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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Pupillometrie, eine einfache und nicht-invasive Technik, wird als Methode zur Bestimmung von Hörschwellen bei normal hörenden Tieren und Tiermodellen verschiedener auditiver Pathologien vorgeschlagen.

Zusammenfassung

Lärmbelastung ist eine der Hauptursachen für Schallempfindungsschwerhörigkeit. Tiermodelle für lärmbedingten Hörverlust haben mechanistische Einblicke in die zugrunde liegenden anatomischen und physiologischen Pathologien von Hörverlust ermöglicht. Es bleibt jedoch schwierig, Verhaltensdefizite, die bei Menschen mit Hörverlust beobachtet wurden, mit Verhaltensdefiziten in Tiermodellen in Beziehung zu setzen. Hier wird die Pupillometrie als eine Methode vorgeschlagen, die den direkten Vergleich von Verhaltensdaten von Tieren und Menschen ermöglicht. Die Methode basiert auf einem modifizierten seltsamen Paradigma - das Subjekt wird an die wiederholte Präsentation eines Stimulus gewöhnt und intermittierend ein abweichender Stimulus präsentiert, der in irgendeiner parametrischen Weise vom wiederholten Stimulus abweicht. Die grundlegende Prämisse ist, dass, wenn der Wechsel zwischen dem wiederholten und dem abweichenden Reiz vom Subjekt erkannt wird, er eine Pupillenerweiterungsreaktion auslöst, die größer ist als die, die durch den wiederholten Reiz ausgelöst wird. Dieser Ansatz wird anhand einer Vokalisationskategorisierungsaufgabe bei Meerschweinchen demonstriert, einem Tiermodell, das in der Hörforschung, einschließlich in Studien zu Hörverlust, weit verbreitet ist. Durch die Darstellung von Lautäußerungen aus einer Vokalisationskategorie als Standardreize und einer zweiten Kategorie als seltsame Reize, die in Rauschen eingebettet sind, bei verschiedenen Signal-Rausch-Verhältnissen wird gezeigt, dass das Ausmaß der Pupillenerweiterung als Reaktion auf die seltsame Kategorie monoton mit dem Signal-Rausch-Verhältnis variiert. Wachstumskurvenanalysen können dann verwendet werden, um den zeitlichen Verlauf und die statistische Signifikanz dieser Pupillenerweiterungsreaktionen zu charakterisieren. In diesem Protokoll werden detaillierte Verfahren zur Akklimatisierung von Meerschweinchen an den Aufbau, zur Durchführung der Pupillometrie und zur Auswertung/Analyse der Daten beschrieben. Obwohl diese Technik in diesem Protokoll bei normal hörenden Meerschweinchen demonstriert wird, kann die Methode verwendet werden, um die sensorischen Auswirkungen verschiedener Formen von Hörverlust bei jedem Probanden zu beurteilen. Diese Effekte können dann mit gleichzeitigen elektrophysiologischen Messungen und post-hoc anatomischen Beobachtungen korreliert werden.

Einleitung

Der Pupillendurchmesser (PD) kann von einer Vielzahl von Faktoren beeinflusst werden, und die Messung der PD, die sich im Laufe der Zeit ändert, wird als Pupillometrie bezeichnet. Die Parkinson-Krankheit wird durch den Irisschließmuskel (an der Verengung beteiligt) und den Irisdilatatormuskel (an der Dilatation beteiligt) gesteuert. Der Konstriktionsmuskel wird vom Parasympathikus innerviert und beinhaltet cholinerge Projektionen, während der Irisdilatator vom sympathischen System mit noradrenergen und cholinergen Projektionen 1,2,3 innerviert wird. Der bekannteste Stimulus zur Induktion von Parkinson-Veränderungen ist die Luminanz-Verengung, und die Dilatationsreaktionen der Pupille können durch Variationen der Umgebungslichtintensitäthervorgerufen werden 2. PD ändert sich auch in Abhängigkeit von Brennweite2. Es ist jedoch seit Jahrzehnten bekannt, dass PD auch nicht-luminanzbedingte Schwankungen aufweist 4,5,6,7. Zum Beispiel können Veränderungen in inneren mentalen Zuständen vorübergehende Parkinson-Veränderungen hervorrufen. Die Pupille erweitert sich als Reaktion auf emotional aufgeladene Reize oder nimmt mit Erregung zu 4,5,8,9. Die Pupillenerweiterung könnte auch mit anderen kognitiven Mechanismen zusammenhängen, wie z. B. erhöhter geistiger Anstrengung oder Aufmerksamkeit10,11,12,13. Aufgrund dieses Zusammenhangs zwischen Pupillengrößenschwankungen und psychischen Zuständen wurden Parkinson-Veränderungen als Marker für klinische Störungen wie Schizophrenie 14,15, Angstzustände 16,17,18, Parkinson 19,20 und Alzheimer 21 untersucht unter anderem. Bei Tieren verfolgen Parkinson-Veränderungen interne Verhaltenszustände und korrelieren mit neuronalen Aktivitätsniveaus in kortikalen Bereichen22,23,24,25. Es hat sich auch gezeigt, dass der Pupillendurchmesser ein zuverlässiger Indikator für den Schlafzustand bei Mäusen ist26. Diese PD-Veränderungen im Zusammenhang mit Erregung und dem inneren Zustand treten typischerweise auf langen Zeitskalen in der Größenordnung von mehreren zehn Sekunden auf.

