Eine Pilotstudie zur repetitiven transkraniellen Magnetstimulation von Aβ- und Tau-Spiegeln in der Rhesusaffen-Zerebrospinalflüssigkeit

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir das Verfahren für eine Pilotstudie zur Untersuchung der Wirkung der repetitiven transkraniellen Magnetstimulation mit unterschiedlichen Frequenzen (1 Hz/20 Hz/40 Hz) auf den Aβ- und Tau-Metabolismus in der Rhesusaffen-Zerebrospinalflüssigkeit.

Zusammenfassung

Frühere Studien haben gezeigt, dass ein nicht-invasives Lichtflimmerregime und eine Stimulation des tonenden Tonus den Aβ- und Tau-Stoffwechsel im Gehirn beeinflussen können. Als nicht-invasive Technik wurde die repetitive transkranielle Magnetstimulation (rTMS) zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen eingesetzt. Diese Studie untersuchte die Auswirkungen von rTMS auf die Aβ- und Tau-Spiegel in der Rhesusaffen-Zerebrospinalflüssigkeit (CSF). Dies ist eine einzelblinde, selbstkontrollierte Studie. Drei verschiedene Frequenzen (niederfrequent, 1 Hz; hohe Frequenzen, 20 Hz und 40 Hz) von rTMS wurden verwendet, um den bilateral-dorsolateralen präfrontalen Kortex (DLPFC) des Rhesusaffen zu stimulieren. Eine Katheterisierungsmethode wurde verwendet, um CSF zu sammeln. Alle Proben wurden einer Flüssigchip-Detektion unterzogen, um CSF-Biomarker (_Aβ42, _Aβ42/_Aβ40, tTau, pTau) zu analysieren. Die CSF-Biomarkerspiegel änderten sich mit der Zeit nach der Stimulation durch rTMS. Nach der Stimulation zeigte der _{Aβ42-Spiegel} im Liquor bei allen Frequenzen (1 Hz, 20 Hz und 40 Hz) einen Aufwärtstrend, mit signifikanteren Unterschieden bei den hohen Frequenzen (p < 0,05) als bei der niedrigen Frequenz.

Nach hochfrequentem rTMS stieg der Gesamt-Tau-Spiegel (tTau) des Liquors sofort zum Post-rTMS-Zeitpunkt an (p < 0,05) und nahm allmählich um 24 h ab. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass der Gehalt an phosphoryliertem Tau (pTau) unmittelbar nach 40 Hz rTMS (p < 0,05) anstieg. Das Verhältnis von _Aβ42/_Aβ40 zeigte einen Aufwärtstrend bei 1 Hz und 20 Hz (p < 0,05). Es gab keinen signifikanten Unterschied in den Tau-Spiegeln bei niederfrequenter (1 Hz) Stimulation. So können hohe Frequenzen (20 Hz und 40 Hz) von rTMS positive Auswirkungen auf Aβ- und Tau-Spiegel im Rhesusaffen-CSF haben, während niederfrequentes (1 Hz) rTMS nur Aβ-Spiegel beeinflussen kann.

Einleitung

Amyloid-β (Aβ) und Tau sind wichtige CSF-Biomarker. Aβ besteht aus 42 Aminosäuren (_Aβ1-42), die das Produkt des transmembranen Amyloid-Vorläuferproteins (APP) sind, das durch β- und γ-Sekretasen hydrolysiert ^wird1. _Aβ1-42 kann aufgrund seiner Löslichkeitseigenschaften zu extrazellulären Amyloid-Plaques im Gehirn aggregieren1,2. Tau ist ein mikrotubuli-assoziiertes Protein, das hauptsächlich in Axonen vorhanden ist und am anterograden axonalen Transport beteiligt ^ist3. Abnormale Tau-Hyperphosphorylierung wird hauptsächlich durch das Ungleichgewicht zwischen Kinasen und Phosphatasen induziert, was zur Ablösung von Tau aus Mikrotubuli und zur Bildung von neurofibrillären Tangles (NFT)¹ führt. Die Konzentration von Tau steigt im Liquor an, da Tau und phosphorylierte Tau-Proteine (pTau) während des neurodegenerativen Prozesses in den extrazellulären Raum freigesetzt werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass CSF-Biomarker für die drei wichtigsten pathologischen Veränderungen des Gehirns der Alzheimer-Krankheit (AD) relevant sind: extrazelluläre Amyloid-Plaques, intrazelluläre NFT-Bildung und Neuronenverlust4. Abnorme Konzentrationen von Aβ und Tau treten im Frühstadium der AD auf und ermöglichen so eine frühzeitige ^{AD-Diagnose5,6}.

