die direkte Interpretation der funktionellen Genetik von Cestodparasiten, einschließlich der Echinococcus-Spezies . Die vorliegende Studie zeigt das Potenzial der transienten Transduktion des lentiviralen Gens in den Metazestoden und strobilierten Formen von E. granulosus. Protoscoleces (PSCs) wurden aus Hydatidenzysten isoliert und auf spezifische biphasische Kulturmedien übertragen, um sich zu strobilierten Würmern zu entwickeln. Die Würmer wurden mit geerntetem Lentivirus der dritten Generation transfiziert, zusammen mit HEK293T-Zellen als Transduktionsprozesskontrolle. Eine ausgeprägte Fluoreszenz wurde bei den strobierten Würmern über 24 h und 48 h nachgewiesen, was auf eine transiente lentivirale Transduktion in E. granulosus hinweist. Diese Arbeit präsentiert den ersten Versuch einer lentivirusbasierten transienten Transduktion in Bandwürmern und zeigt die vielversprechenden Ergebnisse mit möglichen Implikationen in experimentellen Studien zur Plattwurmbiologie.

Einleitung

Die zystische Echinokokkose (CE) ist eine der wichtigsten Helminthenerkrankungen, die durch Echinococcus granulosus, einen kleinen Bandwurm innerhalb der Familie ^{Taeniidae 1,2}, verursacht wird. Umfangreiche Studien zur Immundiagnostik und Impfstoffentwicklung für E. granulosus wurden durchgeführt. Unzureichende Kenntnisse über die molekularen Grundlagen der Parasitenbiologie stellen jedoch große Einschränkungen bei der Diagnose, Behandlung und Prävention der Hydatidenkrankheit^dar 3,4,5,6.

In den letzten Jahren wurden aufgrund der Entwicklung von Genomsequenzierungs- und transkriptomischen Methoden eine breite Palette von molekularen Studien an Plattwürmern von mehreren Forschungsgruppen^{durchgeführt 7,8,9}. In der Welt der Parasiten sind die Fortschritte in der Gentransfertechnologie bei parasitären Plattwürmern jedoch im Vergleich zu den hochreproduzierbaren transienten Transduktionsmethoden, die für einige Protozoen entwickelt wurden, immer noch begrenzt^10,11,12.

Der Einsatz viraler Abgabesysteme hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten zu einem wesentlichen Instrument für die Transgenabgabe und Gen-/Proteinuntersuchungen entwickelt¹³. Lentivirus infiziert sowohl sich teilende als auch nicht teilende Zellen, wodurch es möglich wird, postmitotische Zellen zu infizieren^14,15,16. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Verwendung eines Lentivirus-basierten Transduktionssystems in Säugetierzellen das Potenzial bietet, die meisten Einschränkungen früherer Knock-in/Knock-down-Techniken zu überwinden. Das Design und die Konstruktion von lentiviralen Expressionsvektoren mit geeigneten molekularen Markern, wie der GFP-Expression, wurden bereits^{beschrieben 16}. Daher untersuchen wir die lentivirale transiente Transduktion eines GFP-Reportergens in den Protoscoleces und strobilierten Würmern von E. granulosus.

Protokoll

Diese Studie wurde vom National Institute for Medical Research Development und dem Research Ethics Review Committee, Nr. 958680, genehmigt. Lentiviren werden als BSL-2-Organismen klassifiziert; Daher wurden alle Laborkulturverfahren in diesem Protokoll unter Verwendung steriler Laborpraktiken durchgeführt und unter einer laminaren Durchflusshaube gemäß den NIH-Richtlinien durchgeführt. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des Studienprotokolls für die verschiedenen E. granulosus-Stadien .