Im Bereich der Hörforschung wurden sowohl bei normalhörenden als auch bei hörgeschädigten Probanden die Höranstrengung und die Hörwahrnehmung mittels Pupillometrie erfasst. An diesen Studien sind in der Regel geschulte Probanden27,28,29,30 beteiligt, die verschiedene Arten von Erkennungs- oder Erkennungsaufgaben ausführen. Aufgrund des oben erwähnten Zusammenhangs zwischen Erregung und Parkinson wurde gezeigt, dass ein erhöhtes Aufgabenengagement und eine erhöhte Höranstrengung mit erhöhten Pupillenerweiterungsreaktionen korrelieren 30,31,32,33,34,35. Daher wurde die Pupillometrie verwendet, um zu zeigen, dass eine erhöhte Höranstrengung aufgewendet wird, um spektral verschlechterte Sprache bei normal hörenden Zuhörern zu erkennen29,36. Bei hörgeschädigten Zuhörern, wie z. B. Menschen mit altersbedingtem Hörverlust 27,30,37,38,39,40,41 und Cochlea-Implantat-Trägern 42,43, nahmen die Pupillenreaktionen mit abnehmender Sprachverständlichkeit ebenfalls zu; Hörgeschädigte Zuhörer zeigten jedoch eine größere Pupillenerweiterung bei leichteren Hörbedingungen im Vergleich zu normal hörenden Probanden 27,30,37,38,39,40,41,42,43. Experimente, bei denen der Zuhörer eine Erkennungsaufgabe ausführen muss, sind jedoch nicht immer möglich - zum Beispiel bei Säuglingen oder in einigen Tiermodellen. Daher könnten nicht-luminanzbezogene Pupillenreaktionen, die durch akustische Reize hervorgerufen werden, eine praktikable alternative Methode zur Beurteilung der auditiven Detektion in diesen Fällen sein44,45. Frühere Studien zeigten eine transiente und reizgebundene Pupillenerweiterung als Teil des Orientierungsreflexes46. Spätere Studien haben die Verwendung von stimulusgebundenen Pupillenerweiterungen zur Ableitung von Frequenzempfindlichkeitskurven bei Eulen gezeigt47,48. In jüngster Zeit wurden diese Methoden angepasst, um die Sensitivität der Pupillenerweiterungsreaktion bei menschlichen Säuglingen zu beurteilen48. Die Pupillometrie hat sich als zuverlässiger und nicht-invasiver Ansatz zur Abschätzung der auditiven Erkennungs- und Unterscheidungsschwellen bei passiv hörenden Meerschweinchen (GPs) unter Verwendung einer breiten Palette einfacher (Töne) und komplexer (GP-Vokalisationen) Reize erwiesen49. Diese stimulusbedingten PD-Änderungen treten typischerweise auf schnelleren Zeitskalen in der Größenordnung von mehreren Sekunden auf und sind mit dem Stimulus-Timing verbunden. Hier wird die Pupillometrie von stimulusbedingten Parkinson-Veränderungen als Methode vorgeschlagen, um die Verhaltensauswirkungen verschiedener Arten von Hörstörungen in Tiermodellen zu untersuchen. Insbesondere werden Pupillometrieprotokolle für den Einsatz bei Hausärzten, ein gut etabliertes Tiermodell für verschiedene Arten von Hörpathologien 50,51,52,53,54,55,56 (siehe auch Referenz 57 für eine umfassende Übersicht) beschrieben.

Obwohl diese Technik bei normalhörenden Hausärzten demonstriert wird, können diese Methoden leicht an andere Tiermodelle und Tiermodelle verschiedener Hörpathologien angepasst werden. Wichtig ist, dass die Pupillometrie mit anderen nicht-invasiven Messungen wie EEG sowie mit invasiven elektrophysiologischen Aufzeichnungen kombiniert werden kann, um die Mechanismen zu untersuchen, die möglichen Schalldetektions- und Wahrnehmungsdefiziten zugrunde liegen. Schließlich kann dieser Ansatz auch verwendet werden, um große Ähnlichkeiten zwischen Mensch- und Tiermodellen herzustellen.

