Isolierung von stabil transfizierten Melanomzellklone

Zusammenfassung

Es wird ein Protokoll zur Isolierung stabil transfizierter Melanomzellklone mit Hilfe von Glaszylindern beschrieben. Wir konzentrieren uns auf praktische Ratschläge, die für den Erfolg des gesamten Verfahrens entscheidend sein können.

Zusammenfassung

Zellpopulationen, die stabile Veränderungen in ihrer Genominformation aufweisen, werden von Wissenschaftlern häufig als Forschungsmodell verwendet. Sie erfordern keine wiederholte Zelltransfektion, da dies zu einer heterogenen Zellpopulation und einer variablen Transfektionseffizienz führen kann, was die Reproduzierbarkeit beeinträchtigt. Darüber hinaus sind sie für groß angelegte Analysen vorzuziehen. Die Erzeugung stabiler Zellklone ist für eine Vielzahl von Anwendungen nützlich, wie z.B. die Erforschung von Genfunktionen und der Produktion rekombinanter Proteine. Es gibt einige Methoden, um bei der ersten transienten Transfektion eine homogene Zellpopulation zu erhalten. Hier beschreiben wir die Isolierung von einzelligen Klonen mit Glaszylindern. Obwohl diese Methode schon seit einiger Zeit bekannt ist, gibt es einige entscheidende Schritte, deren Vernachlässigung zum Scheitern führen kann. Wir haben diese Methode erfolgreich eingesetzt, um Klone zu erhalten, die ein Protein of Interest (POI) stabil überexprimieren oder ein Gen of Interest (GOI) ausknocken. Wir beschreiben Vorbereitungsschritte wie die Optimierung der Auswahl der Wirkstoffkonzentrationen, die Vorbereitung von Glaszylindern und die Validierung, ob die erhaltenen Klone die gewünschte Veränderung in der Expression der GOI durch PCR, Western-Blot-Analyse, Immunfärbung oder gDNA-Sequenzierung (abhängig von der Art der abgeleiteten Klone) aufweisen. Wir diskutieren auch die phänotypische Heterogenität gut etablierter Zelllinien, da dies ein Problem bei der Gewinnung stabiler Zellklone sein könnte.

Einleitung

Die stabile Transfektion von Säugetierzellen ist eine routinemäßig eingesetzte Methode in verschiedenen Zellkulturanwendungen, einschließlich der Krebsforschung. Sein Vorteil gegenüber der transienten Transfektion besteht darin, dass das eingebrachte fremde genetische Material nicht durch Umweltfaktoren (z.B. Zellkonfluenz oder Replikationsstadium) und Zellteilung verloren gehen kann, da es in das Genom des Wirts^{integriert ist 1}. Die Entwicklung stabil exprimierender Zelllinien kann mühsam und herausfordernd sein, aber wenn eine anhaltende Expression von Genen über einen längeren Zeitraum erforderlich ist, ist die Derivation stabiler Zelllinien eine bevorzugte Option. Das häufigste Ziel der Transfektion besteht darin, die Funktionen eines bestimmten Gens oder Genprodukts durch Überproduktion oder Herunterregulierung seiner Expression zu untersuchen. Die Herstellung rekombinanter Proteine und Gentherapien erfordern jedoch auch das Einbringen von fremdem Erbgut in die Zelle².

Ein Klon ist definiert als eine Zellpopulation, die von einer einzelnen Zelle abgeleitet ist. Die Isolierung von Einzelzellklonen ist ein entscheidender Aspekt der Zellbiologie bei der Untersuchung von Zellen mit genotypischer und phänotypischer Variabilität. Für die Gewinnung von Zellklone werden drei Haupttechniken verwendet: die Verdünnungstechnik, die Klonierungsringtechnik³ und die Zellsortiertechnik⁴. Jeder hat Vor- und Nachteile. Wir geben eine detaillierte Beschreibung eines Verfahrens zur Isolierung von Melanomzellklone mit Hilfe der Glaszylindertechnik. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass die Zellen aus Zellkulturen mit geringer Dichte ein moderates klonales Wachstum aufweisen. Darüber hinaus haben die ausgewählten Zellen bereits Proliferationsfähigkeit gezeigt, da sie bereits Kolonien gebildet haben⁵. Bei diesem Verfahren werden transfizierte Zellen spärlich, aber nicht mit begrenzender Verdünnung, in ein großes Gefäß ausgesät und ihnen erlaubt, sich in Gegenwart eines selektiven Antibiotikums 2-3 Wochen lang auszudehnen und Kolonien zu bilden. Die einzelnen Kolonien können dann mit Hilfe von Glaszylindern isoliert werden, die über die Kolonien gelegt und mit Silikonfett auf das Gefäß geklebt werden. Als nächstes werden die Zellen mit Trypsin abgelöst und dann zur weiteren Kultivierung in Gegenwart eines selektiven Mediums auf Multiwell-Platten übertragen.

