Biomolekulare Bildgebung der zellulären Aufnahme von Nanopartikeln mittels multimodaler nichtlinearer optischer Mikroskopie

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt die Integration eines spektralfokussierenden Moduls und eines Dual-Output-Pulslasers vor, der eine schnelle hyperspektrale Bildgebung von Goldnanopartikeln und Krebszellen ermöglicht. Diese Arbeit zielt darauf ab, die Details multimodaler nichtlinearer optischer Techniken auf einem Standard-Laserscanning-Mikroskop zu demonstrieren.

Zusammenfassung

Die Untersuchung von Goldnanopartikeln (AuNPs) in lebenden Systemen ist unerlässlich, um die Wechselwirkung zwischen AuNPs und biologischem Gewebe aufzudecken. Darüber hinaus kann es durch die Integration nichtlinearer optischer Signale wie stimulierte Raman-Streuung (SRS), Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenz (TPEF) und transiente Absorption (TA) in eine Bildgebungsplattform verwendet werden, um biomolekularen Kontrast von Zellstrukturen und AuNPs multimodal aufzudecken. Dieser Artikel stellt eine multimodale nichtlineare optische Mikroskopie vor und wendet sie an, um chemisch spezifische Bildgebung von AuNPs in Krebszellen durchzuführen. Diese Bildgebungsplattform bietet einen neuartigen Ansatz zur Entwicklung effizienterer funktionalisierter AuNPs und zur Bestimmung, ob sie sich innerhalb von Gefäßen befinden, die den Tumor umgeben, perizellulär oder zellulär.

Einleitung

Goldnanopartikel (AuNPs) haben großes Potenzial als biokompatible Bildgebungssonden gezeigt, beispielsweise als effektive oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS)-Substrate in verschiedenen biomedizinischen Anwendungen. Zu den wichtigsten Anwendungen gehören Bereiche wie Biosensorik, Bioimaging, oberflächenverstärkte Spektroskopien und photothermische Therapie zur Krebsbehandlung¹. Darüber hinaus ist die Untersuchung von AuNPs in lebenden Systemen entscheidend für die Bewertung und das Verständnis der Interaktion zwischen AuNPs und biologischen Systemen. Es gibt verschiedene analytische Techniken, darunter die Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR)², die Laserablations-Massenspektrometrie (LA-ICP-MS⁾³ und die Magnetresonanztomographie (MRT)⁴, die erfolgreich eingesetzt wurden, um die Verteilung von AuNPs in Geweben zu untersuchen. Dennoch weisen diese Methoden mehrere Nachteile auf, wie z. B. Zeitaufwand und komplexe Probenvorbereitung³, lange Erfassungszeiten oder fehlende räumliche Auflösung im Submikrometerbereich ^2,4.

Im Vergleich zu herkömmlichen bildgebenden Verfahren bietet die nichtlineare optische Mikroskopie mehrere Vorteile für die Untersuchung lebender Zellen und AuNPs: Die nichtlineare optische Mikroskopie erreicht eine tiefere Abbildungstiefe und bietet intrinsische optische 3D-Schnittfähigkeit durch den Einsatz von Nah-IR-Ultrakurzpulslasern. Mit der signifikanten Verbesserung der Bildgebungsgeschwindigkeit und Detektionsempfindlichkeit wurde gezeigt, dass die Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenz (TPEF)^5,6,7 und die zweite harmonische Generation (SHG)^{8,9,10-Mikroskopie} die nicht-invasive Bildgebung endogener Biomoleküle in lebenden Zellen und Geweben weiter verbessern. Darüber hinaus ist es unter Verwendung neuartiger nichtlinearer optischer Pump-Probe-Techniken wie der transienten Absorption (TA)11,12,13,14 und der stimulierten Raman-Streuung (SRS)^15,16,17,18 möglich^, markierungsfreien biochemischen Kontrast von Zellstrukturen und AuNPs abzuleiten. Die Visualisierung von AuNPs ohne die Verwendung von extrinsischen Markierungen ist von großer Bedeutung, da chemische Störungen der Nanopartikel ihre physikalischen Eigenschaften und damit ihre Aufnahme in Zellen verändern.