Protokoll

Holen Sie für alle experimentellen Verfahren die Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ein und halten Sie sich an die NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren. In den Vereinigten Staaten von Amerika unterliegen Hausärzte zusätzlich den Vorschriften des US-Landwirtschaftsministeriums (USDA). Alle Verfahren in diesem Protokoll wurden von der IACUC der University of Pittsburgh genehmigt und entsprachen den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Für dieses Experiment wurden drei männliche, pigmentierte Wildtyp-Hausärzte im Alter zwischen 4 und 10 Monaten mit einem Gewicht von ~600-1.000 g verwendet.

1. Chirurgischer Eingriff

  1. Führen Sie alle Pupillometrie-Experimente in wachen, kopffixierten und passiv zuhörenden pigmentierten Hausärzten durch. Verifizieren Sie das normale Gehör bei Versuchspersonen anhand von Click- und Reinton-Aufzeichnungen der auditorischen Hirnstammantwort (ABR)58.
    HINWEIS: Obwohl die Pupillometrie-Datenerfassung an sich nicht-invasiv ist, wird in diesem Protokoll eine invasive Kopf-Post-Implantat-Operation verwendet, um den Kopf des Tieres während des Eingriffs zu immobilisieren. Alternativen werden im Abschnitt "Diskussion" vorgestellt.
  2. Implantieren Sie zunächst alle Versuchstiere mit einem Kopfpfosten aus Edelstahl zur Kopffixierung unter Isofluran-Anästhesie. Verwenden Sie aseptische chirurgische Techniken, um den Kopfpfosten mit einer Kombination aus Knochenschrauben und Zahnacryl58 am Schädel zu verankern.
  3. Versorgen Sie die Tiere postoperativ, einschließlich der Verabreichung von systemischen und topischen Analgetika. Gewöhnen Sie die Tiere nach einer 2-wöchigen Erholungsphase allmählich an den Versuchsaufbau.
    HINWEIS: Der chirurgische Eingriff basiert auf zuvor veröffentlichten Methoden in den Hausärzten58 sowie anderen Spezies 59,60 und steht nicht im Mittelpunkt dieses Protokolls.

2. Gewöhnung der Tiere an den Versuchsaufbau

ANMERKUNG: Die Experimente finden in der Regel in einer schallgedämpften Kammer oder Kabine statt (siehe Materialtabelle). Die Zeit, die benötigt wird, um ein Tier mit dem Aufbau vertraut zu machen, variiert von Thema zu Thema. Typische Akklimatisierungszeiten sind unten aufgeführt. Ein gut akklimatisiertes Tier toleriert eine Kopffixierung mit minimaler Körperbewegung und führt zu besseren Pupillendurchmessermessungen.

  1. Nach einer 2-wöchigen Erholungsphase machen Sie die Tiere zunächst mit der Handhabung und dem Transport vertraut (2-3 Tage). Diese Akklimatisierung ist wichtig, um Stress und Angst abzubauen. Um das Tier mit der Handhabung vertraut zu machen, legen Sie das Tier für immer längere Zeit (10-30 min) in seinen Transportbehälter und fassen Sie das Tier für immer längere Zeit (10-30 min) an.
  2. Als nächstes gewöhnen Sie das Tier an den Versuchsaufbau (2-3 Tage), indem Sie es für 10-45 Minuten in ein Gehege setzen (Abbildung 1A). Das Gehege muss kleine Haltungsverschiebungen zulassen, damit sich das Tier während des Versuchs wohlfühlt. Erlauben Sie kleine Haltungsverschiebungen für den Komfort des Tieres während des Experiments. Es ist jedoch bekannt, dass die Pupillenerweiterung der Bewegung49 vorausgeht. Messen Sie daher die Bewegung des Tieres und berücksichtigen Sie diese Bewegung in der Datenanalyse (Abbildung 1C).
  3. Fassen Sie im Rahmen dieser Akklimatisierung den implantierten Kopfpfosten manuell an, als ob das Tier mit dem Kopf fixiert werden würde. Halten Sie den Kopfpfosten für eine längere Dauer (10-60 s).
  4. Versuchen Sie nach der manuellen Akklimatisierung und je nach Verhalten des Tieres, das Tier mit dem Kopf mit dem Implantathalter an einem starren Rahmen zu befestigen.
  5. Erhöhen Sie langsam die Dauer der Kopffixierung (10-45 min), bis das Tier während der Kopffixierung ruhig und relativ ruhig ist (2-3 Tage).
  6. Gewöhnen Sie das Tier an die Anwesenheit der Kamera, der IR-Lichtquelle und der Weißlichtquelle (1-2 Tage). Schalten Sie das weiße Licht ein und erhöhen Sie die Dauer schrittweise (10 Minuten bis 30 Minuten).
  7. Gewöhnen Sie das Tier an die akustische Stimulation, indem Sie eine Vielzahl von Geräuschen (z. B. reine Töne, Klicks, Lautäußerungen) mit unterschiedlichen Schallpegeln (1-2 Tage, gleichzeitig mit Schritt 2.6) abspielen. Um die Gewöhnung an experimentelle Reize zu minimieren, verwenden Sie andere Geräusche als die, die in diesem Schritt für die Pupillometrie-Experimente vorgesehen sind.

