Quantifizierung zirkulärer RNAs mittels digitaler Tröpfchen-PCR

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierte Methode der digitalen Tröpfchen-PCR (dd-PCR) zur präzisen Quantifizierung von zirkulären RNA (circRNA)-Spiegeln in Zellen unter Verwendung divergenter Primer.

Zusammenfassung

Die digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion (dd-PCR) ist eine der empfindlichsten Quantifizierungsmethoden; Es fraktioniert die Reaktion in fast 20.000 Wasser-in-Öl-Tröpfchen, und die PCR tritt in den einzelnen Tröpfchen auf. Die dd-PCR hat mehrere Vorteile gegenüber der herkömmlichen real-time qPCR, einschließlich einer erhöhten Genauigkeit bei der Erkennung von Zielen mit geringer Abundanz, dem Weglassen von Referenzgenen für die Quantifizierung, der Eliminierung technischer Replikate für Proben und der hohen Widerstandsfähigkeit gegenüber Inhibitoren in den Proben. In jüngster Zeit hat sich die dd-PCR zu einer der beliebtesten Methoden zur genauen Quantifizierung von Ziel-DNA oder RNA für die Genexpressionsanalyse und -diagnostik entwickelt. Zirkuläre RNAs (circRNAs) sind eine große Familie von kürzlich entdeckten kovalent geschlossenen RNA-Molekülen ohne 5' und 3' Enden. Es wurde gezeigt, dass sie die Genexpression regulieren, indem sie als Schwämme für RNA-bindende Proteine und microRNAs fungieren. Darüber hinaus werden circRNAs in Körperflüssigkeiten sezerniert, und ihre Resistenz gegen Exonukleasen macht sie zu Biomarkern für die Krankheitsdiagnose. Dieser Artikel soll zeigen, wie divergentes Primer-Design, RNA-Extraktion, cDNA-Synthese und dd-PCR-Analyse durchgeführt werden können, um spezifische zirkuläre RNA (circRNA) -Spiegel in Zellen genau zu quantifizieren. Abschließend demonstrieren wir die genaue Quantifizierung von circRNAs mittels dd-PCR.

Einleitung

Jüngste Fortschritte bei RNA-Sequenzierungstechnologien und neuartigen Computeralgorithmen haben ein neues Mitglied der wachsenden Familie nicht-kodierender RNAs entdeckt, die als zirkuläre RNA (circRNA)¹ bezeichnet wird. Wie der Name schon sagt, sind circRNAs eine Familie von einzelsträngigen RNA-Molekülen ohne freie Enden. Sie werden durch nicht-kanonisches Kopf-zu-Schwanz-Spleißen gebildet, das als Back-Splicing bezeichnet wird, bei dem sich die vorgeschaltete Spleißakzeptorstelle kovalent mit der nachgeschalteten Spleißspenderstelle verbindet, um einen stabilen RNA-Kreis ^1,2 zu bilden. Dieser Prozess könnte durch mehrere Faktoren vermittelt werden, einschließlich invertierter Alu-Repetitionselemente, die im Upstream und Downstream von zirkularisierten Exons vorhanden sind, oder kann durch einige Spleißfaktoren oder RNA-bindende Proteine (RBPs) vermittelt ^werden2,3. Zirkuläre RNAs, die ausschließlich aus der exonischen oder intronischen Sequenz erzeugt werden, werden als exonische circRNA und zirkuläre intronische RNAs oder ci-RNAs klassifiziert, während einige exonische circRNAs das Intron behalten und als Exon-Intron-circRNAs (EIcircRNAs) bezeichnet ^werden3,4. Die Funktionen von circRNAs sind vielfältig, einschließlich der Schwammbildung von miRNA und/oder RBP, der Regulierung der Transkription und der Regulierung der zellulären Funktion durch Übersetzung in Peptide 3,5,6,7. Mehrere Berichte haben die Bedeutung von circRNAs bei verschiedenen Krankheiten und physiologischen Prozessen hervorgehoben⁸. Darüber hinaus machen gewebespezifische Expressionsmuster und Resistenz gegen Exonuklease-Verdauung es zu einem funktionellen Biomarker für die Krankheitsdiagnostik und kann auch als geeignetes therapeutisches Ziel verwendet werden⁸. In Anbetracht seiner Bedeutung für die Regulierung von Gesundheit und Krankheiten ist die genaue Quantifizierung der circRNA-Expression das Gebot der Stunde.