1. Sammeln von Hydatidenzysten

1. Sammeln Sie Leberhydatidenzysten von natürlich infizierten Schafen, die routinemäßig in einem Schlachthof geschlachtet werden.
2. Sterilisieren Sie die Zystenoberfläche vollständig mit steriler Gaze und 70% Alkohol, bevor Sie die Protoscoleces (PSCs) absaugen.
3. Saugen Sie 20-50 ml Hydatidenflüssigkeit in sterile 50 ml konische Röhrchen ab.
4. Nach dem Abtropfen die Zyste mit einer scharfen Klinge auslöschen, die Keimschicht in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen überführen und für kurze Zeit (~ 2 min) schütteln, um die Sammlung von PSCs zu erhöhen. Übertragen Sie die Keimschicht zur molekularen Charakterisierung auf ein neues 1,5-ml-Röhrchen.
5. Waschen Sie die PSCs 3-5x mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
6. Beobachten Sie die PSCs in 0,1% Eosin für 5 Minuten, um die PSC-Lebensfähigkeit unter einem Lichtmikroskop zu bestimmen. Verwenden Sie PSCs mit einer Lebensfähigkeit von mindestens 95% für die Kultur.
7. Behandeln Sie den PSC-Niederschlag mit 2 ml Pepsin (2 mg / ml, pH 2) für 15-20 min.
8. Um einzelne PSCs zu isolieren, suspendieren Sie das PSC-Sediment in PBS und leiten Sie es durch zwei Schichten steriler Gaze in ein neues steriles 50 ml konisches Röhrchen.
   HINWEIS: Berechnen Sie den Durchschnitt von drei Zählungen auf 50 μL PSC-Sedimenten mit einem Lichtmikroskop. Verwenden Sie für nachfolgende Versuche den geschätzten Wert, um die PSCs/μL zu bestimmen. Jedes Hydatidenzystenisolat sollte auf der Grundlage von Nukleotidpolymorphismen durch molekulare Methoden wie PCR-Sequenzierung¹⁷ oder hochauflösende Schmelzkurvenanalyse¹⁸ charakterisiert werden.

2. Biphasische Kultivierung von PSCs von E. granulosus , um erwachsene Würmer zu erhalten

HINWEIS: Isolierte PSCs sollten unter sterilen Bedingungen unter einem Laminar-Flow-Schrank der Klasse II kultiviert werden. Bereiten Sie die festen und flüssigen Phasen des biphasischen Kulturmediums separat vor, bevor Sie mit den nächsten Schritten¹⁹ fortfahren.

1. Bereiten Sie das biphasische Kulturmedium so vor, dass es aus zwei Phasen besteht.
   1. Für die feste Phase 10 ml Rinderserum in einen 25 ml Kolben geben und bei 76 °C für 20-30 min koagulieren lassen.
   2. Für die flüssige Phase (modifizierte CMRL) mischen Sie 100 ml hitzeinaktiviertes fetales Kälberserum (FCS), 36 ml 5% Hefeextrakt, 5,6 ml 30% Glucose (in destilliertem Wasser), 1,4 ml 5% Hundegalle in PBS, 20 mM HEPES-Puffer und 10 mM_{NaHCO 3} in 260 ml CMRL-1066-Medium. Schließlich Penicillin (100 IE / ml) und Streptomycin (100 mg / ml) zu der Mischung hinzufügen.
2. 10 ml des flüssigen Phasenmediums in jeden 25 cm² Kulturkolben geben.
3. Geben Sie ~ 5.000 PSCs in den Kulturkolben und geben Sie den Kolben in den CO 2 -Inkubator (37 °C, 5% CO₂).
4. Nach 24-48 h werden die PSCs in einen neuen Kolben mit der festen Phase (Rinderserum) überführt und 1 ml des gleichen frischen flüssigen Phasenmediums pro Kolben zugegeben. Überführung der Kolben in den CO 2 Inkubator (37 °C, 5 % CO₂).
5. Ersetzen Sie das Medium alle 5-7 Tage durch frisches flüssiges Phasenmedium, basierend auf Änderungen der Farbe des Kulturmediums und dem geschätzten Anteil differenzierter PSCs.
   HINWEIS: Protoscoleces reagieren schnell auf Umweltveränderungen nach der Kultivierung, und die meisten von ihnen werden innerhalb von 2-3 Wochen differenziert. Aufgrund des Verbrauchs von Nährstoffen und des Wachstums und der Entwicklung von Protoscoleces ändert sich der pH-Wert des Kulturmediums und seine Farbe verschiebt sich in Richtung Orange und Gelb.

3. Monophasische Kultivierung von PSCs von E. granulosus

1. Stellen Sie sicher, dass die monophasische Kultivierung 24-48 h vor der Transduktion durchgeführt wird.
   1. Kultur ~ 5.000 PSCs in einem 25 cm² Kulturkolben mit RPMI und 10% fetalem Rinderserum (FBS).
   2. Die Kolben bis zur Verwendung in den CO 2 Inkubator (37 °C, 5 % CO₂) geben.