Dieses Protokoll stellt die Implementierung eines SF-TRU-Moduls (Spectral Focusing Timing and Recombination Unit) für einen Zweiwellenlängen-Pulslaser dar, das eine schnelle multimodale Bildgebung von AuNPs und Krebszellen ermöglicht. Diese Arbeit zielt darauf ab, die Details der integrierten TPEF-, TA- und SRS-Techniken auf einem Laserscanning-Mikroskop zu demonstrieren.

Protokoll

1. Einschalten des Lasersystems

1. Schalten Sie das Interlock-System ein und wählen Sie den Armlaser, bevor Sie das System starten.
2. Schalten Sie den PC mit der Software ein, um den Dual-Output-Femtosekundenlaser zu steuern.
3. Laden Sie die Software für den Femtosekundenlaser mit zwei Ausgängen. Diese Software ermöglicht das Ein- und Ausschalten des Lasers und steuert direkt die Wellenlänge des Pumpstrahls.
4. Schalten Sie die Laseremission ein, indem Sie das Power-Symbol für eine Zählung von 3 gedrückt halten.
5. Warten Sie, bis sich der Laser erwärmt hat und das laserbereite Licht in der Software grün leuchtet.
6. Die Wellenlänge des Pumpstrahls wird direkt über die Software gesteuert; Dies kann von 680-1.300 nm reichen. Für die zelluläre Bildgebung im C-H-Raman-Schwingungsbereich wählen Sie 802 nm.
7. Öffnen Sie die Verschlüsse des abstimmbaren Pumpstrahls und des 1.045 nm Stokes-Strahls, indem Sie die Blendenbilder 3 s lang gedrückt halten.
   ACHTUNG: Laserschutzanleitung Der Dual-Output-Femtosekundenlaser ist ein Infrarot-Pulslaser der Klasse IV und kann das Sehvermögen dauerhaft schädigen. Daher müssen bei der Durchführung dieses Verfahrens alle lokalen Lasersicherheitsregeln befolgt werden: (i) Nur autorisierte Benutzer, die eine Laserschutzschulung erhalten haben, können das Verfahren durchführen. (ii) Der Zugang zum Labor erfolgt über einen Kartenzugriff mit einer Verriegelung an der Raumtür. (iii) Für den größten Teil des Betriebs sind die Laserstrahlen vollständig geschlossen. (iv) Wenn der Laserstrahl exponiert wird, muss eine Laserschutzbrille getragen werden (verwenden Sie die LG9-Laserschutzbrille, die OD 7+ sowohl die Pump- als auch die Stokes-Strahlen blockiert).