Mehrere biochemische Methoden wurden entwickelt, um circRNAs in biologischen Proben zu quantifizieren⁹. Eine der bequemsten und am weitesten verbreiteten Methoden zur circRNA-Quantifizierung ist die reverse Transkription gefolgt von einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) unter Verwendung divergenter Primerpaare¹⁰. Die Mehrheit der circRNAs ist jedoch im Vergleich zu linearen mRNAs in geringer Häufigkeit, was es schwierig macht, sie zu quantifizieren¹¹. Um dieses Problem zu lösen, haben wir versucht, die digitale Tröpfchen-PCR (dd-PCR) zu verwenden, um die Anzahl der circRNAs in einer bestimmten Probe genau zu quantifizieren. Die dd-PCR ist eine fortschrittliche PCR-Technologie, die dem Prinzip der Mikrofluidik folgt. es erzeugt mehrere wässrige Tröpfchen in Öl, und die PCR tritt in jedem Tröpfchen als individuelle Reaktion auf¹². Die Reaktion erfolgt in einzelnen Tröpfchen und wird mit einem Tröpfchenleser analysiert, der die Anzahl der positiven oder negativen Tröpfchen für das interessierende Gen¹² angibt. Es ist die empfindlichste Technik, um ein Gen von Interesse genau zu quantifizieren, auch wenn es nur eine einzige Kopie in einer bestimmten Probe gibt. Verminderte Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren, bessere Präzision und das Weglassen des Referenzgens für die Quantifizierung machen es vorteilhafter als herkömmliche qPCR^13,14,15. Es wurde häufig als Forschungs- und Diagnosewerkzeug für die absolute Quantifizierung eines interessierenden Gens^{verwendet 16,17}. Hier beschreiben wir das detaillierte dd-PCR-Protokoll für die circRNA-Quantifizierung bei der Differenzierung von C2C12-Myotuben der Maus und proliferierenden C2C12-Myoblasten der Maus unter Verwendung divergenter Primer.

Protokoll

RNA ist empfindlich gegenüber RNasen; Daher sollten alle Reagenzien, Instrumente und Arbeitsbereiche RNase-frei sein und mit Sorgfalt behandelt werden.

1. Divergentes Primerdesign für circRNA (siehe Abbildung 1)

1. Rufen Sie die reife Sequenz aus circRNA-Annotationsdaten mit BEDTools oder aus dem UCSC-Genombrowser ab, indem Sie die Exon/Intron-Sequenz zwischen den Backspleißverbindungskoordinaten^18,19 verbinden.
2. Bereiten Sie eine PCR-Vorlagensequenz von 200 Nukleotiden Länge vor, indem Sie die letzten 100 Nukleotide der gesamten circRNA-Sequenzlänge mit den ersten 100 Nukleotiden der circRNA-Sequenz¹⁰ verbinden.
   HINWEIS: Wenn die circRNA-Länge weniger als 200 Nukleotide beträgt, teilen Sie sie in zwei gleiche Hälften und verbinden Sie die Nukleotide von der letzten Hälfte bis zum Anfang der ersten Hälfte.
3. Verwenden Sie die obige Vorlagensequenz für das Primer-Design, indem Sie das Primer3-Webtool verwenden und eine PCR-Produktlänge von 120-180 Nukleotiden in der Länge²⁰ einstellen.
4. Verwenden Sie die Standardeinstellungen von Primer3 für andere Parameter wie Tm und Primerlänge. Die Primersequenzen für circBnc2 sind in Tabelle 1 aufgeführt.
5. Bestellen Sie die divergenten Primersequenzen für die Synthese bei einem beliebigen oligosynthetisierenden Unternehmen.