Es gibt eine Reihe von Studien, die die Isolierung von Klonen beschreiben, aber wir konzentrieren uns darauf, Details wie die Größe zu zeigen, die Klone nach 2 Wochen Selektion haben sollten, wie man die Position der Klone während ihrer Isolierung markiert und wie man eine geeignete Konzentration von Antibiotikum für die Selektion auswählt. Wir konzentrieren uns auf praktische Ratschläge, die für den Erfolg des gesamten Verfahrens entscheidend sein können. Das vorgestellte Protokoll ermöglicht es uns, stabile Zellklone innerhalb von 2-4 Wochen zu erhalten. Die Methode ist einfach und billig und erfordert keine komplizierte Ausrüstung. Wir teilen eine Technik, die es uns ermöglicht hat, viele Forschungsmodelle zu erhalten, einschließlich GSN KO-Klone ^6,7,8.

Protokoll

1. Zellsubkultur und Seeding zur Optimierung der Wirkstoffkonzentration

1. Erwärmen Sie das Zellkulturmedium (in diesem Fall das modifizierte Eagle-Medium von Dulbecco mit einer reduzierten Konzentration (1,5 g/l) von NaHCO₃, 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS), 1 % (v/v) L-Glutamin und 1 % (v/v) Antibiotikum-Antimykotikum) und Trypsinlösung in einem Wasserbad auf 37 °C.
2. Das Zellkulturmedium aus den A735-Zellen, die in einem T25-Zellkulturkolben wachsen, aspirieren und verwerfen. Die Zelllinie wird aus kommerziellen Quellen bezogen.
3. Waschen Sie das restliche Zellkulturmedium aus den Zellen aus, indem Sie den Kolben mit 1 ml Trypsin oder PBS-Lösung waschen.
4. Aspirieren und verwerfen Sie die Trypsin- oder PBS-Lösung aus den Zellen.
5. 1 ml Trypsinlösung in den Kolben geben und bei 37 °C inkubieren. Beobachten Sie die Ablösung der Zellen vorsichtig mit einem inversen Mikroskop.
6. Stoppen Sie die Trypsinaktivität, indem Sie 3 ml frisches vollständiges Zellkulturmedium hinzufügen und den Zellkulturkolben damit spülen, wenn sich die Zellen ablösen.
7. Übertragen Sie die Zellsuspension aus dem Kolben in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
8. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
9. Aspirieren Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn.
10. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml des frischen Zellkulturmediums.
11. Um die Zelldichte zu berechnen, zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler oder Hämozytometer.
12. Die entsprechende Anzahl von Zellen in eine Kulturschale der entsprechenden Größe aussäen.
    HINWEIS: In diesem Experiment wurden 450.000 Zellen der A375-Zelllinie in 2 ml des Zellkulturmediums in einer 35-mm-Kulturschale ausgesät.

2. Optimierung der ausgewählten Wirkstoffkonzentration

1. Ermitteln Sie den vom Hersteller empfohlenen Konzentrationsbereich des Arzneimittels, das zur Auswahl stabiler Zellklone verwendet werden soll.
   HINWEIS: Ein Selektionsgen, das durch Transfektion mit einem genetischen Vektor in eine Zelle eingeführt wird, verleiht der Zelle eine Resistenz gegen das Selektionsmedikament. Puromycin in einer Konzentration von 1 μg/ml wurde als Selektionsmarker verwendet, um eine stabile Expression des genetischen Vektors zu erreichen und nicht transfizierte Zellen zu eliminieren.
2. Säen Sie die Zellen in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte, um am nächsten Tag eine Konfluenz von 50 % zu erreichen. Bereiten Sie drei Vertiefungen für jede Arzneimittelkonzentration und eine unbehandelte Kontrolle vor. Säen Sie 10.000 Zellen pro Well. Die Zellzahl hängt von der verwendeten Zelllinie ab und muss empirisch bestimmt werden.
3. Bereiten Sie nach 24 Stunden 10 Verdünnungen des Arzneimittels im vollständigen Medium von der niedrigsten bis zur höchsten vom Hersteller empfohlenen Konzentration vor und geben Sie sie in die Zellen.
   HINWEIS: In diesem Fall wurde Puromycin verwendet. Der Konzentrationsbereich lag bei 0-10 μg/ml. Alle 3 Tage oder wenn viele abgestorbene Zellen im Medium beobachtet werden, wechseln Sie zu frischem Medium.
4. Beobachten Sie die Zellen eine Woche lang täglich und machen Sie sich Notizen über ihren Zusammenfluss, ihre Proliferation und ihren Tod in Bezug auf die Kontrollplatte.
   HINWEIS: Eine angemessene Konzentration ist eine Konzentration, bei der die Zellen aufhören zu vermehren und nicht sofort zum Zelltod führt, sondern alle behandelten Zellen nach 48-120 h abtötet. Bei einigen Kombinationen von Zelllinien und Medikamenten gibt es jedoch möglicherweise keine Phase, in der Zellen aufhören zu vermehren, sondern absterben. In einer solchen Situation wäre die niedrigste Konzentration des Medikaments, das alle Zellen abtötet, für die Selektion geeignet.