3. Kalibrierung der Pupillenkamera

HINWEIS: Die für die Pupillometrie verwendete Kamera gibt ein Video über USB an die Pupillometrie-Software-Suite aus. Aus diesem Video wird der Pupillendurchmesser mithilfe einer Ellipsenanpassung und eines vom Benutzer einstellbaren Schwellenwerts durch die Pupillometrie-Software-Suite extrahiert (siehe Materialtabelle). Die Software wird dann mit einer Digital-Analog-Karte verbunden. Die Karte gibt einen analogen Spannungswert aus, der proportional zum Pupillendurchmesser ist. Eine Kalibrierung ist erforderlich, um diesen Spannungswert wieder in den Pupillendurchmesser in Längeneinheiten umzuwandeln.

  1. Legen Sie ein Blatt Papier mit Bildern von schwarzen Scheiben mit bekanntem Durchmesser an die gleiche Stelle, an der sich das Auge des Hausarztes während der Pupillometrie befindet. Bei Hausärzten liegt die PD im Bereich von 4 mm. Führen Sie daher die Kalibrierung mit 3-mm-, 4-mm- und 5-mm-Scheiben durch.
  2. Platzieren Sie die Pupillometrie-Kamera (siehe Materialtabelle) in der gleichen Entfernung (25 cm), in der die Experimente durchgeführt werden. Stellen Sie die Blende und den Fokus der Kamera ein, bis ein scharf fokussiertes Bild einer Scheibe mit bekanntem Durchmesser erhalten wird.
  3. Stellen Sie in der Pupillometrie-Erfassungssoftware (siehe Materialtabelle) den Schwellenwert so ein, dass der Umriss der Ellipse genau mit der abgebildeten Scheibe übereinstimmt, und notieren Sie sich den Wert und die Skalierung der analogen Ausgangsspannung.
  4. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die 3-mm-, 4-mm- und 5-mm-Scheiben. Tabellieren Sie dann die tatsächlichen Durchmesserwerte (in mm), die den analogen Ausgangsspannungswerten entsprechen.

4. Pupillometrie-Datenerfassung

  1. Führen Sie alle Experimente in einer schallgedämpften Kabine oder Kammer durch, wobei die Innenwände mit schalltotem Schaum bedeckt sind.
  2. Montieren Sie für die Freifeld-Stimulusabgabe einen kalibrierten Lautsprecher an der schallgedämpften Kammerwand in gleicher Höhe wie die Position, an der das Tier platziert werden soll.
    HINWEIS: Die Wahl des Lautsprechers hängt von der untersuchten Spezies und den geplanten Reizen ab. Verwenden Sie für GP-Vokalisationen einen Breitband-Treiberlautsprecher mit einem relativ flachen Frequenzgang (±3 dB) im Vokalisationsfrequenzbereich von 0,5 bis 3 kHz (Abbildung 1A).
  3. Platzieren Sie das Tier im Gehege und achten Sie darauf, dass keine großen Körperbewegungen möglich sind (Abbildung 1A). Befestigen Sie den Kopf des Tieres am starren Rahmen, wie in Schritt 2 beschrieben (Abbildung 1A).
  4. Platzieren Sie einen piezoelektrischen Sensor unter dem Gehäuse, um Tierbewegungen zu erkennen und aufzuzeichnen (Abbildung 1A).
  5. Um den Luftstoß aufzustellen, verwenden Sie eine an der Tischplatte befestigte Halterung, um eine Pipettenspitze ~15 cm vor der Schnauze des Tieres zu platzieren. Verbinden Sie ein Silikonröhrchen (~3 mm Durchmesser) mit der Pipettenspitze und verbinden Sie das Röhrchen mit einem geregelten Luftzylinder.
  6. Halten Sie den Luftdruck des Zylinders zwischen 20 und 25 psi. Führen Sie den Schlauch durch ein Quetschventil, um den Zeitpunkt und die Dauer des Luftstoßes mit einem computergesteuerten Relais zu steuern.
  7. Beleuchten Sie das Auge mit einem Infrarot-LED-Array, das in ~10 cm Entfernung platziert ist. Verwenden Sie eine weiße LED-Beleuchtung mit einer Intensität von ~2.000 cd/m2 , um das abgebildete Auge zu beleuchten und die Basis-PD auf ~3,5 mm zu bringen. Aufrechterhaltung konstanter Beleuchtungsbedingungen in der Experimentierkammer während der experimentellen Sitzungen.
    HINWEIS: Bei normaler Laborbeleuchtung (~500 cd/m2) ist die GP-Pupille ziemlich erweitert und erlaubt nicht die Beobachtung einer weiteren reizbedingten Dilatation. Durch die Verwendung zusätzlicher Beleuchtung wird die Pupille auf einen Basisliniendurchmesser von ~3,5 mm gebracht, was einen ausreichenden Dynamikbereich ermöglicht, um die reizgebundene Dilatation zu beobachten. Dies gewährleistet auch konsistente Baselines über Sitzungen und Fächer hinweg.
  8. Öffnen Sie die Pupillenerfassungssoftware und nehmen Sie das Video (mit 90 Bildern pro Sekunde) der Pupille mit einer Kamera mit einem 16-mm-Objektiv (räumliche Auflösung von 0,15° Blickwinkel) und einem Infrarotfilter (IR) auf, die in einem Abstand von 25 cm vom abgebildeten Auge platziert ist. Stellen Sie sicher, dass das Auge im abgebildeten Bereich zentriert ist.
  9. Regulieren Sie die Blende und den Fokus der Kamera sowie die IR-Stufe, bis der Umriss der abgebildeten Pupille scharf ist.
  10. Definieren Sie in der Schülererfassungssoftware den interessierenden Bereich, der die Pupille enthält, indem Sie mit der Maus einen rechteckigen Bereich auswählen.
  11. Verwenden Sie das Bedienfeld der Pupillenerfassungssoftware, um die Helligkeit und den Kontrast des aufgenommenen Videos anzupassen. Stellen Sie die Scandichte auf 5 ein und stellen Sie den Schwellenwert so ein, dass die Ellipsenanpassung genau mit dem Umriss der Pupille im Video übereinstimmt.
  12. Erfassen und speichern Sie mithilfe der neuronalen Schnittstellenprozessorsoftware das analoge Signal von der PD-Spur, die Spannungsspur vom piezoelektrischen Sensor, der die Bewegung aufzeichnet, die Stimuluslieferzeiten und die Luftpufflieferzeiten.