2. RNA-Isolierung

HINWEIS: Isolieren Sie die Gesamt-RNA aus den C2C12-Zellen der Maus mit handelsüblichen Kits oder einer internen RNA-Isoliermethode. Die hier verwendete hauseigene RNA-Isolierungsmethode wurde bereits²¹ beschrieben. Die magnetischen Kieselsäurekügelchen werden im Labor unter Verwendung des zuvor veröffentlichten Protokolls²² hergestellt. Diese magnetischen Perlen können auch von verschiedenen Anbietern bezogen werden.

1. Nehmen Sie eine 10-cm-Schale mit etwa 5 x 10⁶ proliferierenden C2C12-Myoblastenzellen und einem 4-tägigen differenzierten C2C12-Myoröhrchen zur RNA-Isolierung.
2. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 10 ml 1x PBS und entsorgen Sie das PBS mit einer Pipette.
3. Die Zellen in 1 ml 1x PBS mit einem Zellschaber abkratzen, bei 4 °C für 5 min bei 750 x g zentrifugieren und PBS mit einer Pipette entsorgen.
4. Fügen Sie 1 ml RNA-Isolierreagenz (RIR) hinzu und lysieren Sie die Zellen durch kräftiges Pipettieren²¹.
5. Fügen Sie 200 μL (1/5 des Volumens von RIR) Chloroform und Wirbel für 15 s hinzu. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 4 °C für 10 min bei 12.000 x g.
6. Nehmen Sie 400 μL der oberen wässrigen Schicht, laden Sie sie auf eine Kieselsäuresäule und zentrifugieren Sie für 1 min bei 12.000 x g bei Raumtemperatur. Nehmen Sie den Durchfluss in ein neues Röhrchen und fügen Sie 600 μL 100% Ethanol hinzu.
7. Fügen Sie 20 μL magnetische Kieselsäurekügelchen hinzu und legen Sie das Röhrchen für 5 min auf einen Thermomixer, der auf 25 °C und 1.200 U/min eingestellt ist.
   HINWEIS: Das Perlenvolumen kann je nach anfänglicher Zellzahl für die Lyse erhöht oder verringert werden. Magnetische Kieselsäureperlen können von kommerziellen Anbietern bezogen werden.
8. Legen Sie das Röhrchen für 30 s auf einen magnetischen Ständer oder bis die Lösung klar ist. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette.
9. Resuspendieren Sie die magnetischen Kieselsäurekügelchen in einem 500 μL Waschpuffer mit 90% Ethanol. Legen Sie das Rohr für 30 s auf den Magnetständer. Drehen Sie das Rohr zweimal auf dem Magnetständer, um die Perlen zu waschen. Lassen Sie die Perlen sich in Richtung des Magneten absetzen und entsorgen Sie den Puffer mit einer Pipette.
10. Wiederholen Sie Schritt 2.9 zweimal. Nach dem Waschen das Röhrchen kurz umdrehen und für 30 s wieder auf den Magnetstativ legen. Entsorgen Sie den restlichen Waschpuffer. Trocknen Sie das Röhrchen bei 50 °C für 3 min an der Luft auf einem Thermomixer und halten Sie den Deckel offen.
11. Fügen Sie 20 μL nukleasefreies Wasser hinzu und resuspendieren Sie die Perlen.
    HINWEIS: Das RNA-Elutionsvolumen kann auf 10 μL reduziert werden, um die RNA-Konzentration zu erhöhen.
12. Stellen Sie die Röhrchen für 2-3 min bei Raumtemperatur. Legen Sie das Rohr wieder auf den Magnetständer und lassen Sie es 30 s sitzen. Sammeln Sie die gelöste RNA in einem neuen Röhrchen zur Quantitäts- und Qualitätsbeurteilung mit einem Spektralphotometer.
    HINWEIS: RNA kann bei −20 °C oder −80 °C für die Langzeitlagerung gelagert werden. Um ein optimales Ergebnis zu erzielen, wird empfohlen, am nächsten Tag mit dem Schritt der cDNA-Synthese fortzufahren.