3. Zellaussaat und Transfektion

1. Säen Sie die Zellen in einer Vertiefung einer Sechs-Well-Platte.
   HINWEIS: Das endgültige Volumen der Zellsuspension im Zellkulturmedium sollte 2,5 ml betragen. Für dieses Experiment wurden 450.000 Zellen pro Well ausgesät. Die Zellzahl muss empirisch bestimmt werden, so dass ihre Konfluenz nach 48 Stunden Aussaat 90% nicht überschreiten darf.
2. Die Zellen werden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ für 24 h kultiviert.
   HINWEIS: Die Zellen wurden vor der Transfektion 24 Stunden lang kultiviert. 48 h nach der Aussaat wurde jedoch beobachtet, dass die Zellen effizienter transfiziert wurden.
3. Aspirieren und verwerfen Sie das Zellkulturmedium über den Zellen.
4. Ersetzen Sie das verworfene Medium durch vorgewärmtes antibiotikafreies Zellkulturmedium (10 % (v/v) FBS, mit Glutamin ergänztes DMEM).
   HINWEIS: Die Notwendigkeit, das Zellkulturmedium zu wechseln, ist auf die erhöhte Zellpermeabilität zurückzuführen, die durch einige Transfektionsreagenzien verursacht wird, die einen erhöhten Zustrom von Antibiotika in die Zellen verursachen können, was zum Zelltod führt.
5. Verdünnen Sie Transfektionsreagenzien in antibiotika- und serumfreiem DMEM. Verwenden Sie Polyethylenimin (PEI), ein Transfektionsreagenz auf Lipidbasis oder Elektroporation. Für die Zelltransfektion verwenden Sie 2 mg/ml Polyethyleniminlösung in einem Gewichtsverhältnis von 1:2,175 für 4 μg DNA.
   HINWEIS: Als DNA-Lösung wurde im CRISPR/Cas9(D10A)-System eine Mischung aus zwei Plasmiden mit den folgenden gRNA-Sequenzen verwendet: 5'ccgggccgtgcagcaccgtg3' und 5'atccagctgcacggtaaaga3'.
6. Inkubieren Sie die Transfektionsmischung 30 Minuten lang bei RT.
7. Nach der Inkubation geben Sie die Transfektionsmischung vorsichtig tropfenweise zu den Zellen, die in den Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte wachsen.
8. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ für 2-6 h.
9. Wechseln Sie das Medium zum vollständigen Zellkulturmedium.
10. Die Zellen werden für die nächsten 24 Stunden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ kultiviert.

4. Erzeugung von Zellklonen

1. Die transfizierten Zellen werden trypsinisiert und in eine Kulturschale mit einem Durchmesser von 150 mm und einem 20 mm geformten Gitter gemäß den Anweisungen in Abschnitt 1 des Protokolls überführt.
   HINWEIS: Aufgrund der Verschmelzung der Zellen untereinander bei hoher Dichte wird empfohlen, die Zellen gleichmäßig in zwei Zellkulturschalen zu überführen. Das Gitter auf der Kulturschale hilft beim Auffinden von Klonen und beim Nachverfolgen ihrer Migration. Auf einem ausgedruckten Schalenplan kann man später die Position der Klone markieren (Abbildung 1B). Darüber hinaus wäre es für Zellen, die die Entfernung des Mediums und den Kontakt mit der Luft nicht tolerieren (was zum Tod/irreversiblen Schaden führt), besser, mehr Schalen mit einer kleineren Oberfläche zu verwenden, um weniger Kolonien aus einer Schale zu isolieren. Dies könnte die Zeit der Exposition gegenüber Luft während der Klonisolation verkürzen und die Wahrscheinlichkeit einer Zelldehydrierung verringern.
2. Die Zellen werden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ für 24 h kultiviert.
3. Wechseln Sie das Zellkulturmedium zu einem Medium, das ein selektives Antibiotikum enthält.
   HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt ist es wichtig, die Zellen in Gegenwart eines selektiven Antibiotikums zu kultivieren; Andernfalls besteht die Möglichkeit, dass das integrierte Transgen aus dem Gen herausgeschnitten wird.
4. Wechseln Sie das Medium alle 3 Tage oder wenn viele tote Zellen im Medium schwimmen.
   HINWEIS: In diesem Experiment wurden die Zellen mit Puromycin in einer Konzentration von 1 μg/ml inkubiert. Der Auswahlschritt für den Zellklon dauert ca. 2 Wochen. Die Bildung von Klonen sollte durch die Beobachtung ihres Wachstums unter einem inversen Mikroskop überwacht werden, da sie nicht wachsen und mit benachbarten Zellklonen in Kontakt kommen sollten. Es kann nicht verhindert werden, dass Zellen einer Kolonie wandern und mit einer anderen Kolonie wachsen. Daher ist es wichtig, die Platte auf Zellmigration von den Klonen zu beobachten und die Informationen dazu auf dem Schalenplan zu notieren.