5. Call-in-Noise-Erkennung und kategorische Unterscheidung unter Verwendung eines modifizierten Oddball-Paradigmas

ANMERKUNG: Die Stimuli für Pupillometrie-Experimente bestanden aus GP-Vokalisationen, die in einer Tierkolonie aufgezeichnet wurden58. Die Vokalisationsbeispiele finden Sie im folgenden Repository: https://github.com/vatsunlab/CaviaVOX. Insbesondere wurden Keuch- und Jammerrufe verwendet, um die in den repräsentativen Ergebnissen gezeigten Schülerreaktionen hervorzurufen. Wählen Sie aus jeder Kategorie Vokalisationen aus, deren Länge ungefähr gleich ist. Um Unterschiede in der Aufzeichnungsamplitude und den zeitlichen Hüllkurven der Lautäußerungen zu berücksichtigen, normalisieren Sie die Lautäußerungen bei Bedarf durch ihre Amplituden im quadratischen Mittelwert (RMS).

  1. Präsentieren Sie die auditiven Reize mit MATLAB mit einer geeigneten Abtastrate. Für Hausärzte, bei denen es sich um niederfrequent hörende Tiere handelt, ist eine Abtastrate von 100 kHz ausreichend.
  2. Wählen Sie acht verschiedene Exemplare von GP-Vokalisationen ähnlicher Länge aus zwei verschiedenen Kategorien von Vokalisationen (z. B. Keuchrufe und Jammern) aus. Eine Kategorie (acht Exemplare) dient als Standardreize, und die andere Kategorie (acht Exemplare) dient als seltsame oder abweichende Reize (Abbildung 2A).
  3. Um 1 s lange Standard- und abweichende Stimuli zu erzeugen, die in Rauschen mit unterschiedlichen Signal-Rausch-Verhältnis-Pegeln (SNR) eingebettet sind, fügen Sie den Anrufen weißes Rauschen gleicher Länge hinzu (Gated Noise). Der Bereich der in diesem Experiment abgetasteten SNRs liegt zwischen -24 dB SNR und +40 dB SNR.
  4. Erfassen Sie mithilfe eines Blockdesigns in jeder experimentellen Sitzung (~ 12 Minuten Dauer) Daten, die einem einzelnen SNR-Pegel entsprechen. Verwenden Sie in jeder Sitzung acht Exemplare einer Vokalisationskategorie bei einem bestimmten SNR als Standardreize und acht Exemplare der anderen Vokalisationskategorie bei derselben SNR-Stufe als abweichende Reize.
    HINWEIS: Ein typischer Versuchsblock dauert ~12 Minuten. Abhängig vom Verhalten des Tieres und der Gewöhnung an die Pupillenreaktionen kann es möglich sein, Daten für 3-4 Blöcke pro Tag (~45 - 60 Minuten) zu erfassen. Überwachen Sie das Tier während dieser Zeit genau über das Pupillenvideo, die Bewegungsspur sowie direkt zwischen den Blöcken.
  5. Bereiten Sie für jede Sitzung eine pseudozufällige Stimulus-Präsentationssequenz vor, die >90% der Zeit Standardreize enthält. Stellen Sie sicher, dass zwischen abweichenden Reizen mindestens 20 Versuche mit Standardreizen liegen (Abbildung 2B).
    HINWEIS: Je nach Experiment kann die Reihenfolge der abweichenden Reize innerhalb der Stimulus-Präsentationssequenz ein lateinisches quadratisches Design annehmen, um sicherzustellen, dass jeder einzelne abweichende Stimulus in jeder Sitzung eine eindeutige sequentielle Position einnimmt. Durch die Mittelung über alle Sitzungen kann somit der Effekt der abweichenden Reizposition innerhalb der gesamten Reizsequenz minimiert werden.
  6. Verwenden Sie eine feste Stimulusintensität (z. B. 85 dB SPL) für alle Stimuluspräsentationen.
    HINWEIS: Verwenden Sie einen geeigneten Digital-Analog-Wandler, um ein Audiosignal zu erzeugen, dämpfen Sie es mit einem programmierbaren Dämpfungsglied auf den gewünschten Schallpegel, verstärken Sie das Signal und geben Sie das Signal mit einem kalibrierten Lautsprecher (z. B. Hardware, siehe Materialtabelle) ab.
  7. Präsentieren Sie die Reize mit hoher zeitlicher Regelmäßigkeit (1 s Stimulus, gefolgt von 3 s Stille, wie in den repräsentativen Ergebnissen gezeigt).
    HINWEIS: Die Pupillenerweiterungsreaktionen sind langsam, erreichen typischerweise etwa 1 s nach Einsetzen des Stimulus ihren Höhepunkt und benötigen etwa 5 s, um zum Ausgangswert49 zurückzukehren. Die Stimulus-Präsentationsrate muss niedrig genug sein, um diese langsamen Zeitskalen zu berücksichtigen. Die zeitliche Regelmäßigkeit ist wichtig, da es möglich ist, dass die Unterbrechung des Timing-Musters selbst als abweichender Stimulus wirken könnte.
  8. Um die Interaktion des Tieres mit den Reizen aufrechtzuerhalten und die Gewöhnung zu minimieren, geben Sie optional einen kurzen Luftstoß (100 ms) nach dem abweichenden Reiz ab. Stellen Sie sicher, dass der Beginn des Luftstoßes ausreichend von der Reizdauer (2,5 s nach Beginn des Reizes) getrennt ist, so dass die durch den Reiz hervorgerufenen Pupillenerweiterungsreaktionen einen Höhepunkt erreichen, bevor die durch den Luftstoß induzierten Blinzelartefakte auftreten.
    HINWEIS: Im klassischen Oddball-Paradigma werden keine positiven oder negativen Verstärkungen verwendet. Da hier ein Luftstoß als leicht aversive Verstärkung verwendet wird, um die Bindung des Tieres an die Hörreize aufrechtzuerhalten, wird das Paradigma als modifiziertes Oddball-Paradigma bezeichnet.

6. Analyse und Statistik

HINWEIS: Alle Analysen wurden mit benutzerdefiniertem Code durchgeführt, der in MATLAB geschrieben wurde (verfügbar unter https://github.com/vatsunlab/GP_Pupil). Es werden zwei Hauptanalysemethoden beschrieben, die sich mit der Reliabilität bzw. dem zeitlichen Verlauf der Schülerantworten befassen. Die Wahl einer oder beider Methoden wird durch das experimentelle Design bestimmt.