4. Zellkultur zur Virusproduktion und -aufbereitung

HINWEIS: Menschliche embryonale Nierenzellen 293T (HEK293T) wurden für die Vektorproduktion vom Pathology and Stem Cell Research Center der Kerman University of Medical Sciences gewonnen.

1. Übertragen Sie 5 × 10 5 HEK293T-Zellen in einen 25 cm^2-Kolben, der⁵ ml DMEM mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthält.
2. Die HEK293T-Zellen bei 37 °C in 5% CO₂ inkubieren und alle 48 h im kompletten Kulturmedium passieren. Verwenden Sie schließlich HEK293T-Zellen mit niedriger Passage für die Transduktion²⁰.

5. Produktion und Präparation des Virus mit den lentiviralen Vektoren der dritten Generation

HINWEIS: Der Lentivirus-Vektor pCDH513b (Transfervektor) und PLPII, PLPI und PMD2G (Hilfsvektoren) wurden verwendet, um das GFP-Reporter-Gen zu exprimieren. Siehe Materialtabelle und ergänzende Abbildung S1.

1. Tag 1:
   1. Nach der Trypsinisierung der HEK293T-Zellen²¹ in 6-Well-Kulturplatten werden 7 × 10⁴ Zellen pro Well mit frischem, antibiotikafreiem DMEM mit 10% FBS ausgesät.
   2. Verwenden Sie Zellen mit 50% -60% Konfluenz für die Transduktion durch die Calciumphosphatmethode.
2. Tag 2:
   1. Ersetzen Sie das Zellkulturmedium 2-3 h vor dem Experiment durch frisches, antibiotikafreies DMEM mit 2% FBS.
   2. Mischen Sie in einer 1,5-ml-Röhre die lentiviralen Plasmide der dritten Generation, einschließlich 7 μg/μL pCDH513b (Transfervektor), 4 μg/μL PLPII, 4 μg/μL PLPI und 2 μg/μL PMD2G (Hilfsvektoren).
   3. HEPES-Puffer (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES und 1,5 mM Na₂HPO₄; optimaler pH-Bereich, 7,00-7,28) zu der Mischung auf ein Volumen von 422 μL.
   4. 16 μL 1% Tris-EDTA (TE)-Puffer in die Mischung geben.
   5. 62 μL 2,5 mM Calciumchlorid in die Röhrchen geben und gut mischen.
   6. Geben Sie 500 μL 2x HEPES-gepufferte Kochsalzlösung (HBS) zu der Mischung, tropfenweise, innerhalb von 1-2 min mit einer Pasteur-Pipette. Mischen Sie vorsichtig, bis eine halbundurchsichtige Lösung erhalten wird, und inkubieren Sie die Mischung für 20 Minuten bei Raumtemperatur.
   7. Fügen Sie die Mischung langsam zu jeder Platte hinzu und verteilen Sie sie mit langsamen kreisenden Bewegungen.
   8. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C in einem 5% CO₂ Inkubator und ersetzen Sie das Medium nach 4-6 h durch antibiotikafreies DMEM mit 10% FBS.
3. Tag 3:
   1. Bestätigen Sie die erfolgreiche transiente Transduktion und Zelllebensfähigkeit mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop.
4. Tag 4:
   1. Ernten Sie Viren aus dem Kulturmedium, indem Sie den Überstand jedes Brunnens sammeln und bis zur Verwendung bei -70 ° C lagern.
      HINWEIS: Geerntete Lentiviren könnten für eine präzise Transfektion konzentriert und titriert werden²².

