Rhesus Maymun Beyin omurilik Sıvısında Aβ ve Tau Seviyelerinin Tekrarlayan Transkraniyal Manyetik Stimülasyonu Üzerine Bir Pilot Çalışma

Özet

Burada, farklı frekanslarda (1 Hz/20 Hz/40 Hz) tekrarlayan transkraniyal manyetik stimülasyonun Rhesus maymun beyin omurilik sıvısında Aβ ve tau metabolizması üzerindeki etkisini araştırmak için bir pilot çalışmanın prosedürünü açıklıyoruz.

Özet

Önceki çalışmalar, invaziv olmayan bir ışık titremesi rejiminin ve işitsel ton stimülasyonunun beyindeki Aβ ve tau metabolizmasını etkileyebileceğini göstermiştir. İnvaziv olmayan bir teknik olarak nörodejeneratif bozuklukların tedavisinde tekrarlayan transkraniyal manyetik stimülasyon (rTMS) uygulanmıştır. Bu çalışmada rTMS'nin rhesus maymun beyin omurilik sıvısında (CSF) Aβ ve tau düzeyleri üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Bu tek kör, kendi kendini kontrol eden bir çalışma. Rhesus maymununun bilateral-dorsolateral prefrontal korteksini (DLPFC) uyarmak için üç farklı frekans (düşük frekans, 1 Hz; yüksek frekanslar, 20 Hz ve 40 Hz) kullanıldı. CSF toplamak için kateterizasyon yöntemi kullanılmıştır. Tüm numuneler CSF biyobelirteçlerini (_{Aβ42, Aβ42}/_Aβ40, tTau, pTau) analiz etmek için sıvı çip tespitine tabi tutuldu. CSF biyobelirteç düzeyleri rTMS tarafından uyarılma sonrası zamanla değişti. Stimülasyondan sonra, CSF'deki _Aβ42 seviyesi tüm frekanslarda (1 Hz, 20 Hz ve 40 Hz) bir yükseliş eğilimi gösterdi ve yüksek frekanslar için (p < 0.05) düşük frekanstan daha önemli farklılıklar gösterdi.

Yüksek frekanslı rTMS'den sonra, CSF'nin toplam Tau (tTau) seviyesi rTMS sonrası zaman noktasında hemen artmıştır (p < 0.05) ve kademeli olarak 24 saat azaldı. Ayrıca, sonuçlar fosforillenmiş Tau (pTau) seviyesinin 40 Hz rTMS'den hemen sonra arttığını göstermiştir (p < 0.05). _Aβ42/_Aβ40 oranı 1 Hz ve 20 Hz'de (s < 0.05) bir yükseliş gösterdi. Düşük frekanslı (1 Hz) stimülasyonlu tau seviyelerinde anlamlı bir fark yoktu. Bu nedenle, rTMS'nin yüksek frekansları (20 Hz ve 40 Hz), rhesus maymunu CSF'deki Aβ ve tau seviyeleri üzerinde olumlu etkilere sahip olabilirken, düşük frekanslı (1 Hz) rTMS sadece Aβ seviyelerini etkileyebilir.

Giriş

Amiloid β (Aβ) ve tau önemli CSF biyobelirteçlerdir. Aβ, β ve γ salgılar1 tarafından hidrolize edilmiş transmembran amiloid öncül proteininin (APP) ürünü olan 42 amino asitten (_Aβ1-42) oluşur. _Aβ1-42, çözünürlük özellikleri nedeniyle beyindeki hücre dışı amiloid plaklarına bir araya ^gelebilir1,2. Tau, esas olarak aksonlarda bulunan ve anterograd aksonal taşımada yer alan mikrotübül ilişkili bir ^proteindir3. Anormal tau hiperfosforilasyonu esas olarak kinazlar ve fosfatazlar arasındaki dengesizlikten etkilenerek tau'nun mikrotübüllerden kopması ve nörofibril karışıklıkların (NFT)¹ oluşumu ile sonuçlanır. Tau ve fosforillenmiş tau proteinleri (pTau) nörodejeneratif süreç sırasında hücre dışı alana salındığı için CSF'de tau konsantrasyonu artar. Önceki çalışmalar, CSF biyobelirteçlerinin Alzheimer hastalığı (AD) beyninin üç ana patolojik değişikliğiyle ilgili olduğunu göstermiştir: hücre dışı amiloid plaklar, hücre içi NFT oluşumu ve nöron ^kaybı4. AD'nin erken evresinde anormal Aβ ve tau konsantrasyonları mevcuttur, böylece erken AD tanısına izin ^verir5,6.