5. Auswahl der Klone für die Isolierung

1. Untersuchen Sie die Zellkulturschale auf Zellklone unter einem inversen Mikroskop mit einem 10x- oder 20x-Objektiv.
   HINWEIS: Die Klone bestehen aus ca. 500-30.000 Zellen. Es kommt jedoch auf die verwendete Zelllinie an. Eine zufriedenstellende Kolonie sollte von anderen Zellkolonien getrennt sein und eine durchschnittliche Größe haben, da sehr große und herausragende Klone aus mehr als einer Zelle entstehen können (Abbildung 1B).
2. Finden Sie mit dem inversen Mikroskop eine geeignete Kolonie, indem Sie die Schale sorgfältig untersuchen und die gefundenen Klone bewerten. Platzieren Sie die Markierung an der Stelle des ausgewählten Klons, wobei die Markierung auf der Schale darunter liegt. Markieren Sie gleichzeitig die Lokalisierung der Kolonie auf dem gedruckten Schalenplan (Abbildung 1B).
   HINWEIS: Es sollten ca. 20-30 Kolonien aus der Schale ausgewählt werden. Manchmal werden weniger Zellklone gewonnen, und in solchen Fällen sollten alle isoliert werden.

6. Vorbereitung der Glaszylinder

1. Vor der Isolierung der Klone werden die Glaszylinder (6,4 mm Durchmesser und 8 mm Höhe) (Abbildung 1C) in die erste Glas-Petrischale gelegt und autoklavieren Sie.
2. Autoklavieren Sie die zweite Petrischale aus Glas.
3. Tragen Sie eine dünne Schicht Silikonfett auf den Boden der zweiten Petrischale aus autoklaviertem Glas auf. Stellen Sie die Schale unter einen Laminar-Flow-Schrank und wenden Sie 30 Minuten lang UV-Licht an, um das Silikonfett zu sterilisieren.
   HINWEIS: Optional kann das Silikonfett autoklaviert werden.
4. Tauchen Sie die autoklavierten Zylinder in eine silikonfettbeschichtete Petrischale. Jetzt sind sie bereit, die Klone zu isolieren.
5. Reinigen Sie die Zylinder nach der Isolierung der Klone gemäß den Vorschriften, die für das Zellmaterial gelten, mit dem sie gehandhabt werden. Im Falle einer genetischen Veränderung ist Natriumhypochlorit zur Sterilisation zu verwenden.
6. Waschen Sie die Zylinder über Nacht mit Xylol, um sie von Silikonfett zu befreien.
7. Waschen Sie die Zylinder mit entionisiertem Wasser unter einer chemischen Haube, um die Xylollösung zu entfernen.
8. Legen Sie die Zylinder auf ein Papiertuch und lassen Sie sie trocknen.
9. Bewahren Sie die Zylinder in einer Petrischale aus Glas auf.
10. Bereiten Sie die Zylinder vor dem nächsten Gebrauch vor, beginnend mit Punkt 1 dieses Handbuchs.

7. Isolierung von Klonen

1. Bereiten Sie eine 24-Well-Platte mit 0,5 ml vorgewärmtem vollständigem Zellkulturmedium in jeder Vertiefung vor.
2. Waschen Sie die transfizierten Zellen, die auf einer 150-mm-Schale wachsen, dreimal vorsichtig mit 15 ml warmem, sterilem PBS. Aspirieren Sie das PBS vorsichtig und entsorgen Sie es.
3. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um Zylinder zu übertragen, die auf einer Seite Fett enthalten. Drücken Sie die Zylinder auf den Boden einer Kulturschale an den Stellen der markierten Klone, um isolierte Vertiefungen um die wachsenden Kolonien einzelligen Klonursprungs zu schaffen.
   HINWEIS: Der Zylinder sollte gut am Boden haften, um ein Austreten von Flüssigkeiten zu verhindern.
4. Geben Sie 50 μl Trypsinlösung in jeden Zylinder und inkubieren Sie einige Minuten lang. Achten Sie darauf, die Zellen nicht enzymatisch zu schädigen. Bearbeite die Völker nacheinander. Denken Sie daran, die Pipettenspitze für jeden Zylinder zu wechseln, um die Kolonien nicht mit anderen zu kontaminieren.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit hängt von der verwendeten Zelllinie ab und muss empirisch bestimmt werden. Die Trypsinlösung kann auf und ab pipettiert werden, um die Zellablösung zu erleichtern. Überwachen Sie die Zellablösung sorgfältig mit einem inversen Mikroskop. Stoppen Sie nach der Zellablösung die Trypsinaktivität, indem Sie jedem Zylinder 50 μl Zellkulturmedium hinzufügen.
5. Übertragen Sie sofort 100 μl der Zellsuspension in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte in das Medium.
   HINWEIS: Hier wurde das Klonwachstum mit einem selektiven Antibiotikum in einer Konzentration von 0,5 μg/ml fortgesetzt.
6. Überwachen Sie das Wachstum der Zellklone in der 24-Well-Platte, und wenn sie eine Konfluenz von 90 % erreichen, übertragen Sie sie auf eine Sechs-Well-Platte. Befolgen Sie die Anweisungen in Abschnitt 1 des Protokolls; Ändern Sie nur das Volumen von Trypsin (0,5 ml) und Stoppmedium (1,5 mL).
7. Überwachen Sie die Zellklone, die in einer Sechs-Well-Platte wachsen, und übertragen Sie sie, wenn sie die Konfluenz erreichen, in den T12.5-Zellkulturkolben.
8. Beobachten Sie die Zellklone im T12.5-Zellkulturkolben, und wenn sie die Konfluenz erreichen, subkulturieren Sie sie und zählen Sie sie mit einer geeigneten Methode, z. B. mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer. Frieren Sie die Hälfte der Zellen in dem Medium ein, das 70 % vollständiges Medium mit selektivem Antibiotikum, 20 % (v/v) FBS und 10 % (v/v) DMSO enthält. Der Rest der Zellen wird für die Immunfärbung auf Deckgläser (12 mm x 12 mm) und für die Immunfärbung in zwei Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte für die gDNA-Isolierung und die Lysatvorbereitung ausgesät.
   HINWEIS: Im Fall der A375-Zelllinie sind 45.000 Zellen pro Deckglas und 450.000 Zellen pro Well einer Sechs-Well-Platte zu säen.

