Транзиторная трансдукция стробилированных форм Echinococcus granulosus

Резюме

Описана методика быстрой транзиторной трансдукции на разных стадиях развития Echinococcus granulosus с использованием лентивирусных векторов третьего поколения.

Аннотация

Кистозный эхинококкоз или эхинококковое заболевание является одним из наиболее важных зоонозных паразитарных заболеваний, вызванных Echinococcus granulosus, небольшим ленточным червем, укрывающимся в кишечнике собак. Существует острая необходимость в прикладных генетических исследованиях для понимания механизмов патогенеза и контроля и профилактики заболеваний. Однако отсутствие эффективной системы оценки генов препятствует прямой интерпретации функциональной генетики цестодных паразитов, включая виды Echinococcus . Настоящее исследование демонстрирует потенциал лентивирусной преходящей трансдукции гена в метацестодах и стробилированных формах E. granulosus. Протосколеки (PSC) были выделены из эхинококковых цист и перенесены в специфические двухфазные питательные среды для развития в стробилированных червей. Черви были трансфектированы собранным лентивирусом третьего поколения вместе с клетками HEK293T в качестве контроля процесса трансдукции. Выраженная флуоресценция была обнаружена у стробилированных червей в течение 24 ч и 48 ч, что указывает на преходящую лентивирусную трансдукцию у E. granulosus. Эта работа представляет собой первую попытку переходной трансдукции на основе лентивируса у ленточных червей и демонстрирует многообещающие результаты с потенциальными последствиями в экспериментальных исследованиях биологии плоских червей.

Введение

Кистозный эхинококкоз (CE) является одним из наиболее важных заболеваний гельминтов, вызванных Echinococcus granulosus, небольшим ленточным червем в семействе Taeniidae ^1,2. Проведены обширные исследования по иммунодиагностике и разработке вакцины для E. granulosus. Однако недостаточные знания о молекулярных основах биологии паразитов создают серьезные ограничения в диагностике, лечении и профилактике эхинококковой болезни 3,4,5,6.

В последние годы, благодаря развитию секвенирования генома и транскриптомных методов, был проведен широкий спектр молекулярных исследований плоских червей несколькими исследовательскими группами ^7,8,9. Однако в мире паразитов достижения в технологии переноса генов у паразитических плоских червей все еще ограничены по сравнению с высоковоспроизводимыми методами транзиторной трансдукции, разработанными для некоторых простейших 10,11,12.

Использование систем доставки вирусов стало важным инструментом для доставки трансгенов и исследований генов / белков за последние два десятилетия¹³. Лентивирус заражает как делящиеся, так и неделящиеся клетки, что позволяет инфицировать постмитотические клетки 14,15,16. Последние данные свидетельствуют о том, что использование системы трансдукции на основе лентивируса в клетках млекопитающих дает возможность преодолеть большинство ограничений предыдущих методов нокдауна/ нокдауна. Проектирование и построение лентивирусных векторов экспрессии с соответствующими молекулярными маркерами, такими как экспрессия GFP, были описаны ранее¹⁶. Поэтому мы оцениваем лентивирусную транзиторную трансдукцию гена-репортера GFP у протосколек и стробилированных червей E. granulosus.

протокол

Это исследование было одобрено Национальным институтом развития медицинских исследований и Комитетом по обзору этики исследований, No 958680. Лентивирусы классифицируются как организмы BSL-2; следовательно, все процедуры лабораторного культивирования в этом протоколе проводились с использованием стерильной лабораторной практики и проводились под ламинарной проточной вытяжкой в соответствии с руководящими принципами NIH. На рисунке 1 показано схематическое представление протокола исследования для различных стадий E. granulosus .

1. Сбор эхинококковых кист

1. Соберите кисты эхинококка печени у естественно инфицированных овец, которых обычно забивают на скотобойне.
2. Полностью стерилизуют поверхность кисты с использованием стерильной марли и 70% спирта перед аспирацией протосколек (PSC).
3. Аспират 20-50 мл эхинококковой жидкости выходит в стерильные конические трубки по 50 мл.
4. После дренирования смойте кисту острым лезвием, переместите зародышевый слой в стерильную коническую трубку объемом 50 мл и встряхните ее в течение короткого периода (~ 2 мин), чтобы увеличить сбор PSC. Переместите зародышевый слой в новую трубку объемом 1,5 мл для молекулярной характеристики.
5. Промыть ЦОНы 3-5x фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS).
6. Наблюдайте за PSC в 0,1% эозина в течение 5 мин, чтобы определить жизнеспособность PSC под световым микроскопом. Используйте PSC с не менее чем 95% жизнеспособностью для культуры.
7. Обработать осадок ПСК 2 мл пепсина (2 мг/мл, рН 2) в течение 15-20 мин.
8. Чтобы изолировать отдельные PSC, повторно суспендируйте осадок PSC в PBS и пропустите его через два слоя стерильной марли в новую стерильную коническую трубку объемом 50 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитайте среднее значение трех отсчетов на 50 мкл отложений PSC с помощью светового микроскопа. Для последующих испытаний используйте оценочное значение для определения PSC/μL. Каждый изолят эхинококковой кисты должен быть охарактеризован на основе нуклеотидных полиморфизмов молекулярными методами, такими как ПЦР-секвенирование¹⁷ или анализ кривой плавления с высоким разрешением¹⁸.