2016 yılında, Tsai ve arkadaşları, invaziv olmayan ışık titremesinin (40 Hz) ön çökelti farelerinin görsel korteksinde _Aβ1-40 ve _Aβ1-42 seviyelerini azalttığını ^buldu7. Son zamanlarda, işitsel ton stimülasyonunun (40 Hz) tanıma ve mekansal hafızayı iyileştirdiğini, hipokampustaki amiloid protein seviyelerini ve 5XFAD farelerinin işitsel korteksini (AC) azalttığını ve P301S tauopati modelinde pTau konsantrasyonlarının azaldığını ^bildirdiler8. Bu sonuçlar, non-invaziv tekniklerin Aβ ve tau metabolizmalarını etkileyebileceğini göstermektedir.

İnvaziv olmayan bir araç olarak, transkraniyal manyetik stimülasyon (TMS), omurilik, periferik sinirler ve serebral korteks9 dahil olmak üzere sinir dokusunu elektriksel olarak uyarabilir. Ayrıca, uyarılmış bölgede ve fonksiyonel bağlantılarda serebral korteksin uyarılabilirliğini değiştirebilir. Bu nedenle TMS nörodejeneratif bozuklukların tedavisinde ve prognostik ve tanısal testlerde kullanılmıştır. TMS'de en yaygın klinik müdahale şekli olan rTMS, korteks aktivasyonunu teşvik edebilir, korteksin genişletilebilirliğini değiştirebilir ve bilişsel/ motor fonksiyonu düzenleyebilir.

20 Hz rTMS'nin glutamat ve Aβ dahil olmak üzere oksidatif stresörlere karşı in vitro nöroprotektif etkiye sahip olduğu ve farelerde monoklonal hipokampal HT22 hücrelerinin genel canlılığını iyileştirdiği ^{bildirilmiştir10}. 1 Hz rTMS stimülasyonundan sonra, β bölgesi APP-cleaving enzimi 1, APP ve hipokampustaki C-terminal parçaları önemli ölçüde azaltıldı. Özellikle, hipokampal CA1'de uzun süreli potensiyasyon, mekansal öğrenme ve hafıza bozukluğu tersine ^{çevrildi11,12}. Bai ve arkadaşları, rTMS'nin çalışma belleği testi sırasında Aβ kaynaklı gama salınım disfonksiyonu üzerindeki etkisini araştırdı. RTMS'nin Aβ kaynaklı disfonksiyonu tersine çevirebileceği ve bunun da çalışma belleği için potansiyel faydalar sağlayabileceği sonucuna ^vardılar13. Bununla birlikte, rTMS'nin tau metabolizması üzerindeki etkileri ve rTMS öncesi ve sonrası CSF'de Aβ ve tau'daki dinamik değişiklikler hakkında çok az rapor vardır. Bu protokol, rTMS'nin rhesus maymunu CSF'deki Aβ ve tau düzeylerindeki farklı frekanslardaki (düşük frekans, 1 Hz; yüksek frekanslar,20 Hz ve 40 Hz) etkilerini araştırma prosedürünü açıklar.

Protokol

Tüm deneyler, Çin Halk Cumhuriyeti Bilim ve Teknoloji Bakanlığı tarafından formüle edilen Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberliğinde ve Basel Deklarasyonu ilkeleri kapsamında gerçekleştirildi. Sichuan Üniversitesi Batı Çin Hastanesi Hayvan Bakım Komitesi (Chengdu, Çin) tarafından onay verildi. Şekil 1 burada kullanılan tek kör, kendi kendini kontrol eden çalışma tasarımını göstermektedir.

1. rTMS cihazları

1. rTMS stimülasyonunu gerçekleştirmek için 8 şekilli manyetik alan uyarıcı bobini kullanın.

2. Hayvan

1. Erkek rhesus maymununu (Macaca mulatta, 5 kg, 5 yaşında) musluk suyuna ve standart yiyeceğa ücretsiz erişime sahip bireysel bir ev kafesinde tutun. Çevresel koşulların% 60-70 bağıl nem, 24 ± 2 ° C sıcaklık ve 12:12 saat ışık sağlayacak şekilde kontrol edildiklerinden emin olun: karanlık ^döngü14,15. Tüm deneyleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna göre gerçekleştirin.