  1. Bewegungserkennung und Testausschluss
    1. Führen Sie mit dem Code pupil_avg_JOVE.m eine Bewegungserkennung und einen Testausschluss für jede Sitzung durch. Führen Sie dazu den Code aus und wählen Sie die Datendatei aus einer einzelnen Sitzung im Popup-Dialogfeld aus.
    2. Linearer Trend der TE-Kurve und Umrechnung der Einheiten von Spannung in Mikrometer unter Verwendung der zuvor abgeleiteten Kalibriertabelle (siehe Schritt 3). Außerdem wird die Bewegungsspur über die gesamte Aufnahmesitzung (~12 min) linear detrendet.
    3. Überprüfen Sie die Sitzungsdaten, indem Sie die Pupillenspur (Abbildung 1B - obere Reihe) und die linear detrendierte Bewegungsspur (Abbildung 1B - untere Reihe) über die Sitzungsdauer (~12 Minuten) über die Versuchsmarker aufzeichnen.
    4. Messen Sie die Standardabweichung (SD) der Bewegungsspur. Ermitteln Sie die Zeiten von Bewegungs-Trace-Peaks mit der findpeaks-Funktion in MATLAB. Betrachten Sie die Peaks, die einen Schwellenwert von 5 SDs überschritten haben und die mindestens 1 s von anderen Peaks getrennt sind, als Bewegungsereignis49 (Abbildung 1B - unten).
    5. Verwerfen Sie alle Versuche (sowohl Standard- als auch abweichende) Pupillenerweiterungen, die innerhalb von 7 s nach einem Bewegungsereignis auftreten. Wenn mehr als die Hälfte der abweichenden Versuche aufgrund einer bewegungsbedingten Pupillenerweiterung verworfen wird, verwerfen Sie die gesamte Sitzung und wiederholen Sie sie.
  2. Datenvorverarbeitung und -visualisierung
    1. Verwenden Sie den Code pupil_avg_JOVE.m, um Augenblinzelartefakte zu entfernen, die Daten vorzuverarbeiten und die durchschnittliche Pupillenerweiterung für jeden Stimulus über Sitzungen hinweg zu erhalten. Führen Sie dazu den Code aus und wählen Sie im Popup-Dialog alle zu analysierenden Datendateien aus.
    2. Erkennen Sie Augenblinzeln (TE-Änderungen von mehr als 400 μm/ms) und entfernen Sie sie, indem Sie die PD-Kurve in einem Zeitfenster von 200 ms, zentriert auf die erkannte Blinzelzeit, linear interpolieren. Verwerfen Sie die Sitzungsdaten, wenn mehr als die Hälfte der abweichenden Studien ein Augenblinzeln zwischen dem Einsetzen des Stimulus und dem Einsetzen des Luftstoßes enthält.
    3. Herunterrechnen Sie PD-Daten von der Erfassungsabtastrate von 1.000 Hz auf 10 Hz.
    4. Extrahieren Sie PD-Spuren in einem Fenster, das 1 s vor dem Einsetzen des Stimulus beginnt und 5 s nach dem Stimulus-Offset andauert. Berechnen Sie die durchschnittliche Basis-PD für jeden Stimulus in einem 500-ms-Fenster kurz vor Beginn des Stimulus. Subtrahieren Sie die Basis-PD von diesen Spuren, um die durch den Stimulus hervorgerufene Veränderung der PD zu erhalten.
    5. Berechnen Sie den Durchschnitt der durch den Stimulus hervorgerufenen Parkinson-Veränderungen für jede Stimulusbedingung über die Sitzungen innerhalb jedes Tieres und dann über die Tiere hinweg, um die mittlere Pupillenerweiterungsreaktion auf jede Stimulusbedingung zu erzeugen (z. B. Abbildung 3A).
  3. Wachstumskurvenanalyse (GCA) zur Quantifizierung des zeitlichen Verlaufs von Parkinson-Veränderungen
    ANMERKUNG: Diese Analysemethode bestimmt das Ausmaß und den zeitlichen Verlauf der Pupillenerweiterungsreaktionen und wurde in pupillometrischen Studien an menschlichen Probanden 27,36,40 sowie an Meerschweinchen 49 verwendet.