8. Validierung der generierten Zellklone

1. Immunfärbung
   HINWEIS: Führen Sie eine Immunfärbung an den Zellen durch, um den Expressionsgrad des interessierenden Proteins (POI) zu bestimmen. Es ist wichtig, Wildtyp-Zellen oder Kontrollklone gleichzeitig zu färben, um die Expressionsniveaus des POI vergleichen zu können (Abbildung 2A).
   1. Aspirieren und verwerfen Sie das Zellkulturmedium.
   2. Waschen Sie die auf den Deckgläsern wachsenden Zellen dreimal mit PBS.
   3. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 0,5 ml 4%ige Formaldehydlösung in jede Vertiefung geben und sie 20 Minuten lang bei RT inkubieren.
      HINWEIS: Unterschiedliche Antikörper können unterschiedliche Fixierungsmethoden erfordern.
   4. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS.
   5. Um die Zellen zu permeabilisieren, inkubieren Sie die Deckgläser in 0,1% Triton X-100 in PBS für 5 min bei RT.
      HINWEIS: Unterschiedliche Antikörper können unterschiedliche Permeabilisierungsmethoden erfordern.
   6. Waschen Sie die Deckgläser zweimal mit PBS.
   7. Legen Sie die Deckgläser in eine Färbekammer⁹.
   8. Inkubieren Sie die Deckgläser in 1 % (w/v) BSA in 0,1 % (v/v) Triton X-100 in PBS-Lösung für 30 min bei RT, um eine unspezifische Bindung von Antikörpern zu vermeiden.
   9. Entfernen Sie die Lösung, indem Sie das Deckglas mit dem Rand mit einer Nadel und einer Pinzette auf ein Stück Lignin legen.
   10. Bereiten Sie eine Färbelösung vor, die aus Primärantikörpern in 1 % (w/v) BSA und 0,1 % (v/v) Triton X-100 in PBS besteht. Geben Sie 30 μl Lösung auf jedes Deckglas und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang bei 4 °C in einer feuchten Feuchtigkeitskammer.
       HINWEIS: In diesem Experiment wurde ein Maus-Anti-GSN-Antikörper in einer Verdünnung von 1:200 verwendet.
   11. Entfernen Sie die Lösung, indem Sie die Deckgläser mit einer Nadel und einer Pinzette mit dem Rand auf ein Stück Lignin legen. Legen Sie die Deckgläser in eine 24-Well-Platte.
   12. Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit PBS für 5 min bei RT.
   13. Bereiten Sie Sekundärantikörper und Farbstoffe in 1 % (w/v) BSA und 0,1 % (v/v) Triton X-100 in PBS-Lösung vor. Geben Sie 30 μl Lösung auf jedes Deckglas und inkubieren Sie sie 1 h lang bei RT im Dunkeln.
       HINWEIS: Verwenden Sie Esel-Anti-Maus-Fluoreszenz-markierte Sekundärantikörper 488 in einer Verdünnung von 1:200. Zum Nachweis von F-Aktin und Zellkernen verwendeten wir Phalloidin-Alexa Fluor 568 in einer Verdünnung von 1:200 und Hoechst 33342 in einer Verdünnung von 1:1000.
   14. Entfernen Sie die Lösung, indem Sie die Deckgläser mit einer Nadel und einer Pinzette mit dem Rand auf ein Stück Lignin legen. Legen Sie die Deckgläser in eine 24-Well-Platte.
   15. Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit PBS für 5 min bei RT im Dunkeln.
   16. Waschen Sie die Deckgläser einmal mit entionisiertem Wasser.
   17. Montieren Sie die Deckgläser mit Eindeckmedium auf Mikroskopglas.
   18. Visualisieren Sie die Zellfärbung mit einem konfokalen Mikroskop, um den Wert des POI zu bestimmen, der in abgeleiteten Klonen exprimiert wird (Abbildung 2A).
2. Western-Blot-Analyse
   HINWEIS: Um das Fehlen, das erhöhte oder das verringerte Niveau der POI-Expression in abgeleiteten Klonen zu bestätigen, führen Sie die Western-Blot-Analyse unter Standardbedingungen¹⁰ durch. Analysieren Sie die Wildtyp-Zellen oder kontrollieren Sie Klone gleichzeitig (Abbildungen 2B, C).
   1. Waschen Sie die Zellen, die in der Vertiefung einer Sechs-Well-Platte wachsen, dreimal mit PBS.
   2. Ernten Sie die Zellen mit einem Schaber in einen Puffer Ihrer Wahl und wirbeln Sie sie 20 s lang sanft ein. Die Probe wird in drei Zyklen eingefroren (bei -80 °C) und aufgetaut (bei 4 °C) behandelt.
      HINWEIS: Verwenden Sie entweder Zytoskelett-gebundenen Proteinextraktionspuffer [10 mM Tris-HCl pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1 mM Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure (EGTA), 1 mM NaF, 20 mM Na₄P₂O₇, 2 mM Na₃VO₄, 1 % (v/v) Triton X-100, 10 % (v/v) Glycerin, 0,1 % (w/v) SDS, 0,5 % Natriumdesoxycholat] oder Harnstoffpuffer [50 mM TRIS-HCl pH 7, 5 % (w/v) SDS, 8,6 % (w/v) Saccharose, 74 mM Harnstoff, 1 mM DTT], beide mit Zusatz von 1:100 Proteaseinhibitor-Cocktail, 1:100 Serinphosphatase-Inhibitor und 1:100 Tyrosinphosphatase-Inhibitor.
   3. Zentrifugieren Sie die Lysate bei 12.000 x g für 5 min bei 4 °C.
   4. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration in den Proben (z. B. durch BCA-Assay).
      HINWEIS: Der Assay hängt von der Verträglichkeit mit der Pufferzusammensetzung ab.
   5. Um eine Western-Blot-Analyse der Proben durchzuführen, laden Sie 30 μg Protein in jede Vertiefung auf Polyacrylamid-Gel (7%-15%).
   6. Führen Sie eine SDS-PAGE-Elektrophorese durch und übertragen Sie die Proteine auf eine Nitrozellulosemembran.