3. Seri sarnıç magna CSF örnekleme yöntemi

1. İki eğitimli deneycinin sarnıç magnasından CSF örneği almak için kateterizasyon yöntemi gerçekleştirmesini sağlamak (Şekil 2).
2. Konumlandırma
   1. Maymunu 5 mg/kg zolazepam-tiletamin intramüsküler enjeksiyonla uyuşturun ( Bkz. Malzeme Tablosu). Maymunun başarılı bir şekilde uyuşturulmasını sağlamak için derin ve yavaş nefes alma, donuk veya yok kornea refleksi ve ekstremite kaslarının gevşemesini arayın. Bu aşamada sıcaklığını, nabzını, solunumunu, mukoza zar rengini ve kılcal dolgu süresini izleyin.
   2. Her 4 saatte bir intramüsküler enjeksiyon ile 2 mg/kg morfin sür.
   3. Maymunu lateral decubitus pozisyonunda bir ameliyat masasına yerleştirin. Maymunun boynunu bükün, maymunun arkasını kambur bükün ve dizlerini göğsüne doğru getirin.
3. Delinme
   1. Dezenfeksiyon için, aseptik tekniği kullanarak alt sırtın etrafındaki alanı hazırlayın. Bel omurları L4/L5 arasına bir omurilik iğnesi yerleştirin, bağ flavum'un yerleştirildiği bel sarnıcına girdiğinde bir "pop" olana kadar itin.
   2. İğneyi, dura mater'e girdiği yerde ikinci bir "pop" olana kadar tekrar itin. Omurilik iğnesinden stileyi çekin ve CSF damlalarını toplayın.
4. Kateter ekleme
   1. Floroskopik rehberlik altında, epidural kateteri, sarnıç magnasında şamandıra olana kadar delinme iğnesi aracılığıyla subaraknoid boşluğa yerleştirin.
5. Bağlantı noktası implantasyonu
   1. Delinme bölgesinden başın yönüne kadar 5 cm'lik bir kesi yapın ve örnekleme portunu yerleştirmek için cildi deri altı dokusundan izole edin. Bağlantı noktasını epidural kateterin sonuna bağlayın ve bağlantı noktasını cildin altına takın; sonra, kesiği dikin. Enfeksiyonu önlemek için yarayı günlük olarak dezenfekte edin.
      NOT: Maymun ameliyattan sonraki gün tamamen iyileşir.
6. CSF koleksiyonu
   1. Maymunu dizginlemek ve sırtını bükmek için kafesin çubuklarını kullanın.
   2. CSF'yi sarnıç magnasından kateterden çıkarmak için örnekleme portunun ortasına bir şırınna yerleştirin. CSF'nin ilk 0,2 mL'sini atın (kateter ve bağlantı noktasının toplam hacmi 0,1 mL'dir) ve ardından analiz için 1 mL CSF ^toplayın16.

4. Maymun sandalye uyarlamalı eğitim

1. RTMS müdahale sürecini kesintiye uğratmamak için deneyden önce maymun sandalyesine maymunu sabitleyin (Şekil 3A,B).
2. Anestezik ilaçların etkisini önlemek için maymunun uyanık durumunda biyobelirteç analizi için CSF toplayın.
3. Subaraknoid kateterizasyondan sonraki üçüncü günde, deneyin başlamasından 2 hafta önce, maymunu her seferinde 30 dakika boyunca günde iki kez maymun sandalyesi ile adaptif eğitime tabi edin.

5. rTMS uyarlanabilir eğitim / sham stimülasyonu

1. RTMS uyarlamalı eğitimi / sham stimülasyonunu maymun sandalyesi ile adaptif eğitimden bir hafta sonra, stimülasyon işlemi sırasında titreşimler ve sesler nedeniyle deneyin ilerlemesini engellememek için resmi deneyin başlamasından bir hafta önce gerçekleştirin.
2. Maymunu uyarmak için bir sahte bobin (sadece titreşim ve ses üreten ve manyetik alan üretmeyen) kullanın. İşleme uyum sağlamasına yardımcı olmak için uyarılmadan sonra maymuna yiyecek sunun (Şekil 3C).
3. Günde iki kez, toplam 2 hafta boyunca her seferinde 30 dakika boyunca bir maymun sandalyesinde rTMS uyarlanabilir eğitim gerçekleştirin.