2. Двухфазное культивирование ЦОНов E. granulosus для получения взрослых червей

ПРИМЕЧАНИЕ: Изолированные ЦОНы следует культивировать в стерильных условиях в ламинарной проточной камере класса II. Подготовьте твердую и жидкую фазы двухфазной питательной среды отдельно, прежде чем переходить к следующим шагам¹⁹.

1. Подготовьте двухфазную культуральную среду, состоящую из двух фаз.
   1. Для твердой фазы добавьте 10 мл бычьей сыворотки в колбу объемом 25 мл и оставьте ее свертываться при 76 °C в течение 20-30 мин.
   2. Для жидкой фазы (модифицированной CMRL) смешайте 100 мл термоинактивированной фетальной сыворотки для телят (FCS), 36 мл 5% дрожжевого экстракта, 5,6 мл 30% глюкозы (в дистиллированной воде), 1,4 мл 5% собачьей желчи в PBS, 20 мМ буфера HEPES и 10 мМ NaHCO₃ в 260 мл среды CMRL-1066. Наконец, добавьте в смесь пенициллин (100 МЕ/мл) и стрептомицин (100 мг/мл).
2. Добавьте 10 мл жидкофазной среды в каждую колбу для культивирования^{25 см2} .
3. Добавьте ~5000 PSC в колбу для культивирования и перенесите колбу в инкубатор CO₂ (37 °C, 5% CO₂).
4. Через 24-48 ч переложить ЦОНы в новую колбу с твердой фазой (бычьей сывороткой) и добавить 1 мл той же свежей жидкофазной среды на колбу. Перенесите колбы в инкубатор_CO2 (37 °C, 5% CO₂).
5. Каждые 5-7 дней заменяют среду свежей жидкофазной средой на основе изменения цвета питательной среды и расчетной доли дифференцированных ЦОНов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протосколеки быстро реагируют на изменения окружающей среды после культивирования, и большинство из них подвергаются дифференциации в течение 2-3 недель. Из-за потребления питательных веществ и роста и развития протосколек изменяется рН питательной среды, а ее цвет смещается в сторону оранжевого и желтого.

3. Монофазное выращивание ЦОНов E. granulosus

1. Убедитесь, что монофазное культивирование проводится за 24-48 ч до трансдукции.
   1. Культивируйте ~5000 PSC в колбе для культивирования^{25 см2} с RPMI и 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS).
   2. Переместите колбы в инкубатор CO₂ (37 °C, 5% CO₂) до использования.

4. Клеточная культура для производства и подготовки вируса

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки эмбриональной почки человека 293T (HEK293T) были получены для векторного производства из Исследовательского центра патологии и стволовых клеток Университета медицинских наук Кермана.

1. Перенесите 5 × 10⁵ клеток HEK293T в колбу размером^{25 см2} , содержащую 5 мл DMEM с 10% FBS, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
2. Инкубируют клетки HEK293T при 37 °C в 5% CO₂ и пропускают их в полной питательной среде каждые 48 ч. Наконец, используйте низкопроходные клетки HEK293T для трансдукции²⁰.

5. Производство и подготовка вируса с лентивирусными векторами третьего поколения

ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспрессии гена-репортера GFP использовались лентивирусный вектор pCDH513b (переносной вектор) и PLPII, PLPI и PMD2G (вспомогательные векторы). См. таблицу материалов и дополнительный рисунок S1.

1. День 1:
   1. После трипсинизации клеток HEK293T²¹ в 6-луночных культуральных пластинах, семена 7 × 10⁴ клеток на лунку со свежим DMEM без антибиотиков, содержащим 10% FBS.
   2. Используют клетки при 50%-60% слиянии для трансдукции методом фосфата кальция.
2. День 2:
   1. Замените среду культивирования клеток за 2-3 ч до начала эксперимента свежим безантибиотиков DMEM, содержащим 2% FBS.
   2. В пробирке объемом 1,5 мл смешайте лентивирусные плазмиды третьего поколения, включая 7 мкг/мкл pCDH513b (вектор переноса), 4 мкг/мкл PLPII, 4 мкг/мкл PLPI и 2 мкг/мкл PMD2G (вспомогательные векторы).
   3. Добавьте буфер HEPES (0,28 М NaCl, 0,05 М HEPES и 1,5 мМ Na₂HPO₄; оптимальный диапазон рН, 7,00-7,28) в смесь до объема 422 мкл.
   4. Добавьте в смесь 16 мкл 1% буфера Tris-EDTA (TE).
   5. Добавьте в пробирки 62 мкл хлорида кальция 2,5 мМ и хорошо перемешайте.
   6. Добавьте 500 мкл 2x HEPES-буферного физиологического раствора (HBS) в смесь, капля за каплей, в течение 1-2 минут с помощью пипетки Пастера. Осторожно перемешать до получения полунепрозрачного раствора и инкубировать смесь в течение 20 мин при комнатной температуре.
   7. Медленно добавляйте смесь в каждую тарелку и распределяйте ее медленными круговыми движениями.
   8. Инкубируют пластины при 37 °C в 5% CO₂ инкубаторе и заменяют среду через 4-6 ч dmEM без антибиотиков, содержащим 10% FBS.
3. День 3:
   1. Подтвердите успешную транзиторную трансдукцию и жизнеспособность клеток с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа.
4. День 4:
   1. Собирайте вирусы из питательной среды, собирая супернатант каждой скважины и храните их при -70 °C до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Собранные лентивирусы могут быть сконцентрированы и титрованы для точной трансфекции²².