6. Transiente Transduktion verschiedener Stadien von E. granulosus mit dem Virus

1. Tag 1:
   1. Verwenden Sie eine 12-Well-Kulturplatte für den Gentransfer. Kultur 5 × 10^3-5 × 10 4 HEK293T Zellen in dreifacher Ausfertigung, mit vollständigem DMEM-Medium als^interner Referenz.
   2. Kultur 150 frische PSCs in dreifacher Ausfertigung in RPMI und 10% FBS.
   3. Kultur 30 strobilierte Würmer in dreifacher Ausfertigung in DMEM mit 10% hitzeinaktiviertem FBS.
      HINWEIS: Alle Transduktionsmedien müssen antibiotikafrei sein. Bewahren Sie dabei drei unbehandelte Kontrollquellen für HEK293T-Zellen, PSCs und stroboskopierte Würmer auf.
   4. Bereiten Sie eine Mischung aus 1 × 10⁶ Viren mit 4 μg/ml Transfektionsreagenz (siehe Materialtabelle) vor, um die HEK293T-Zellen und verschiedene Stadien des Wurms zu transduzieren.
   5. Fügen Sie die Mischung langsam zu jeder Platte hinzu und verteilen Sie sie mit langsamen kreisenden Bewegungen. Inkubieren Sie die Platten für 4-6 h in einem CO 2 Inkubator (37 °C, 5% CO₂). Ersetzen Sie das Medium für jede Probe durch das gleiche vollständige Kulturmedium, um die toxischen Wirkungen des Transfektionsreagenzes zu minimieren.
2. Tag 2:
   1. Wiederholen Sie die Schritte 6.1.4-6.1.5, um die Effizienz der transienten Transduktion für die HEK293T-Zellen, PSCs und stroboskopierten Würmer zu erhöhen.
   2. Inkubieren Sie alle Platten für 24-48 h in einem CO₂ -Inkubator mit den gleichen Kulturbedingungen basierend auf der Art des Zellmediums.
3. Tag 3:
   1. Überprüfen Sie, ob die Transduktion erfolgreich ist, indem Sie die Fluoreszenzmikroskopie verwenden.
      HINWEIS: Erwägen Sie die Verwendung weiterer Bestätigungsassays wie PCR/qPCR ^20,23 oder Western Blotting ^24-Techniken im Gentransferverfahren^.

Ergebnisse

Hier beschreiben wir eine schnelle und effiziente transiente Transduktionstechnik in E. granulosus unter Verwendung von lentiviralen Vektoren der dritten Generation. Wir kultivierten PSCs in einem biphasischen Kulturmedium, um strobazierte Würmer zu erhalten, wie zuvor beschrieben^25,26. Protoscoleces entwickeln sich nach 6 Wochen in vitro zu strobilierten Würmern. Im biphasischen Kulturmedium wurden verschiedene Stadien von E. granulosus

Diskussion

Das Verständnis der molekularen Grundlagen von Nematoden und Platyhelminthesbiologie ist entscheidend für das Verständnis der Pathogenität zoonotischer Parasiten²⁷. Das Fehlen eines effektiven Genbewertungssystems ist ein großes Hindernis für die direkte Interpretation der funktionellen Genetik von Cestodparasiten, einschließlich Echinococcus-Spezies ^12,27. Die vorliegende Studie zeigt das ausgezeichnete Potenzial von Lenti...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well culture plates	SPL Life Sciences	30012
25 cm2 culture flask	SPL Life Sciences	70325
6-well culture plates	SPL Life Sciences	30006
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C4901-500G	Working concentration: 2.5 mM
CMRL 1066 medium	Thermo Fisher Scientific	11530037
CO2 incubator	memmert	ICO150
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
DMEM	Life Technology	12100046
Dog bile			Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter
Eosin Y	Sigma-Aldrich	E4009-5G	prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test
Fetal Bovine Serum (FBS)	DNAbiotech	DB9723-100ml	Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C)
Fetal Calf Serum (FCS)	DNAbiotech	DB9724-100ml	Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C)
HEK293T cells	BONbiotech	BN_0012.1.14	Human embryonic kidney 293T
HEPES buffered saline (HBS)	Sigma-Aldrich	51558-50ML	2x concentrate
Inverted fluorescence microscope	OLYMPUS	IX51
Penicillin	Sigma-Aldrich	P3032-10MU	Working concentration: 100 IU/mL
Pepsin	Roche	10108057001	Working concentration: 2 mg/mL, pH 2
Phosphate-buffered saline (PBS)	DNAbiotech	DB0011	This reagent solve in less than 1 min in D.W
Polybrene (Transfection reagent)	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
RPMI medium	BioIdea	BI-1006-05
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761-1KG
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S9137-25G	Working concentration: 100 μg/mL
Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b)	SBI System Biosciences (BioCat GmbH)	CD513B-1-SBI	Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran)
Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII)	Invitrogen (Life Technologies)	K4975-00	Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran)
Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G)	Addgene	Plasmid 12259	Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran)
Tris/EDTA Buffer (TE)	DNAbiotech	DB9713-100ml
Trypsin	Sigma-Aldrich	T9935-50MG	1x working solutions (pH 7.4–7.6)