    1. Verketten Sie vertikal alle Ausgänge von pupil_avg_JOVE.m für alle Sitzungen, Tiere, SNRs und Dämpfungen, um eine Matrix zu erstellen, die die folgenden Spalten enthält: animalID, SNR, Schallpegel und Pupillendurchmesser (1-50). Führen Sie mit dem Code pupil_LME_JOVE.m die Wachstumskurvenanalyse (GCA) durch27,36,40,49.
    2. Passen Sie lineare Mixed-Effect-Modelle mit Schnittpunkten auf Subjektebene als Zufallseffekte und orthogonale Zeitpolynome bis zur Ordnung zwei als feste Effekte an, wobei jedes abweichende SNR als separate Gruppe behandelt wird, an die ansteigende Phase der Pupillendurchmesserspur (0,1 bis 2,1 s nach Einsetzen des Stimulus).
    3. Modellieren Sie die ansteigende Phase der Pupillenspur mit der folgenden Formel36,49:
      Pupillenerweiterung = (Achsenabschnitt + Bedingung) + Zeit1 * (β Zeit1 + β Zeit1: Bedingung) + Zeit2* (β Zeit2+ βZeit2: Bedingung) + r(Subjektebeneabfangen)
      Dabei entsprechen Zeit1 und Zeit2 orthogonalen linearen und quadratischen Zeitpolynomen und βs Gewichten.
    4. Schätzen Sie die mittleren Gewichte (βs) und ihre Standardfehler mit der fitlme-Funktion in MATLAB. Schätzen Sie die statistische Signifikanz der Gewichte mit der Coeftest-Funktion.
    5. Zeichnen Sie für jedes SNR die Gewichte auf, die den Achsenabschnitten, linearen und quadratischen Termen entsprechen, um die Ergebnisse zu visualisieren (Abbildung 3B, C).
  4. Analyse von Studien, die statistisch signifikante Pupillenerweiterungen zeigten
    HINWEIS: Diese Analysemethode bestimmt den Anteil der abweichenden Studien, bei denen eine statistisch signifikante Pupillenerweiterungsreaktion beobachtet wird, und entspricht der Zuverlässigkeit der Pupillenerweiterungsreaktionen.
    1. Wählen Sie ein geeignetes Analysefenster (0,5-1 s), das um den Höhepunkt der Pupillenreaktion zentriert ist (normalerweise ~1,5 s nach Einsetzen des Stimulus). Berechnen Sie die mittlere PD in diesem Analysefenster für alle Standard- und abweichenden Studien.
    2. Bestimmen Sie, ob die mittlere PD für jede der abweichenden Studien größer als 2,33 Standardfehler der gepoolten Verteilung der mittleren PD-Werte für Standardstudien ist. Zählen Sie die abweichenden Studien, die diesen Schwellenwert überschreiten, als Studien, die eine signifikante Pupillenerweiterung zeigen.
    3. Teilen Sie die Anzahl der abweichenden Studien, die eine signifikante Pupillenerweiterung zeigen, durch die Gesamtzahl der abweichenden Studien (für jede Bedingung), um den Anteil der Studien zu quantifizieren, die im Vergleich zu Standard-Stimulus-Studien einen statistisch signifikanten Anstieg der Parkinson-Krankheit zeigen.
    4. Setzen Sie den gesamten sitzungsbezogenen Prozentsatz der Versuche mit signifikanten Pupillenänderungen in jede Zelle eines Zellarrays ein, wobei die Zellen von niedrigerem zu höherem SNR angeordnet sind. Schätzen Sie mithilfe des Codes pupil_threshold_estimate_JOVE.m den Schwellenwert für die Kategorisierung von Call-in-Noise-Kategorisierung.
    5. Zeichnen Sie den Anteil der Studien auf, die einen statistisch signifikanten Anstieg der Parkinson-Krankheit in Abhängigkeit vom SNR zeigen (Abbildung 3D). Verwenden Sie für diese Daten die fitnlm MATLAB-Funktion (in der Statistik-Toolbox), um die psychometrischen Funktionen des Formulars61 anzupassen:
      Ψ(x; α, β, λ) = (1 -λ) * F(x; α, β)
      Dabei ist F die Weibull-Funktion, definiert als
      F(x; α, β) = , figure-protocol-23819α ist der Verschiebungsparameter, β ist der Steigungsparameter und λ ist die Lapse-Rate.