Im Jahr 2016 fanden Tsai et al. heraus, dass nicht-invasives Lichtflackern (40 Hz) die Spiegel von _Aβ1-40 und _Aβ1-42 im visuellen Kortex von Mäusen vor der Ablagerung ^reduzierte7. Kürzlich berichteten sie weiter, dass die stimulation des auditiven Tonus (40 Hz) die Erkennung und das räumliche Gedächtnis verbesserte, die Amyloidproteinspiegel im Hippocampus und im auditorischen Kortex (AC) von 5XFAD-Mäusen reduzierte und die pTau-Konzentrationen im P301S-Tauopathiemodell8 verringerte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass nicht-invasive Techniken den Aβ- und Tau-Metabolismus beeinflussen könnten.

Als nicht-invasives Werkzeug könnte die transkranielle Magnetstimulation (TMS) das Nervengewebe, einschließlich des Rückenmarks, der peripheren Nerven und der Großhirnrinde, elektrisch ^stimulieren9. Darüber hinaus kann es die Erregbarkeit der Großhirnrinde an der stimulierten Stelle und in den funktionellen Verbindungen verändern. Daher wurde TMS bei der Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen und prognostischen und diagnostischen Tests eingesetzt. Die häufigste Form der klinischen Intervention bei TMS, rTMS, kann die Kortexaktivierung induzieren, die Erregbarkeit des Kortex modifizieren und die kognitive / motorische Funktion regulieren.

Es wurde berichtet, dass 20 Hz rTMS eine in vitro neuroprotektive Wirkung gegen oxidative Stressoren, einschließlich Glutamat und Aβ, hatte und die Gesamtlebensfähigkeit monoklonaler Hippocampus-HT22-Zellen bei Mäusen ^{verbesserte10}. Nach 1 Hz rTMS-Stimulation waren das β APP-spaltende Enzym 1, APP, und seine C-terminalen Fragmente im Hippocampus erheblich reduziert. Bemerkenswert ist, dass die Beeinträchtigung der Langzeitpotenzierung, des räumlichen Lernens und des Gedächtnisses im Hippocampus CA1 umgekehrt ^wurde11,12. Bai et al. untersuchten die Wirkung von rTMS auf die Aβ-induzierte Gamma-Oszillationsstörung während eines Arbeitsgedächtnistests. Sie kamen zu dem Schluss, dass rTMS die Aβ-induzierte Dysfunktion umkehren könnte, was zu potenziellen Vorteilen für das Arbeitsgedächtnis ^führt13. Es gibt jedoch nur wenige Berichte über die Auswirkungen von rTMS auf den Tau-Metabolismus und die dynamischen Veränderungen von Aβ und Tau im Liquor vor und nach rTMS. Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Untersuchung der Auswirkungen von rTMS bei verschiedenen Frequenzen (niederfrequent, 1 Hz; hohe Frequenzen, 20 Hz und 40 Hz) auf Aβ- und Tau-Spiegel im Rhesusaffen-LIQUOR.

Protokoll

Alle Experimente wurden nach den Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt, die vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie der Volksrepublik China formuliert wurden, sowie nach den Grundsätzen der Basler Erklärung. Die Genehmigung wurde vom Animal Care Committee des Sichuan University West China Hospital (Chengdu, China) erteilt. Abbildung 1 zeigt das hier verwendete einzelblinde, selbstgesteuerte Studiendesign.

1. rTMS-Geräte

1. Verwenden Sie eine 8-förmige Magnetfeldstimulatorspule, um die rTMS-Stimulation durchzuführen.

2. Tier

1. Bewahren Sie den männlichen Rhesusaffen (Macaca mulatta, 5 kg, 5 Jahre alt) in einem individuellen Heimkäfig mit freiem Zugang zu Leitungswasser und Standard-Chow auf. Stellen Sie sicher, dass die Umgebungsbedingungen kontrolliert werden, um eine relative Luftfeuchtigkeit von 60-70%, eine Temperatur von 24 ± 2 °C und einen Hell:Dunkel-Zyklus von 12:12 ^h14,15 zu gewährleisten. Führen Sie alle Experimente gemäß den Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durch.