3. cDNA-Synthese

1. Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer und nehmen Sie 1 μg RNA für die cDNA-Synthese.
2. Mischen Sie 1 μg Gesamt-RNA mit 1 μL dNTP-Mix (jeweils 10 mM dATP, dTTP, dGTP und dCTP), 4 μL 5x Reverse-Transkriptase (RT)-Puffer, 2 μL 10x RT-Zufallsprimer, 0,25 μL reverses Transkriptase-Enzym (200 U/μL) und 0,5 μL RNase-Inhibitor (40 U/μL) und bilden das Volumen mit nukleasefreiem Wasser auf bis zu 20 μL.
   HINWEIS: Das Enzymvolumen der reversen Transkriptase kann abhängig von der anfänglichen RNA-Konzentration für die cDNA-Synthese verändert werden.
3. Klopfen Sie auf das Röhrchen, um die Reaktion zu mischen und kurz zu drehen. Stellen Sie das Röhrchen 10 min bei 25 °C, gefolgt von 1 h bei 50 °C.
4. Um das Enzym zu inaktivieren, stellen Sie das Röhrchen für 5 min bei 85 °C.
5. Kühlen Sie das Röhrchen in Eis für 2 min und fügen Sie 480 μL nukleasefreies Wasser in das Röhrchen hinzu, um die cDNA-Konzentration auf 2 ng / μL zu erhöhen.
   HINWEIS: cDNA kann bei -20 °C gelagert oder sofort für die dd-PCR-Analyse verwendet werden.

4. Workflow für die digitale Tröpfchen-PCR (dd-PCR)

HINWEIS: Der Workflow der dd-PCR umfasst mehrere Schritte, beginnend mit der Probenvorbereitung, gefolgt von der Tröpfchenerzeugung, PCR-Amplifikation, Tröpfchenzählung und Datenanalyse. Jeder Schritt ist entscheidend für die genaue Datengenerierung, da dd-PCR die absolute Quantifizierung von Produkten beinhaltet und keine Standardkurve benötigt. Daher wurde jeder der verschiedenen Schritte der dd-PCR im Folgenden beschrieben.