6. Транзиторная трансдукция различных стадий E. granulosus вирусом

1. День 1:
   1. Используйте 12-луночную культуральную пластину для переноса генов. Культура 5 × 10^3-5 × 10⁴ HEK293T клеток в трех экземплярах, с полной средой DMEM в качестве внутреннего эталона.
   2. Культивируйте 150 свежих ЦОНов в трех экземплярах в RPMI и 10% FBS.
   3. Культивирование 30 стробилированных червей в трипликате в DMEM, содержащих 10% термоинактивированных FBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все трансдукционные среды должны быть свободны от антибиотиков. Держите в процессе три необработанных контрольных колодца для клеток HEK293T, PSC и стробилированных червей.
   4. Готовят смесь из 1 × 10⁶ вирусов с трансфекционным реагентом 4 мкг/мл (см. Таблицу материалов) для трансдукции клеток HEK293T и различных стадий червя.
   5. Медленно добавляйте смесь в каждую тарелку и распределяйте ее медленными круговыми движениями. Инкубировать пластины в течение 4-6 ч в инкубаторе_СО2 (37 °C, 5% CO₂). Замените среду для каждого образца одной и той же полной питательной средой, чтобы свести к минимуму токсическое воздействие трансфекционного реагента.
2. День 2:
   1. Повторите шаги 6.1.4-6.1.5 для повышения эффективности переходной трансдукции для клеток HEK293T, PSC и стробилированных червей.
   2. Инкубируют все пластины в течение 24-48 ч в инкубаторе_CO2 с одинаковыми условиями культивирования в зависимости от типа клеточной среды.
3. День 3:
   1. Проверьте, успешна ли трансдукция, используя флуоресцентную микроскопию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрите возможность использования дальнейших подтверждающих анализов, таких как ПЦР / qPCR^20,23 или методы западного блоттинга²⁴ в процедуре переноса генов.

Результаты

Здесь мы описываем быстрый и эффективный метод транзиторной трансдукции у E. granulosus с использованием лентивирусных векторов третьего поколения. Мы культивировали PSC в двухфазной питательной среде для получения стробилированных червей, как описано ранее^25,26

Обсуждение

Понимание молекулярной основы биологии нематод и Platyhelminthes имеет решающее значение для понимания патогенности зоонозных паразитов²⁷. Отсутствие эффективной системы оценки генов является основным препятствием для прямой интерпретации функциональной генетики паразитов ц?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well culture plates	SPL Life Sciences	30012
25 cm2 culture flask	SPL Life Sciences	70325
6-well culture plates	SPL Life Sciences	30006
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C4901-500G	Working concentration: 2.5 mM
CMRL 1066 medium	Thermo Fisher Scientific	11530037
CO2 incubator	memmert	ICO150
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
DMEM	Life Technology	12100046
Dog bile			Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter
Eosin Y	Sigma-Aldrich	E4009-5G	prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test
Fetal Bovine Serum (FBS)	DNAbiotech	DB9723-100ml	Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C)
Fetal Calf Serum (FCS)	DNAbiotech	DB9724-100ml	Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C)
HEK293T cells	BONbiotech	BN_0012.1.14	Human embryonic kidney 293T
HEPES buffered saline (HBS)	Sigma-Aldrich	51558-50ML	2x concentrate
Inverted fluorescence microscope	OLYMPUS	IX51
Penicillin	Sigma-Aldrich	P3032-10MU	Working concentration: 100 IU/mL
Pepsin	Roche	10108057001	Working concentration: 2 mg/mL, pH 2
Phosphate-buffered saline (PBS)	DNAbiotech	DB0011	This reagent solve in less than 1 min in D.W
Polybrene (Transfection reagent)	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
RPMI medium	BioIdea	BI-1006-05
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761-1KG
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S9137-25G	Working concentration: 100 μg/mL
Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b)	SBI System Biosciences (BioCat GmbH)	CD513B-1-SBI	Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran)
Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII)	Invitrogen (Life Technologies)	K4975-00	Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran)
Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G)	Addgene	Plasmid 12259	Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran)
Tris/EDTA Buffer (TE)	DNAbiotech	DB9713-100ml
Trypsin	Sigma-Aldrich	T9935-50MG	1x working solutions (pH 7.4–7.6)