   7. Visualisieren Sie das Niveau der POI-Expression, indem Sie die Membran mit geeigneten Antikörpern anfärben (Abbildungen 2B, C).
      HINWEIS: Es wurden Maus-Anti-GSN-Antikörper mit einer Verdünnung von 1:2000 und Maus-Anti-GAPDH-Antikörper mit einer Verdünnung von 1:200 verwendet. Weitere Informationen finden Sie in unseren Papieren ^2,11. Die Belichtungszeit sollte lang genug sein, damit schwache Signale nicht übersehen werden (Abbildung 2C).
3. gDNA-Analyse
   HINWEIS: Nach der Schätzung des POI-Expressionsniveaus in abgeleiteten Klonen durch mikroskopische und Western-Blot-Techniken sollte die genomische DNA analysiert werden. Ein Vergleich der Länge des PCR-Reaktionsprodukts, das auf dem gDNA-Template der erhaltenen Klone erhalten wurde, gibt Aufschluss darüber, ob die Sequenz der GOI editiert wurde (Abbildung 2D).
   1. Waschen Sie die Zellen, die in der Vertiefung einer Sechs-Well-Platte wachsen, dreimal mit PBS.
   2. Ernten Sie die Zellen mit einem Schaber in 1 ml PBS.
   3. Die Zellen bei 5000 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
   4. Die Überstände aspirieren und verwerfen.
      HINWEIS: Pellets können mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden.
   5. Isolieren Sie gDNA aus Pellets abgeleiteter Klone mit einem kommerziell erhältlichen gDNA-Extraktionskit.
   6. Entwerfen Sie PCR-Primer durch Annealing von mindestens 300 bp vor und hinter dem gRNA-Ziel an der CRISPR/Cas9-Gen-Editing-Stelle.
      HINWEIS: Es wurden folgende Primer verwendet: Fwd: 5'gtgcagccaggatgagag3', Rev: 5'ccctgttactggtgcatc3'.
   7. Führen Sie PCR-Reaktionen mit dem DNA-Polymerase-Mastermix gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
      HINWEIS: Die Zusammensetzung des PCR-Reaktionsgemisches ist in Tabelle 1 dargestellt, und die Thermocycler-Einstellungen für die PCR-Reaktion sind in Tabelle 2 dargestellt.
   8. Analysieren Sie PCR-Produkte in 1 % oder 2 % (w/v) Agarosegel in Tris-Acetat-EDTA-Puffer (40 mM Tris pH 8,0, 20 mM Essigsäure, 1 mM EDTA).
   9. Vergleichen Sie die Amplikonlänge des PCR-Produkts von GSN KO-Klonen mit der Länge des PCR-Produkts von CTRL KO-Klonen (203 bp; Abbildung 2D).
4. gDNA-Sequenzierung
   1. Entwerfen Sie PCR-Primer durch Annealing an die Sequenzen vor und hinter den Sequenzen, die von den gRNAs erkannt werden, die von CRISPR/Cas9(D10A)-Plasmiden kodiert werden.
      HINWEIS: Die Grundierungen wie folgt auslegen: Fwd: 5'gatctcgagctcaagcttcgaattctgaacagtgcagacctttg3', Rev: 5'cgcggtaccgtcgactgcagaattcaattcaattcaccagaacaggactaggc3'.
   2. Führen Sie die PCR mit High-Fidelity-DNA-Polymerase (eine solche Analyse erfordert eine hohe Genauigkeit während der DNA-Amplifikation) und gDNA als Template durch.
      HINWEIS: Die Zusammensetzung des PCR-Reaktionsgemisches ist in Tabelle 3 dargestellt, und die Thermocycler-Einstellungen für die PCR-Reaktion sind in Tabelle 4 dargestellt.
   3. Linearisieren Sie das Plasmid mit einem Restriktionsenzym an mehreren Klonierungsstellen, indem Sie es 1 h lang bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches für den Restriktionsaufschluss ist in Tabelle 5 dargestellt. Dabei spielt es keine Rolle, welches Plasmid verwendet wird. pACGFP-C1 wurde mit dem EcoRI Enzym linearisiert.
   4. Schätzen Sie die Konzentration von Inserts und schneiden Sie das Plasmid durch Agarose-Gelelektrophorese.
   5. Bereiten Sie DNA-Assemblierungsreaktionen vor.
      HINWEIS: Es kann eine herkömmliche Klonmethode oder eine andere Methode verwendet werden.
   6. Transformieren Sie kompetente Bakterien (z. B. durch ein Hitzeschockverfahren)¹².
   7. Isolierung von Plasmiden (z. B. aus sechs Bakterienkolonien pro Konstrukt gemäß den Anweisungen des Herstellers oder dem zitierten Protokoll)¹³.
   8. Prüfen Sie, ob das Insert erfolgreich in das Plasmid kloniert wurde und ob seine Länge durch Restriktionsverdau und DNA-Elektrophorese angemessen ist.
      HINWEIS: Wenn die ausgewählten Kolonien kein Plasmid mit einem Insert enthalten, sollten die Plasmide aus nachfolgenden Bakterienkolonien isoliert werden.
   9. Bestätigen Sie die Geneditierung durch Plasmidsequenzierung (Abbildung 3).
      HINWEIS: Man sollte mindestens zwei verschiedene Ergebnisse der DNA-Sequenzierung für jeden abgeleiteten Zellklon erhalten, da zwei Allele von Genen vorhanden sind. Für multiploide Zelllinien (größer als 2 n) ist es notwendig, mehr Plasmide zu sequenzieren, um die Sequenz aller erhaltenen Genkopien in der Zelle zu erhalten. Isolieren Sie so viele Kolonien wie nötig, bis Plasmide mit den klonierten Sequenzen aller Kopien des Gens isoliert sind. Man kann ein kommerziell erhältliches Kit verwenden, um die Anzahl der Loci für das untersuchte Gen zu schätzen.
   10. Vergleichen Sie die gDNA-Sequenzen, die für die GSN KO- und CTRL KO-Klone erhalten wurden, mit einem Programm zur Ausrichtung mehrerer Sequenzen (Abbildung 3).