1. Vorbereitung der dd-PCR-Reaktion.
   1. Richten Sie die PCR-Reaktion von 22 μL in 0,2 ml PCR-Röhrchen oder -Streifen zusammen mit einem Negativkontrollröhrchen und NTC-Röhrchen (Non-Template-Control) ein.
      HINWEIS: Jedes unterschiedliche divergente Primerpaar für den Nachweis verschiedener circRNAs muss zusammen mit Testproben eine NTC-Reaktion aufweisen.
   2. Fügen Sie 11 μL dd-PCR-Master-Mix (z. B. EvaGreen Supermix) und 11 μL nukleasefreies Wasser hinzu, um das Negativkontrollreaktionsröhrchen einzurichten.
      HINWEIS: Tauen Sie den dd-PCR-Master-Mix bei Raumtemperatur auf, gefolgt von einem kurzen Wirbel, um eine homogene Mischung zu erhalten. Verwenden Sie das gleiche nukleasefreie Wasser, um das Negativkontrollreaktionsröhrchen und die NTC-Röhrchen einzurichten, die zum Verdünnen der cDNA verwendet wurden.
   3. Fügen Sie 11 μL dd-PCR-Master-Mix, 5,5 μL circRNA-spezifische Forward- und Reverse-Primermischung mit 1 μM-Konzentration und 5,5 μL nukleasefreies Wasser hinzu, um die NTC-Reaktionsröhrchen einzurichten.
      HINWEIS: Verdünnen Sie die vorwärts- und rückwärts zirkulären RNA-spezifischen divergenten Primer von 100 μM Stamm und mischen Sie, um eine Arbeitskonzentration von 1 μM vorwärts und umgekehrt circRNA-Primermischung herzustellen; Somit beträgt die endgültige Primerkonzentration 250 nM in der 22 μL-Reaktion.
   4. Fügen Sie 11 μL dd-PCR-Mastermix, 5,5 μL circRNA-spezifische Forward- und Reverse-Primermischung mit 1 μM-Konzentration und 5,5 μL cDNA (2 ng/μL) hinzu, um die Testreaktionsröhrchen einzurichten.
   5. Anschließend werden alle Reaktionsröhrchen kurz zentrifugiert, um ein homogenes Reaktionsgemisch am Boden der Röhrchen zu erhalten.
2. Tröpfchenerzeugung.
   1. Das 20 μL PCR-Gemisch aus 0,2 mL PCR-Röhrchen in die Probenvertiefungen der Tröpfchengeneratorkartusche überführt.
   2. Geben Sie 70 μL Tröpfchenerzeugungsöl vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette in die Ölquellen der Tröpfchengeneratorkartusche.
      HINWEIS: Inkubieren Sie das Tröpfchenöl vor Gebrauch 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
   3. Decken Sie die Tröpfchengeneratorpatrone mit der Gummidichtung ab und legen Sie sie in die Tröpfchengeneratormaschine, um die Probenöl-Tröpfchenmischung zu erhalten, die in den Tröpfchenmulden der Patrone erzeugt wird.
3. PCR-Amplifikation.
   1. 40 μL der Probenöl-Tröpfchenmischung aus den Tröpfchenmulden der Tröpfchengeneratorkartusche auf eine 96-Well-PCR-Platte mit einer Mehrkanalpipette übertragen.
      HINWEIS: Übertragen Sie die Proben-Öl-Tröpfchenmischung vorsichtig, während Sie durch die Spitzen der Mehrkanalpipette einen Winkel zu den Vertiefungen bilden, um zu vermeiden, dass die Tröpfchen beim Übertragen auf die dd-PCR 96-Well-Platte gebrochen werden.
   2. Verschließen Sie die 96-Well-PCR-Platte mit dem Aluminiumfolienversiegeler, legen Sie sie in den auf 80 °C vorgeheizten Maschinenblock der Plattenversiegelung und klicken Sie auf die Versiegelung der PCR-Platte.
   3. Legen Sie nun die Platte in den dd-PCR-Thermocycler und stellen Sie das Programm wie in Tabelle 2 beschrieben ein, wobei die Deckeltemperatur auf 105 °C und eine Rampenrate von 2 °C/s eingestellt ist.
4. Tröpfchenzählung.
   1. Sobald die PCR abgeschlossen ist, legen Sie die Platte auf das tt-PCR-Tröpfchenzählergerät mit dem Plattenhalter in der richtigen Position zum Zählen der Tröpfchen.
   2. Öffnen Sie die Tropfenanalysesoftware und richten Sie den Lauf ein, indem Sie Eingaben für die Probeninformationen geben.
   3. Klicken Sie auf die Setup-Option. Klicken Sie dann auf die Vorlagenoption , um eine neue Vorlage zu öffnen.
   4. Definieren Sie jede Vertiefung, indem Sie die Details des Experiments angeben, z. B. Probenname (verwendete cDNA oder Negativkontrolle oder NTC), Zielname (circRNA-Primername) und Typ (unbekannt) und Experimenttyp als ABS (absolute Quantifizierung) und Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) usw.
   5. Speichern Sie abschließend die Vorlage und starten Sie den Lauf, indem Sie auf die Ausführungsoption klicken und die Zählung nach Zeile oder Spalte auswählen. Lassen Sie die Maschine die Tröpfchenzählung abschließen, die etwa 1 Minute / Well dauert.
   6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Analysieren , um die Daten nach Abschluss der Tröpfchenmessung zu analysieren.
   7. Klicken Sie auf die Schaltfläche 1D-Amplitude , um die positiven und negativen Tröpfchen anzuzeigen
   8. Um die positiven Tröpfchen von den negativen Tröpfchen zu trennen, setzen Sie eine gemeinsame Schwellenwertlinie für alle Proben mit demselben Ziel.
      HINWEIS: Die Gesamtzahl der Tröpfchen in jeder Probe sollte über 10.000 liegen, um für die absolute Quantifizierung berücksichtigt zu werden. Der NTC sollte keine positiven Tröpfchenzahlen aufweisen. Das Vorhandensein positiver Tröpfchen im NTC weist auf eine Kontamination der Reagenzien oder eine Amplifikation der Primer-Dimere hin. Es ist schwierig herauszufinden, ob die positiven Tröpfchen Primer-Dimere oder unspezifische Produkte in NTC enthalten. Es wird empfohlen, die Primer zu überprüfen und eine Kontamination der Reagenzien als allgemeine Praxis für jede PCR einschließlich dd-PCR zu vermeiden.
   9. Klicken Sie auf die Schaltfläche Exportieren , um die circRNA-Zähldaten als .csv Datei zu exportieren. Die exportierten Daten zeigen die Anzahl der in jeder Probe vorhandenen circRNAs.
   10. Berechnen Sie manuell die Anzahl der circRNAs in jeder Probe pro Nanogramm RNA, indem Sie die Gesamtmenge an cDNA berücksichtigen, die in jeder Reaktion verwendet wird.