3. Eine serielle Cisterna magna CSF-Probenahmemethode

1. Lassen Sie zwei ausgebildete Experimentatoren eine Katheterisierungsmethode durchführen, um CSF aus der Cisterna magna zu entnehmen (Abbildung 2).
2. Positionierung
   1. Betäuben Sie den Affen durch eine intramuskuläre Injektion von 5 mg/kg Zolazepam-Tiletamin (siehe Materialtabelle). Um eine erfolgreiche Anästhesie des Affen zu gewährleisten, suchen Sie nach tiefer und langsamer Atmung, stumpfem oder fehlendem Hornhautreflex und Entspannung der Muskeln der Extremitäten. Überwachen Sie während dieser Phase Temperatur, Puls, Atmung, Schleimhautfarbe und Kapillarnachfüllzeit.
   2. 2 mg/kg Morphin durch intramuskuläre Injektion alle 4 Stunden verabreichen.
   3. Legen Sie den Affen auf einen Operationstisch in der seitlichen Dekubitusposition. Beugen Sie den Hals des Affen, beugen Sie den Rücken des Affen und bringen Sie seine Knie in Richtung Brust.
3. Reifenpanne
   1. Bereiten Sie zur Desinfektion den Bereich um den unteren Rücken mit aseptischer Technik vor. Führen Sie eine Wirbelsäulennadel zwischen die Lendenwirbel L4/ L5 ein, drücken Sie sie hinein, bis es einen "Knall" gibt, wenn sie in die Lendenspülkanne eintritt, in der der Ligamentumflavum untergebracht ist.
   2. Drücken Sie die Nadel erneut, bis es einen zweiten "Pop" gibt, wo sie in die Dura Mater eintritt. Ziehen Sie den Stylet von der Spinalnadel und sammeln Sie CSF-Tropfen.
4. Kathetereinführung
   1. Führen Sie unter fluoroskopischer Führung den Epiduralkatheter durch die Punktionsnadel in den Subarachnoidalraum ein, bis er in der Cisterna magna schwimmfähig ist.
5. Port-Implantation
   1. Machen Sie einen 5 cm langen Schnitt von der Einstichstelle in Richtung des Kopfes und isolieren Sie die Haut vom Unterhautgewebe, um den Probenahmeanschluss zu platzieren. Verbinden Sie den Port mit dem Ende des Epiduralkatheters und implantieren Sie den Port unter der Haut; Dann nähen Sie den Schnitt. Desinfizieren Sie die Wunde täglich, um eine Infektion zu verhindern.
      HINWEIS: Der Affe erholt sich am Tag nach der Operation vollständig.
6. CSF-Sammlung
   1. Verwenden Sie die Gitterstäbe des Käfigs, um den Affen zurückzuhalten und seinen Rücken gebeugt zu halten.
   2. Führen Sie eine Spritze in die Mitte des Probenahmeanschlusses ein, um den Liquor durch den Katheter aus der Zisterna magna zu extrahieren. Verwerfen Sie die ersten 0,2 ml CSF (das Gesamtvolumen des Katheters und des Ports beträgt 0,1 ml) und sammeln Sie dann 1 ml CSF für die ^Analyse16.

4. Adaptives Training für Affenstühle

1. Befestigen Sie den Affen vor dem Experiment auf dem Affenstuhl, um zu vermeiden, dass der Prozess der rTMS-Intervention unterbrochen wird (Abbildung 3A,B).
2. Sammeln Sie CSF für die Biomarkeranalyse im Wachzustand des Affen, um den Einfluss von Anästhetika zu vermeiden.
3. Am dritten Tag nach der Subarachnoidalkatheterisierung, 2 Wochen vor Beginn des Experiments, unterziehen Sie den Affen zweimal täglich für jeweils 30 Minuten einem adaptiven Training mit dem Affenstuhl.

5. adaptives rTMS-Training/Scheinstimulation

1. Führen Sie das adaptive rTMS-Training / die Scheinstimulation eine Woche nach dem adaptiven Training mit dem Affenstuhl und eine Woche vor Beginn des formalen Experiments durch, um den Fortschritt des Experiments nicht aufgrund von Vibrationen und Geräuschen während des Stimulationsprozesses zu behindern.
2. Verwenden Sie eine Scheinspule (die nur Vibration und Ton erzeugt und kein Magnetfeld erzeugt), um den Affen zu stimulieren. Bieten Sie dem Affen nach der Stimulation Nahrung an, damit er sich an den Prozess anpasst (Abbildung 3C).
3. Führen Sie zweimal täglich ein adaptives rTMS-Training auf einem Affenstuhl durch, jeweils 30 Minuten lang für insgesamt 2 Wochen.