Reagenzien	Volumen
DNA-Polymerase-Mastermix	7,5 μl
Vorwärts-Grundierung (10 μM)	ca. 1,5 μl
Umgekehrter Primer (10 μM)	ca. 1,5 μl
Steriles Wasser	3,5 μl
gDNA	1 μl mit 10 ng gDNA

Tabelle 1. Zusammensetzung des PCR-Reaktionsgemisches.

Schritte	Temperatur [°C]	Zeit [Minuten: Sekunden]
1	95	04:00
2	95	00:30
3	57	00:30
4	72	00:45
5	Gehe zu 2, 35x	X
6	72	10:00
7	8	∞

Tabelle 2. Thermocycler-Einstellungen für die PCR-Reaktion.

Reagenzien	Volumen
5 x High-Fidelity-DNA-Polymerase-Puffer	4 μl
dNTPs (10 mM)	0,4 μl
Vorwärts-Grundierung (10 μM)	1 μl
Umgekehrter Primer (10 μM)	1 μl
Steriles Wasser	12,4 μl
gDNA	1 μl mit 10 ng gDNA
High-Fidelity-DNA-Polymerase	0,2 μl

Tabelle 3. Zusammensetzung des PCR-Reaktionsgemisches.

Schritte	Temperatur [°C]	Zeit [Minuten: Sekunden]
1	98	00:30
2	98	00:30
3	61	00:30
4	72	01:00
5	Gehen Sie 35 Mal zu Schritt 2	X
6	72	10:00
7	8	∞

Tabelle 4. Thermocycler-Einstellungen für die PCR-Reaktion.

Reagenzien	Menge
10 x Puffer	3 μl
Restriktionsenzym	1 μl
Steriles Wasser	20,7 μl
Plasmid	5,3 μl mit 5 μg DNA

Tabelle 5. Zusammensetzung des Restriktionsaufschluss-Reaktionsgemisches.