2. Einschalten der spektralen Fokussierzeit- und Rekombinationseinheit (SF-TRU)

1. Laden Sie die ATM-Software auf denselben PC mit der Lasersoftware, die die Verzögerungsstufen und Laserdämpfungsglieder in der SF-TRU-Einheit steuert.
   HINWEIS: Diese Einheit ist dafür verantwortlich, sicherzustellen, dass die Pumpe und die Stokes-Strahlen räumlich überlappt sind, die Dispersion in den Pumpen- und Stokes-Strahlen zu steuern und die Zeitverzögerung zwischen der Pumpe und den Stokes-Strahlen zu steuern. Die Polarisation von Pump- und Stokes-Strahlen ist vertikal. Beachten Sie, dass jeder Strahl mit einer Halbwellenplatte ausgestattet ist, um die Polarisationen vor dem Verlassen des SF-TRU unabhängig voneinander zu steuern.
2. Stellen Sie sicher, dass sowohl die Pumpe als auch die Stokes-Laser auf <10 % (Pumpe) bzw. <15 % (Stokes-Strahlen) gedämpft sind. Wenn die Strahlen nicht gedämpft werden, kann die Laserleistung das System beschädigen und biologische Proben verbrennen.
3. Stellen Sie für die zelluläre Bildgebung die optimalen Lasereinstellungen auf 6% (Pumpe) und 10% (Stokes) ein, was 12 mW und 30 mW an der Probe entspricht.
4. Die SF-TRU verfügt über zwei Einstellungen: Femtosekundenmodus (fs) und Pikosekundenmodus (ps).
5. Drücken Sie im fs-Modus die Knöpfe auf beiden Seiten der Box ein (dadurch werden die Dispersionsgitter aus dem Strahlgang entfernt).
6. Ziehen Sie im ps-Modus die Knöpfe auf beiden Seiten des Gehäuses heraus (dadurch befinden sich die Dispersionsgitter im Strahlengang).
7. Wählen Sie für die hyperspektrale Bildgebung den ps-Modus aus.
8. Stellen Sie sicher, dass sich die Verzögerungsstufe in der richtigen Position befindet, damit die Pumpe und die Stokes-Strahlen für die C-H-Bildgebung auf diesem System zeitlich überlappt werden.
9. Stellen Sie sicher, dass die Dispergiereinstellungen der Pumpe und des Stokes-Strahls korrekt sind. bei einer 802-nm-Pumpe sind dies 5 mm für den Pumpenstrahl und 30 mm für den Stokes-Strahl.

3. Modulieren des Stokes-Strahls für SRS-Bildgebung

1. Modulieren Sie für die SRS-Erkennung die Intensität des Stokes-Strahls.
2. Schalten Sie den Signalgenerator für die Strahlmodulation ein.
3. Rufen Sie vorherige Einstellungen ab, die wie folgt lauten:
   AUSGANG 1: Rechteckwelle: Frequenz = 19,5 MHz, Amplitude = 1,4 V.
   AUSGANG 2: Rechteckwelle: Frequenz = 19,5 MHz, Amplitude = 300 mV.
4. Schalten Sie die Ausgänge 1 und 2 ein.
5. Verbinden Sie Output 1 über ein BNC-Kabel mit einem Verstärker für das EOM in der SF-TRU-Box.
6. Verbinden Sie Output 2 über ein BNC-Kabel mit dem Lock-in-Verstärker, der für die SRS-Erkennung verwendet wird.
7. Schalten Sie die Stromversorgung des Verstärkers am Portal ein.

4. Einschalten des Lock-in-Verstärkers

1. Verwenden Sie für die SRS-Bildgebung das SRS-Detektionsmodul, das aus einer großflächigen Fotodiode und einem speziell entwickelten Lock-in-Verstärker besteht.
2. Schalten Sie die Stromversorgung des Lock-in-Verstärkers am Portal ein.
3. Laden Sie die Software für den Lock-in-Verstärker "SRS detection Module" auf den PC.
4. Wählen Sie in der Software folgende Einstellungen: Phase = 0°, Offset = -80 mW, Verstärkung = 58 dB.
5. Wählen Sie die Zeitkonstante für die Integration des Lock-in-Verstärkers in der Software: Für die Zellbildgebung liefert die Zeitkonstante von 2 μs eine gute Bildqualität.