6. Tedavi protokolü

1. Maymunun bilateral-DLPFC'sini (R-L-DLPFC) uyarmak için daha önce açıklandığı gibi üç farklı frekans (¹ Hz/20 Hz/40 Hz) rTMS kullanın. DLPFC'yi uluslararası 10-20 sistemine göre yerelleştirin.
   1. 24 ^h18,19'u aşan bir yıkama süresi ile üç farklı rTMS seansı ^{gerçekleştirin}.
      1. İlk dönem için aşağıdaki parametreleri kullanın: rTMS için 1 Hz frekans, 20 patlak trenden oluşan bir rTMS deseni, trenler arasında 10 s trenler arası aralıklarla 20 darbe ve ortalama dinlenme motoru eşiğinin (RMT)% 100'ü kadar bir uyarım yoğunluğu, üç ardışık gün boyunca günde iki ^kez20,21.
      2. İkinci dönem için aşağıdaki parametreleri kullanın: 28 s trenler arası aralıklarla 2 s süre için %100 RMT ile yüksek frekanslı (20 Hz) rTMS trenleri, her seansta günde iki kez olmak üzere toplam 2.000 uyaran (40 uyaran/tren, 50 tren) iki kez ardışık üç ^gün22.
      3. Üçüncü dönem için aşağıdaki parametreleri kullanın: 1 s süre içinde teslim edilen %100 RMT'ye sahip gama frekanslı (40 Hz) rTMS trenleri 28 sn trenler arası aralıklarla ayrılmıştır. Her seans için toplam darbe sayısını 20 Hz rTMS ile aynı tutun, art arda üç gün boyunca günde iki ^kez7,22.

7. CSF biyobelirteçler

1. Dört CSF biyobelirteciyi analiz edin: _Aβ42, _Aβ42/_Aβ40, tTau ve pTau.

8. CSF toplama ve dizin algılama yöntemi

1. CSF'yi örneklemek için minimal invaziv bir kateterizasyon yöntemi kullanın.
2. Maymunu dizginlemek ve sırtını bükmek için kafesin çubuklarını kullanın. Diğer operatöre, CSF'nin kateterden çıkarılmasını sağlayarak örnekleme bağlantı noktasının ortasına bir şırınna takmasını söyleyin.
3. CSF'yi 5 zaman noktasında toplayın (her zaman noktasında 3 dakika aralıklarla 4 örnek): rTMS öncesi, 0 h/2 h/6 h/24 h post-rTMS23,24,25. 3 frekans için toplam 60 örnek toplayın; numarasını alın ve 1 aya kadar -80 °C buzdolabında saklayın. Deneyden sonra, tüm numuneleri üreticinin talimatlarına göre sıvı talaş tespitine tabi edin (Bkz. Malzeme Tablosu).

9. İstatistiksel analiz

1. Tüm verileri standart sapma (SD) ± ortalama olarak sunun.
2. Küçük bir örnek boyutu durumunda normalliği test etmek için Shapiro-Wilk testini gerçekleştirin. ANOVA ve Tukey'in çoklu karşılaştırma testini iki yönlü tekrarlanan ölçümler gerçekleştirin.
   NOT: 0,05 < (iki kuyruklu) değeri istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

Sonuçlar

Sonuçlar, rTMS'nin rhesus maymunu CSF'deki Aβ ve tau seviyelerini etkileyebileceğini gösterdi. CSF biyobelirteç seviyeleri, rTMS stimülasyonundan sonra farklı frekanslarda (1 Hz, 20 Hz ve 40 Hz) zamanla değişti.

_Aβ42 ve Aβ42/Aβ40
Şekil 4A'da gösterildiği gibi, 1 Hz rTMS stimülasyonundan sonra, _Aβ42 se...

Tartışmalar

AD'nin köklü bir biyobelirteç olan _Aβ1-42, beyindeki Aβ metabolizması ve amiloid plak oluşumu ile ilgili bir CSF çekirdek biyobelirteçtir ve klinik çalışmalarda ve klinikte yaygın olarak ^{kullanılmıştır26}. Son çalışmalar, CSF _Aβ42/_Aβ40 oranının sadece _Aβ42'den daha iyi bir tanı biyobelirteci olduğunu göstermiştir, çünkü AD tipi patolojinin daha iyi bir ^{göstergesidir27,28...}

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia Puncture Kit for Single Use	Weigao, Shandong, China
CCY-I magnetic field stimulator	YIRUIDE MEDICAL, Wuhan, China
GraphPad Prism version 7.0	GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA
Human Amyloid Beta and Tau Magnetic Bead Panel	EMD Millipore Corporation, Billerica, MA 01821 USA		liquid chip detection
MILLIPLEX Analyst 5.1	EMD Millipore Corporation, Billerica, MA 01821 USA
Monkey Chair HH-E-1	Brainsight, Cambridge, MA 02140 USA
Zoletil 50	Virbac, France		zolazepam–tiletamine