Ergebnisse

Die absolute Anzahl der circRNAs in jeder Probe kann aus den exportierten dd-PCR-Daten abgeleitet werden. Die quantitative PCR-Analyse in Echtzeit deutete auf eine differentielle Expression von circBnc2 in den differenzierten C2C12-Myotuben hin (Daten nicht gezeigt). Hier wollten wir die absolute Kopienzahl von circBnc2 in proliferierenden C2C12-Myoblasten und Myotuben überprüfen. Da die Expression von circBnc2 unter zwei Bedingungen verglichen wird, ist es sehr wichtig, alle Proben für RNA-...

Diskussion

Die CircRNA-Forschung ist in den letzten zehn Jahren mit der Entdeckung von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien gewachsen. Daher wurde es als potenzielles Molekül für zukünftige RNA-Therapeutika angesehen. Darüber hinaus ist bekannt, dass es als Biomarker bei mehreren Krankheiten wirkt, einschließlich Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen ^4,8. Die Identifizierung von circRNA ist jedoch aufgrund ihrer geringen Häufigkeit schwierig und sie hat nur eine s...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentifuge tube	Tarson	500010
0.2 ml tube strips with cap	Tarson	610020, 510073
Filter Tips	Tarson	528104
DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977023
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P4417
Cell scrapper	HiMedia	TCP223
Chloroform	SRL	96764
DNA diluent	HiMedia	MB228
Random primers	Thermo Fisher Scientific	48190011
dNTP set	Thermo Fisher Scientific	R0181
Murine RNase inhibitor	NEB	M0314S
Maxima reverse transcriptase	Thermo Fisher Scientific	EP0743
QX200 dd-PCR Evagreen Supermix	Bio-Rad	1864033
Droplet generation oil for Evagreen	Bio-Rad	1864006
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable	Bio-Rad	1814040
DG8 Cartridges and Gaskets	Bio-Rad	1864007
DG8 Cartridge holder	Bio-Rad	1863051
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	1864002
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad	12001925
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad	1814000
C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module	Bio-Rad	1851197
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad	1864003
Quantasoft Software	Bio-Rad	1864011
Silica column	Umbrella Life Science	38220090
UCSC Genome Browser		https://genome.ucsc.edu/
Primer 3		https://primer3.ut.ee/