Ergebnisse

Die Pupillometrie wurde an drei männlichen pigmentierten Hausärzten mit einem Gewicht von ~600-1.000 g im Verlauf der Experimente durchgeführt. Wie in diesem Protokoll beschrieben, wurde zur Schätzung der Schwellenwerte für die Kategorisierung von Call-in-Noise ein seltsames Paradigma für die Stimuluspräsentation verwendet. Im seltsamen Paradigma wurden Rufe, die zu einer Kategorie gehörten (Jammern), die bei einem bestimmten SNR in weißes Rauschen eingebettet waren, als Standardreize verwendet (Abbildung 2A) un...

Diskussion

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung der Pupillometrie als nicht-invasive und zuverlässige Methode zur Abschätzung der Hörschwellen bei passiv hörenden Tieren. In Anlehnung an das hier beschriebene Protokoll wurden die Schwellenwerte für die Kategorisierung von Anrufgeräuschen bei normalhörenden Hausärzten geschätzt. Es wurde festgestellt, dass die Schwellenwerte, die mit Hilfe der Pupillometrie geschätzt wurden, mit denen übereinstimmten, die durch operantes Training62 erhalten...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom NIH (R01DC017141), der Pennsylvania Lions Hearing Research Foundation und Mitteln der Abteilungen für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde und Neurobiologie der University of Pittsburgh unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Analog output boardMeasurement Computing Corporation, Norton, MAPCI-DDA02/12
Anechoic foamSonex One, Pinta Acoustic, Minneapolis, MN
Condenser microphoneBehringer, Willich, GermanyC-2
Free-field microphoneBruel & Kjaer, Denmark) Type 4940 
MatlabMathworks, Inc., Natick, MA2018a version
Monocular remote camera and illuminator systemArrington Research, Scottsdale, AZMCU902Infrared LED array + camera with infrared filter
Multifunction I/O Device National Instruments, Austin, TXPCI-6229
Neural interface processorRipple Neuro, Salt Lake City, UTSCOUT
Piezoelectric motion sensorSparkFun Electronics, Niwot, COSEN-10293
Pinch valve Cole-Palmer Instrument Co., Vernon Hills, ILEW98302-02
Programmable attenuatorTucker-Davis Technologies, Alachua, FLPA5
Silicon TubingCole-Parmer~3 mm
Sound attenuating chamberIAC Acoustics
Speaker full-range driverTang Band Speaker, Taipei, TaiwanW4-1879
Stereo AmplifierTucker-Davis Technologies, Alachua, FLSA1
Tabletop - CleanTop OpticalTMC vibration control / Ametek, Peabody, MA
Viewpoint softwareViewPoint, Arrington Research, Scottsdale, AZ

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