6. Behandlungsprotokoll

1. Verwenden Sie drei verschiedene Frequenzen (1 Hz/20 Hz/40 Hz) von rTMS, um die bilaterale DLPFC (R-L-DLPFC) des Affen zu stimulieren, wie zuvor ^{beschrieben17}. Lokalisieren Sie die DLPFC nach dem internationalen 10-20-System.
   1. Führen Sie drei verschiedene Sitzungen von rTMS mit einer Auswaschzeit von mehr als 24 ^{h18,19 durch}.
      1. Verwenden Sie für den ersten Zeitraum die folgenden Parameter: eine Frequenz von 1 Hz für rTMS, ein Muster von rTMS, das aus 20 Burst-Zügen, 20 Impulsen mit 10 s Inter-Train-Intervallen zwischen den Zügen und einer Stimulationsintensität von 100% der durchschnittlichen Ruhemotorschwelle (RMT) besteht, zweimal täglich an drei aufeinanderfolgenden ^Tagen20,21.
      2. Verwenden Sie für die zweite Periode die folgenden Parameter: Züge mit hoher Frequenz (20 Hz) rTMS mit 100% RMT für 2 s Dauer mit 28 s Inter-Train-Intervallen, insgesamt 2.000 Stimuli (40 Stimuli/Zug, 50 Züge) pro Sitzung, zweimal täglich an drei aufeinanderfolgenden ^Tagen22.
      3. Verwenden Sie für die dritte Periode die folgenden Parameter: Züge mit Gammafrequenz (40 Hz) rTMS mit 100% RMT, die in 1 s Dauer geliefert werden, getrennt durch 28 s Inter-Zug-Intervalle. Halten Sie die Gesamtzahl der Impulse für jede Sitzung gleich wie bei 20 Hz rTMS, zweimal täglich an drei aufeinanderfolgenden ^Tagen7,22.

7. CSF-Biomarker

1. Analysieren Sie vier CSF-Biomarker: _Aβ42, _Aβ42/_Aβ40, tTau und pTau.

8. CSF-Sammlung und Indexerkennungsmethode

1. Verwenden Sie eine minimal-invasive Katheterisierungsmethode, um den Liquor zu beproben.
2. Verwenden Sie die Gitterstäbe des Käfigs, um den Affen zurückzuhalten und seinen Rücken gebeugt zu halten. Weisen Sie den anderen Bediener an, eine Spritze in die Mitte des Probenahmeanschlusses einzuführen, um sicherzustellen, dass csf durch den Katheter extrahiert wird.
3. CSF zu 5 Zeitpunkten sammeln (4 Proben pro Zeitpunkt in Abständen von 3 Minuten): pre-rTMS, 0 h/2 h/6 h/24 h post-rTMS23,24,25. Sammeln Sie insgesamt 60 Proben für 3 Frequenzen; nummerieren und in einem -80 °C Kühlschrank bis zu 1 Monat aufbewahren. Nach dem Experiment unterziehen Sie alle Proben der Flüssigkeitssplittererkennung gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).

9. Statistische Auswertung

1. Stellen Sie alle Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dar.
2. Führen Sie den Shapiro-Wilk-Test durch, um die Normalität bei einer kleinen Stichprobengröße zu testen. Führen Sie eine ANOVA mit wiederholten Zwei-Wege-Messungen und den Mehrfachvergleichstest von Tukey durch.
   ANMERKUNG: Ein Wert (zweiseitig) < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Die Ergebnisse zeigten, dass rTMS die Aβ- und Tau-Spiegel im Rhesusaffen-CSF beeinflussen könnte. Die CSF-Biomarkerspiegel änderten sich mit der Zeit nach der rTMS-Stimulation bei verschiedenen Frequenzen (1 Hz, 20 Hz und 40 Hz).

_Aβ42 und Aβ42/Aβ40
Wie in Abbildung 4A gezeigt, stiegen die _{Aβ42-Spiegel} nach 1 Hz...

Diskussion

_Aβ1-42, ein etablierter Biomarker für AD, ist ein CSF-Kernbiomarker im Zusammenhang mit dem Aβ-Metabolismus und der Amyloid-Plaque-Bildung im Gehirn und wurde in klinischen Studien und in der Klinik weit ^verbreitet26 eingesetzt. Neuere Studien haben gezeigt, dass das CSF-Verhältnis _Aβ42/_Aβ40 ein besserer diagnostischer Biomarker für AD ist als _Aβ42 allein, da es ein besserer Indikator für die Pathologie des AD-Typs ^ist27,28

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia Puncture Kit for Single Use	Weigao, Shandong, China
CCY-I magnetic field stimulator	YIRUIDE MEDICAL, Wuhan, China
GraphPad Prism version 7.0	GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA
Human Amyloid Beta and Tau Magnetic Bead Panel	EMD Millipore Corporation, Billerica, MA 01821 USA		liquid chip detection
MILLIPLEX Analyst 5.1	EMD Millipore Corporation, Billerica, MA 01821 USA
Monkey Chair HH-E-1	Brainsight, Cambridge, MA 02140 USA
Zoletil 50	Virbac, France		zolazepam–tiletamine