5. Bedienung am Laserscanning-Mikroskop

1. Schalten Sie die Stecker aller Geräte außer der Fernbedienungsbox ein. Warten Sie, bis der Standby-Modus auf der Steuerbox oben auf dem Portal leuchtet.
2. Schalten Sie die Fernbedienungsbox auf dem Portal ein und schalten Sie die Rückseite der Box ein. Warten Sie, bis die Fernbedienungsleuchte blau leuchtet (auf der Steuerbox), und drücken Sie Vorgang starten.
3. Schalten Sie den PC des Laser-Scanning-Mikroskops ein.
4. Führen Sie die konfokale Mikroskopsoftware aus.
5. Überprüfen Sie den Lichtweg des Mikroskops über die Computersoftware.
   HINWEIS: Es wurden einige Änderungen am Mikroskop vorgenommen, um es für die SRS-Bildgebung geeignet zu machen: (i) Im Strahlengang wurde ein 775 nm kurzer Durchgang zum Filterrad hinzugefügt, wo die Laserstrahlen in die Scaneinheit eintreten, dies kann auf der Registerkarte Lichtpfad in der Computersoftware ausgewählt werden. (ii) Anstatt die eingebauten PMTs des konfokalen Mikroskops für die Detektion zu verwenden, wurde dem Durchlichtpfad ein maßgeschneiderter Detektor hinzugefügt, der sowohl SRS- als auch CARS-Detektion ermöglicht. (iii) Die Ausgänge dieser Melder sind mit der Analogbox auf dem Portal verbunden. Das CARS-Signal vom PMT ist über ein BNC-Kabel mit CD1 verbunden und das SRS-Signal vom Lock-in-Verstärker wird über ein BNC-Kabel mit CD2 verbunden.
6. Steuern Sie den Fokus über den Touchscreen oder die Fernbedienungsknöpfe oder die Computersoftware.
7. Wählen Sie die gewünschten Bildeinstellungen in der Software; Dazu gehören der Zoom, die Bildgröße in Pixel und die Pixelverweilzeit.
8. Stellen Sie sicher, dass die Abbildungsgeschwindigkeit (Pixelverweilzeit) größer ist als die in der Lock-in-Verstärkersoftware eingestellte Integrationszeit.
   HINWEIS: Für die Bildgebung wurde ein NA 1.2 Wasserimmersionsobjektiv verwendet.

6. Montage einer Probe in den Mikroskoptisch

1. Bereiten Sie die Zellproben wie folgt für die Bildgebung vor.
   1. Kultur 4T1 Maus-Mammakarzinomzellen in RPMI-1640, ergänzt mit 10% Fetal Bovine Serum (FBS). Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage und passieren Sie die Zellen bei 70% -80% Konfluenz.
      ANMERKUNG: Die Passagen 8–10 wurden im Verlauf der hier beschriebenen Experimente verwendet.
   2. Für bildgebende Experimente 1 x 10 5 Zellen auf quadratischen Deckgläsern für 24 h bei 37 °C,⁵ %_CO2 inkubieren. Dann waschen Sie die Zellen mit vorgewärmter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und inkubieren mit Goldnanopartikeln (1:100 Verdünnung im Zellkulturmedium, Stammkonzentration: 2,3 x 10 10 Partikel/ml, Durchmesser:⁶⁰ nm) für 4 h.
   3. Vor der Bildgebung waschen Sie die Zellen mit eiskaltem PBS und fixieren Sie sie mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 15 min bei Raumtemperatur (RT). Waschen Sie die Zellen mit PBS 3x und montieren Sie sie dann zwischen zwei Deckgläsern für die Bildgebung.
2. Legen Sie einen Tropfen destillierten Wassers auf das Wassertauchobjektiv, das die Laserstrahlen auf die Probe zwischen dem Objektiv und der Probe fokussiert. Legen Sie dann die Probe auf den Mikroskoptisch.
3. Ein Kondensator mit NA 1.4 sammelt das vorwärts verbreitete Licht. Tragen Sie einen Wassertropfen zwischen dem Kondensator und der Probe für die Bildgebung auf. Stellen Sie die Höhe des Kondensators auf ca. 1 mm über der Probe ein, um die maximale Lichtmenge zu sammeln.
4. Der SRS-Detektor befindet sich auf einer beweglichen Halterung, die es ermöglicht, ihn aus dem optischen Sammelpfad hinein- und herauszuschieben. Um mit weißem Licht auf die Probe zu fokussieren, bewegen Sie den SRS-Detektor aus dem Strahlengang.
5. Setzen Sie den Detektor wieder in den Strahlengang ein, bereit für die SRS-Bildgebung.

7. Ändern der Raman-Verschiebung und Sammeln eines hyperspektralen Datenstapels

HINWEIS: Die Raman-Verschiebung, mit der die Bildgebung stattfindet, hängt von der Verzögerungsstufenposition in der SF-TRU-Box und der Wellenlänge des Pumpstrahls des Lasersystems ab.