9. Beurteilen Sie die phänotypische Heterogenität der Zelllinie

1. Führen Sie eine Immunfärbung der Zellen durch, um den Grad der POI-Expression zu bestimmen.
2. Nehmen Sie Fotos ohne Vergrößerung mit einer 60-fachen Ölimmersionslinse in einem konfokalen Mikroskop auf.
3. Um das Verteilungsverhältnis von Zellen mit unterschiedlichen Niveaus zu bestimmen, verwenden Sie das Werkzeug "Über-/Unterbelichtung", das normalerweise in den meisten mikroskopischen Bildanalyseprogrammen verfügbar ist. Behandeln Sie Zellen, die unterbelichtete Bereiche aufweisen, so, als würden sie den POI auf niedrigem Niveau produzieren. Klassifizieren Sie überbelichtete Zellen als Zellen mit einem hohen Maß an POI-Expression und die restlichen Zellen als Zellen mit POI auf einem mittleren Niveau.

Ergebnisse

Anhand des vorgestellten Protokolls können wir die Isolierung von stabil transfizierten Melanomzellklonen mit der Glaszylindermethode detailliert demonstrieren (Abbildung 1A). Unsere Studien beziehen sich auf die Melanomzellbiologie, und das gebräuchlichste Forschungsmodell, das wir verwenden, ist die adhärente und hochinvasive A375-Melanomlinie. Da unsere Forschung gezeigt hat, dass Melanomzellen im Vergleich zu anderen Krebsarten Gelsolin (GSN) auf eine...

Diskussion

Wir haben eine detaillierte Beschreibung der Isolierung von stabil transfizierten Melanomzellklonen mit Glaszylindern bereitgestellt. Es ist wichtig, Kontrollklone zu erhalten, wenn Klone mit veränderter Genexpression abgeleitet werden, da die Ergebnisse für die gezielten Modifikationskone immer mit den Ergebnissen für Kontrollen verglichen werden sollten. Auf diese Weise können wir überprüfen, ob die Transfektion selbst oder die Kultur mit einem selektiven Antibiotikum die Ergebni...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml centrifuge tube	GoogleLab Scientific	G66010522
150 mm cell culturedish with 20 mm grid	Falcon	353025
24-wells plate	VWR International	10062-896
35 mm culture dish	Eppendorf	EP0030700112
6-well plate	Eppendorf	EP0030700113
96-well plate	VWR International	10062-900
Acetic acid, 80% solution	Chempur	115687330
Agarose	Prona-Abo	BLE500
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240062
anti-GAPDH antibodies	Santa Cruz Biotechnology Inc.,	sc-47724
anti-GSN antibodies  - clone C20	Santa Cruz Biotechnology Inc.,	sc-6405
anti-GSN antibodies  - clone GS-2C4	Sigma-Aldrich	G44896
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3294
Color Taq PCR Master Mix (2x)	EurX	E2525
Control Double Nickase Plasmid	Santa Cruz Biotechnology Inc.,	sc-437281
Coverslips	bionovo	16283
Dako Mounting medium	Clontech	S3023
DMSO -  Dimethyl sulfoxide	applichem	A3672,0250
DNA Purification Kit	EurX	3555-02
donkey anti- mouse-Alexa Fluor 488	Invitrogen	# A-21202
DTT - 1,4-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	10197777001
EcoRI	Thermo Fisher Scientific	FD0274
EDTA- ethylenediaminetetraacetic acid	Poch (Pol-Aura)	593280117
EGTA - ethylene glycol-bis(2-aminoethyl ether)- N,N,N’,N’-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E0396
FBS - Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Gelsolin CRISPR Plasmids	Santa Cruz Biotechnology Inc.,	sc-401005-NIC
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Glycerol	Sigma-Aldrich	L-4909
high glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium with reduced concentration (1.5 g/l) of NaHCO3	Polish Academy of Science,Wrocaw, Poland	11-500
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
L-Glutamine	Gibco	25030-024
Lignin	Bionovo	B-0521
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000-008
Na3VO4	Sigma-Aldrich	S6508
Na4P2O7	Sigma-Aldrich	P8010
NaF	Sigma-Aldrich	450022
NEBuilder Assembly Tool	http://nebuilder.neb.com/#!/
pACGFP-C1	Clontech
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26616
Perfect 100 bp DNA ladder	EurX	E3134
phalloidin-Alexa Fluor 568	Invitrogen	A12380
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma-Aldrich	P5726
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3	Sigma-Aldrich	P0044
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific	F530S
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
polyethylenimine (PEI)	Sigma-Aldrich	408727
protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340
puromycin	InviviGen	ant-pr
SDS - sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L4509
silicone	CX80 Polska
Sodium chloride - NaCl	Chempur	7647-14-5
sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750259
sucrose	Poch (Pol-Aura)	PA-06-772090110
the glass cylinders	Sigma-Aldrich	C3983-50EA
Tissue Culture Flask 25mL	VWR International	10062-868
Tissue-culture 75 cm2 flask	VWR	10062-872
Trisma base	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
trypsin	Polish Academy of Science,Wrocaw, Poland	20-500
urea	Sigma-Aldrich	8656
xylene solution	Chempur	115208603