1. Bei großen Änderungen der Raman-Verschiebung ändern Sie die Laserwellenlänge. Wählen Sie beispielsweise für die Abbildung von CH-Schwingungen zwischen 2.800 und 3.100 cm-1 802 nm, während Sie für die Abbildung von etwa 1.600 ^cm-1 für den Amid-I-Peak den Pumpstrahl bei 898 nm auswählen. Stellen Sie dies über die Software ein.
2. Um kleine Anpassungen in der Raman-Schicht zu erreichen, scannen Sie die Verzögerungsstufe in der SF-TRU-Einheit.
3. Die SF-TRU gibt Verzögerungsstufenpositionen in Millimetern (mm) an. Um die Verzögerungstischposition von mm in cm-1 umzuwandeln, führen Sie den hyperspektralen Kalibrierungsscan mit einer Probe von Polystyrolperlen durch und vergleichen Sie die im Kalibrierungsscan gefundenen Spitzenpositionen mit denen, die bei einem spontanen ^Raman-Setup aufgenommen wurden. Dies liefert eine lineare Gleichung, die die Verzögerungsstufenposition in mm in Raman-Verschiebung in ^cm-1 umwandelt.
4. Um einen hyperspektralen Scan zu erzeugen, nehmen Sie eine Zeitreihe von Bildern an verschiedenen Positionen der Verzögerungsstufe auf.
5. Um die Bildaufnahme und die Bewegung der Verzögerungsstufe zu synchronisieren, verwenden Sie die analoge Einheit zum Senden und Empfangen von TTL-Signalen zum und vom SF-TRU-System.
   HINWEIS: Um dies zu tun, hat die analoge Box die folgenden Anschlüsse: (i) TRIG OUT VD1 – diese wird über einen BNC mit der SF-TRU verbunden und sendet ein TTL-Signal, um die Verzögerungsstufe anzuweisen, sich +1 zu bewegen. (ii) TRIG In 1 – hier wird ein Signal über BNC empfangen, wenn die Verzögerungsstufe ihre Bewegung beendet hat, und dies wird verwendet, um das nächste Bild in der Zeitreihe auszulösen.
6. Wählen Sie für den hyperspektralen Datensatz die folgenden Einstellungen in der konfokalen Mikroskopsoftware:
   1. Wählen Sie auf der Registerkarte Trigger die Option Start by TTL trigger (ON) und Trigger (jeder Frame) aus.
   2. Legen Sie auf der Registerkarte Serie die Zeitreihe EIN und die z-Serie AUS fest.
   3. Stellen Sie die Anzahl der Frames in der Zeitreihe so ein, dass sie mit der Anzahl der Schritte in der ATM-Software übereinstimmt (hier werden 101 Schritte verwendet).
7. Wechseln Sie in der ATM-Software zur Registerkarte Ausführen .
   1. Stellen Sie die Verzögerungsstufenpositionen in Millimetern für den Start und Stopp des Hyperspektralscans ein. Verwenden Sie für den CH-Bereich mit hoher Wellenzahl die Startposition = 90,25 mm und die Stoppposition = 92,25 mm.
   2. Stellen Sie sicher, dass die Anzahl der Schritte mit der Anzahl der Bilder in der konfokalen Mikroskopsoftware übereinstimmt.
8. Nachdem Sie die korrekten Einstellungen überprüft haben, starten Sie zuerst den Hyperspektralstapel in der konfokalen Mikroskopsoftware. Gehen Sie zu Erwerben und klicken Sie auf Scan starten. Klicken Sie dann in der ATM-Software auf Start. Dies initiiert die Erfassung einer Reihe von Bildern mit inkrementellen Erhöhungen der Verzögerungsstufenposition zwischen den ausgewählten Start- und Stopppositionen.
9. Exportieren Sie die hyperspektralen Bildserien als Multiframe-.tif Datei und verwenden Sie ein geeignetes Softwarepaket zur Durchführung der Kalibrierung.
10. Sobald die Kalibrierung abgeschlossen ist, verwenden Sie die lineare Kalibrierungsgleichung, um die Verzögerungsstufenposition in die Raman-Verschiebungen umzuwandeln.
11. Um zwischen der Bildgebung im CH-Schwingungsbereich (2.800–3.100 cm-1) und dem Amid-I-Schwingungsbereich 1.500–1.700 ^cm-1 zu wechseln, gehen Sie wie folgt vor.
    1. Ändern Sie die Pumpwellenlänge in der Lasersoftware von 802 nm auf 898 nm.
    2. Ändern Sie die Stokes-Dispersionseinstellung in der ATM-Software von 30 mm auf 5 mm.
    3. Nehmen Sie eine kleine Einstellung am Spiegel im Pumpstrahl-Dispersionsweg in der SF-TRU-Box vor. Dies geschieht durch Einstellen des unteren Knopfes an der Spiegelhalterung, wodurch sich der Spiegelwinkel inkrementell ändert.
    4. Wenn Sie einen Hyperspektralscan über dem Amid-I-Bereich durchführen, stellen Sie die Start- und Stopppositionen in der ATM-Software auf 89 bzw. 91 mm ein.
       ACHTUNG: Für diesen Schritt muss eine Laserschutzbrille getragen werden, da der Laserstrahl exponiert wird.

Ergebnisse

Das SF-TRU-Modul (Spectral Focusing Timing and Recombination Unit) wird zwischen dem Femtosekundenlaser mit zwei Ausgängen und dem modifizierten Laserscanning-Mikroskop eingeführt. Das in dieser Studie verwendete abstimmbare ultraschnelle Lasersystem verfügt über zwei Ausgangsanschlüsse, die einen Strahl mit einer festen Wellenlänge von 1.045 nm und den anderen Strahl im Bereich von 680 bis 1.300 nm liefern. Ein detailliertes Schema des SF-TRU-Moduls und der multimodalen Bildgebungsplattform ist in

Diskussion

Diese Studie hat die Kombination aus SF-TRU-Modul und ultraschnellem Dual-Output-Lasersystem vorgestellt und ihre Anwendungen für die multimodale Mikrospektroskopie demonstriert. Mit ihrer Fähigkeit, die Aufnahme von Goldnanopartikeln (AuNPs) durch Krebszellen zu untersuchen, kann die multimodale Bildgebungsplattform die zellulären Reaktionen auf hyperthermische Krebsbehandlungen visualisieren, wenn Laserstrahlen von AuNPs absorbiert werden.

Darüber hinaus werden schnelle chemisch spezifis...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
APE SRS Detection Unit	APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH)	APE Lock-in Module	Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations
Confocal Scanning Unit	Olympus	FV 3000	Confocal scanning unit used for imaging
CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm	Invitrogen	C37483	Polystyrene microspheres
Coverslips	Thorlabs	CG15CH2	22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells
FBS	Gibco	10500-064	Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated)
Flouview	Olympus	FV31S-SW	Laser scanning microscope control software
Function Generator	BX precision	40543	Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam
Gold Nanoparticles	Nanopartz	A11-60	Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter
Input Output Interface	Olympus	FV30 ANALOG	This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit.
InSight X3	Newport	Spectra-Physics	Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz.
Microscope Frame	Olympus	IX83	Inverted microscope
Mouse 4T1 cells	ATCC	CRL-2539	Mouse breast cancer cells
NA 1.2 Water Immersion Objective	Olympus	UPLSAPO60XW/IR	The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used.
NA 1.4 Condenser	Nikon	CSC1003	Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used.
PMT	Hamamatsu	R3896	PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy
PMT Connector	Hamamatsu	C13654-01-Y002	Connector for PMT
Power Supply	RS	RSPD-3303 C	Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT
RPMI-1640	Gibco	A10491-01	Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells.
SF-TRU	Newport Spectra Physics	SF-TRU	System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS