Messung der In-vivo-Kinetik von Fettgewebe beim Menschen mit dem Deuterium (2H)-Markierungsansatz

Zusammenfassung

Im Folgenden wird ein Protokoll zur Messung der Kinetik des Fettgewebes beim Menschen in vivo mit der Deuterium (²H)-Markierungsmethode vorgestellt.

Zusammenfassung

Weißes Fettgewebe ist ein hochplastisches Organ, das notwendig ist, um die Energiehomöostase des ganzen Körpers aufrechtzuerhalten. Die Fettgewebsmasse und Veränderungen der Fettmasse oder -verteilung werden durch Änderungen der Synthese und des Abbaus (d. h. des Umsatzes) von Fettzellen und Triacylglycerinen reguliert. Es gibt Hinweise darauf, dass die Art und das Ausmaß der Ausdehnung des subkutanen Fettgewebes (d. h. Hypertrophie vs. Hyperplasie) und der Umsatz die metabolische Gesundheit beeinflussen können, da die Adipogenese mit der Pathogenese von Fettleibigkeit und verwandten Krankheiten in Verbindung gebracht wird. Trotz der potenziellen Rolle des Fettumsatzes für die menschliche Gesundheit besteht ein Mangel an Wissen über die In-vivo-Kinetik von Fettzellen. Dies ist zum Teil auf die langsame Umsatzrate der Zellen im Fettgewebe und die praktische Komplexität der direkten Markierung ihrer Stoffwechselvorläufer in vivo zurückzuführen. Darin beschreiben wir Methoden zur Messung der in vivo Fettkinetik und der Umsatzraten beim Menschen durch den Verzehr von Deuterium (²H)-markiertem Wasser. Der Einbau von ²H in die Desoxyribonukleotideinheiten der DNA in Präadipozyten und Adipozyten liefert ein genaues Maß für die Zellbildung und den Zelltod (Fettumsatz). Insgesamt handelt es sich um einen innovativen Ansatz zur Messung der In-vivo-Fettkinetik und stellt eine wesentliche Abkehr von anderen In-vitro-Bewertungen dar.

Einleitung

Adipositas ist eine Krankheit, die durch ein Übermaß an weißem Fettgewebe (AT) gekennzeichnet ist und ein wesentlicher Risikofaktor für die Entwicklung von Typ-II-Diabetes und Herz-Kreislauf-Erkrankungen^{ist 1}. White AT ist ein hochplastisches Organ, das Energie in Form von Triacylglycerinen (TGs) speichert und für die metabolische Homöostase unerlässlich ist². Weißes AT behält die Fähigkeit zur Expansion, Reduzierung und Umbau im Erwachsenenalter^{bei 3}, und die AT-Masse wird durch dynamische Veränderungen des Adipozytenvolumens (über TG-Synthese und -Abbau), kontinuierliche Adipozytenbildung über die Proliferation und Differenzierung von Präadipozyten (d. h. Hyperplasie oder Adipogenese) und Fettzelltod^{bestimmt 4}.

Es gibt Hinweise darauf, dass es einen wichtigen Zusammenhang zwischen dem subkutanen AT-Umsatz (z. B. Adipozytenbildung und -tod) und der kardiometabolischen Gesundheit gibt ^5,6,7,8, und die Rolle der Adipogenese bei der Pathogenese von Adipositas-bedingten Erkrankungen bleibt umstritten⁴. Über den In-vivo-AT-Umsatz beim Menschen ist jedoch nur wenig bekannt, was zum Teil auf die langsame Umsatzrate der zellulären Komponenten des AT und die Komplexität der direkten Markierung ihrer metabolischen Vorläufer in vivo zurückzuführen ist. Während In-vitro-Methoden einige Erkenntnisse geliefert haben, bieten diese Ansätze keine umfassende In-vivo-Bewertung im natürlichen Umfeld der AT.

Das Hellerstein-Labor⁹ hat eine Methode entwickelt, um den AT-Umsatz in vivo unter Verwendung des Einbaus des stabilen Isotops Deuterium (²H) aus schwerem Wasser (²H₂O) in den AT zu beurteilen (Abbildung 1)¹⁰. Das Protokoll, das an Mäusen und Menschen validiert wurde, beinhaltet eine anfängliche Erhöhung von ²H₂O, ^{um die 2}H Anreicherung des Körperwassers zu erhöhen, gefolgt von einer adäquaten täglichen Aufnahme, um stabile, nahe dem Plateau liegende Anreicherungswerte aufrechtzuerhalten. Die ²H aus dem ²H₂O (d. h. schweres Wasser) werden in die Desoxyribose (dR)-Einheit der Desoxyribonukleotide in der DNA von Fettzellen eingebaut, und die Isotopenanreicherung wird in der DNA mittels Massenspektrometrie und der Anwendung der Massenisotopomerverteilungsanalyse (MIDA) gemessen9,10,11. Die Markierung der Desoxyribose-Einheit von Purin-Desoxyribonukleotiden in DNA mit stabilen Isotopenvorläufern hat mehrere Vorteile gegenüber früheren Methoden, wie z. B. solchen, die die Markierung mit Pyrimidin-Nukleotid-Basen-Anteilen (z. B. von 3-H-Thymidin oder Brom-Desoxyuridin) beinhalteten. Bemerkenswert ist, dass die endogene Wiederinkorporation von Basen, insbesondere von Pyrimidinen, aber nicht von dR, bei der Replikation von DNA zuvor die Interpretation der Inkorporation von Markierungen verwirrte¹². Darüber hinaus bewirkt der Einbau einer stabilen Isotopenmarkierung in dR keine Genotoxizität, im Gegensatz zum Einbau von radioaktiven oder genotoxischen Stoffen wie ³H (Tritium) oder Brom-Desoxyuridin. Daher ist der langfristige Einsatz dieser Technik in Tiermodellen und beim Menschen sicher.

Die Messung der 2-H-markierten DNA-Synthese bezeichnet die Passage einer Zelle durch die S-Phase der Zellteilung und identifiziert neu gebildete Prä-Adipozyten und Adipozyten (über Prä-Adipozyten-Differenzierung) oder Adipogenese¹³. Zellen, die einen schnellen Umsatz durchlaufen (z. B. Monozyten), ersetzen ihre DNA schnell und erreichen ein Plateau in der 2-H-Anreicherung, wodurch sie eine interne Referenz für den Assay darstellen. Das Verhältnis der ²H-Anreicherung von DNA aus Fettzellen zu der von Monozyten (Referenzzellen) bzw. der integrierten ²_H2O-Messung ermöglicht die Berechnung des Anteils neu synthetisierter Fettzellen. Hierin beschreibt dieses Protokoll Verfahren zur Messung der In-vivo-Fettzellumsatzraten (Adipogenese) beim Menschen über das 2-H-Stoffwechselmarkierungsprotokoll, einschließlich verfeinerter Techniken zur Reinigung der Adipozyten durch negative Immunselektion und zur Anreicherung der Präadipozytenpopulation¹⁴.

Protokoll

Das Institutional Review Board (IRB) des Pennington Biomedical Research Center genehmigte alle Verfahren (#10039-PBRC), und alle menschlichen Probanden gaben eine schriftliche Einverständniserklärung.

1. Acht Wochen ²H₂O-Markierungszeitraum

1. Verabreichen Sie Aliquots von entweder 70 % oder 99,9 % deuteriummarkiertem Wasser (²H₂O) in sterilen Kunststoffbehältern.
2. Weisen Sie die Teilnehmer an, in Woche 1 dreimal täglich 35 ml-Dosen mit 99,9 % angereicherten ²H₂O oder 40 ml-Dosen mit 70 % angereicherten ²H₂O zu trinken (Priming-Periode) und in den Wochen 2-8 zwei Dosen von 35 ml bzw. 50 ml pro Tag zu trinken.
   HINWEIS: Vorübergehender Schwindel oder Schwindel sind die einzigen bekannten Nebenwirkungen der Aufnahme von ²H₂O und hängen mit schnellen Veränderungen des Wasserflusses zusammen, die von den Haarfollikeln des Innenohrs wahrgenommen werden. Weisen Sie die Teilnehmer daher an, die Dosen im Abstand von mindestens ~2 Stunden einzunehmen, um das seltene Auftreten von vorübergehendem Schwindel oder Schwindel^{zu vermeiden 15}. Aus dem gleichen Grund sollten Sie vergessene Dosen nicht durch Verdoppelung einer Einzeldosis ausgleichen. Bei Verabreichung der oben beschriebenen Dosis (getrennt durch ≥2 h) ist diese Nebenwirkung beim Menschen äußerst selten (<1% von mehreren hundert Probanden).
3. Überwachen Sie die Einhaltung der ²H₂O-Aufnahme durch Urinentnahmen zur Messung der ²H-Anreicherung im Körperwasser und auch durch die wöchentliche Rückgabe der leeren Fläschchen zur Zählung.
   1. Reinigen Sie die Urinproben mit Aktivkohle und einem Filter.
      1. Geben Sie 8 ml Urin in ein 10 ml-Röhrchen mit 1 ml Aktivkohle.
      2. Legen Sie die Probe für 10 min auf eine Wippe und zentrifugieren Sie sie 5 min lang bei 800 x g , so dass die Holzkohle zum Boden des Röhrchens wandert. Filtrieren Sie die Probe mit einem 0,2 μm Spritzenfilter.
   2. Messen ^{Sie die 2}H₂O-Anreicherung im Körperwasser (Urin) mittels Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (IRMS).
      HINWEIS ^{: Die}2 H₂O-Anreicherung kann mit verschiedenen Methoden analysiert werden, einschließlich Gaschromatographie-Massenspektrometrie¹⁶, Hochtemperatur-Konversionselementanalysator (TC/EA) in Verbindung mit IRMS¹⁷, Resonator-Ring-Down-Infrarotspektroskopie (IRIS)¹⁸ oder mit einem H/Gerät, das an ein Massenspektrometer angeschlossen ist (z. B. IRMS)¹⁹.
   3. Verwenden Sie die mittleren ²H₂O-Anreicherungen, die während des 8-wöchigen Markierungszeitraums im Urin gemessen wurden, um die Vorläufer-2 H₂O-Exposition und den Anteil neu synthetisierter AT-Zellen zu berechnen (siehe Abschnitt 7 und Abschnitt 8 unten).

HINWEIS: Das ²H₂O-Markierungsprotokoll hält die ²H-Anreicherung im Körperwasser in der Nähe des Plateaus für die Dauer des 8-wöchigen Markierungszeitraums im Bereich von 1,0 % bis 2,5 % aufrecht (Abbildung 2)¹⁰.

2. Entnahme von Fettgewebsbiopsien von menschlichen Probanden

1. Nach der Reinigung der Haut mit Povidon-Jod-Lösung ist eine topische Anästhesie (z. B. 2 % Lidocain / 0,5 % Bupivacain) zu verabreichen, ein ~0,75 cm langer Schnitt in der Haut vorzunehmen und subkutane AT-Biopsien über die Nadel-Lipoaspirationstechnik unter sterilen Bedingungen zu entnehmen¹³.
2. Wiegen Sie ein steriles 50-ml-Röhrchen mit 5 mL 1 M HEPES-Puffer bei Raumtemperatur (RT), pH 7,3. Geben Sie den AT sofort zur Verarbeitung in das Röhrchen mit dem HEPES-Puffer.
3. Wiegen Sie das 50-ml-Röhrchen mit dem AT und notieren Sie das Gewicht.

3. Isolierung von gereinigten Adipozyten

1. Geben Sie eine Kollagenase / HEPES-Lösung vom Typ 1 (2 mg/ml) zu 2 g/ml AT.
2. Verdauen Sie das AT, indem Sie es in einem Wasserbad unter Schütteln (100 U/min) für 1 h bei 37 °C inkubieren, bis eine homogene Mischung mit einigen großen, intakten AT-Stücken entsteht.
3. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 x g für 8 min bei RT, um die Adipozyten und die stroma-vaskuläre Fraktion (SVF) zu trennen.
4. Entfernen Sie vorsichtig die obere Fettschicht (Adipozyten) und übertragen Sie sie in ein separates Röhrchen. Brechen Sie das Pellet (SVF) am Boden des Rohres nicht auf.
5. Wie zuvor beschrieben¹⁴, reinigen Sie die Adipozyten durch immunomagnetische Zelltrennung.
   HINWEIS: Dieser wichtige Schritt wird durchgeführt, um die Adipozyten zu "reinigen", da andere Zelltypen mit schnellem Zellumsatz, einschließlich hämatopoetischer, endothelialer und Stammzellen, an den schwimmenden Adipozyten haften und die Messungen beeinflussen können.
   1. Geben Sie ~400 μl Adipozyten in ein 5-ml-Röhrchen für die negative Immunreinigung.
   2. Fügen Sie einen FcR-blockierenden Antikörper (100 μl/ml) hinzu.
   3. Geben Sie einen Cocktail aus biotinylierten Antikörpern gegen Marker von Endothelzellen (Anti-Human-CD31; 1:100), hämatopoetischen Zellen (Anti-Human-CD45; 1:400) und mesenchymalen Stammzellen (Anti-Human-CD34; 1:100) für 15 Minuten bei RT in die Adipozytenlösung.
   4. Geben Sie einen Biotin-Auswahlcocktail (100 μl/ml) in die Adipozytenlösung, mischen Sie gut und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei RT mit leichtem Kippen/Drehen.
   5. Mischen Sie die magnetischen Nanopartikel durch Auf- und Abpipettieren, geben Sie die Partikel (50 μl/ml) in die Adipozytenlösung, mischen Sie gut und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei RT mit sanfter Drehung (10 U/min).
   6. Geben Sie PBS/2% FBS/1 mM EDTA-Puffer in die Adipozytenlösung für ein Gesamtvolumen von 1 ml.
   7. Setzen Sie das Rohr in den Magneten ein und lassen Sie es 5 Minuten lang einwirken.
   8. Nehmen Sie den Magneten auf, drehen Sie den Magneten, der das Röhrchen enthält, in einer kontinuierlichen Bewegung um und gießen Sie den Inhalt in ein neues 5-ml-Röhrchen. Klopfen Sie beim Gießen nicht auf die Tube. Die an die Antikörper gebundenen Zellen werden durch die magnetischen Nanopartikel gebunden und entfernt, während die immungereinigten Adipozyten erhalten bleiben.
   9. Die gereinigten Adipozyten werden in der Flüssigkeit N₂ schockgefroren und bis zur DNA-Extraktion bei -80 °C gelagert.

4. Isolierung von Präadipozyten

1. Um eine angereicherte Population von Präadipozyten zu isolieren, verwenden Sie ein Protokoll, um ihre Fähigkeit zur Bindung an Kunststoff nach einer Kurzzeitkultur des SVF²⁰ zu nutzen.
2. In einer Laminar-Flow-Haube resuspendieren Sie das SVF-Pellet in 5 mL Erythrozyten-Lysepuffer für 5-10 min bei RT (gründlich mischen) und zentrifugieren Sie bei 800 x g. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 % FBS in alpha (α)MEM.
3. Die Zellen auf einer Kunststoff-Kulturschale für ~8-12 h in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C und mit einer 5% CO₂ -Atmosphäre anrichten.
4. Nach ~8-12 h waschen Sie die nicht adhärenten Zellen vorsichtig von der Kulturplatte mit PBS in einer Laminar-Flow-Haube.
5. Nach der Aspiration des PBS 1-1,5 ml 0,25 % Trypsin/1 mM EDTA in die Kulturschale geben, um die adhärenten Zellen abzulösen (angereicherte Population von Präadipozyten). Stellen Sie die Kulturschale für ~5-8 Minuten bei 37 °C in den Inkubator, um die Zellen anzuheben.
6. Geben Sie 10 % FBS/αMEM auf die Platte und waschen Sie die Platte gründlich, um alle Zellen von der Platte zu sammeln. Übertragen Sie die Zelllösung in ein 15 mL oder 50 mL Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 8 Minuten lang bei 800 x g .
7. Entfernen Sie den Überstand und lagern Sie das Pellet (Präadipozyten) bei -80 °C bis zur DNA-Extraktion.

5. Isolierung von Blutmonozyten

HINWEIS: Die Monozyten werden analysiert, um eine (fast) vollständig umgedrehte Zellpopulation darzustellen, und die Messung der 2-H-Anreicherung in den Monozyten kann als Referenzmarker ^{für die}2-H-2O-Exposition bei jedem Individuum verwendet werden. Alternativ kann die ²H₂O Anreicherung des Körpers gemessen und zur Berechnung der ²H₂O Exposition verwendet werden.

1. Entnehmen Sie frisches Vollblut von menschlichen Probanden in Vacutainer-Röhrchen, die EDTA enthalten.
2. Zentrifugieren Sie das Blut bei 1.000-2.000 x g für 15 min bei 4 °C.
   HINWEIS: Betätigen Sie nicht die Bremse.
3. Entfernen Sie die oberste Schicht aus Plasma. Achte darauf, dass du das weiße Buffy-Fell nicht direkt unter dem Plasma berührst.
4. Aspirieren Sie das weiße Buffy-Fell mit einer Transferpipette und übertragen Sie es in ein 50-ml-Röhrchen. Füge ~10 mL PBS zum Buffy Coat hinzu.
5. Geben Sie vorsichtig 10 ml eines Mediums mit Dichtegradient hinzu, um das Buffy Coat zu schichten.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Pipette den Boden des Röhrchens berührt, und werfen Sie vorsichtig aus, so dass sich am Boden eine klare Schicht aus Dichtegradientenmedium befindet. Vermeiden Sie die Einführung von Blasen.
6. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 800 x g für 30 min bei ausgeschalteter Bremse.
7. Pipettieren Sie die weiße Schicht (mononukleäre Fraktion) aus (~10 ml) und führen Sie kreisende Bewegungen mit der Spitze der Transferpipette nahe am Rand aus, berühren Sie jedoch nicht die obere Schicht. In ein neues 50-ml-Röhrchen umfüllen und 10 ml PBS hinzufügen. Bei 800 x g für 5 min zentrifugieren (Bremse nicht betätigen) und den Überstand entsorgen.
8. Geben Sie 5 ml Erythrozyten-Lysepuffer in das Pellet. Mischen und 2 Minuten bei RT ziehen lassen.
9. Geben Sie 5 ml PBS mit 0,1 % BSA in den Erythrozyten-Lysepuffer/die Pelletlösung, zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 800 x g und verwerfen Sie den Überstand.
10. Isolieren Sie die Monozyten als CD14⁺ -Zellen mit Hilfe von immunomagnetischen Kügelchen. Führen Sie die Isolierung der CD14⁺ -Zellen gemäß dem Protokoll des Herstellers durch.
11. Lagern Sie die isolierten Monozyten bis zur DNA-Extraktion bei -80 °C.

6. DNA-Präparation (Isolierung, Hydrolyse und Derivatisierung)

1. Isolieren Sie die DNA aus den Präadipozyten, Adipozyten und Blutmonozyten mit einem DNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Um die Desoxyribonukleoside freizusetzen, hydrolysieren Sie die DNA (~200 μl) enzymatisch über Nacht (nicht länger als 24 h) bei 37 °C in einem 50 μl Enzymhydrolysecocktail, der 1 ml S1-Nuklease, 1 ml Phosphatase-Enzym und 36,8 ml 5x Hydrolysepuffer in 16 mm x 100 mm (10 mL) Glasröhrchen mit Schraubverschluss enthält. Fügen Sie zusätzlich die folgenden Proben hinzu: einen Wasserblindwert, einen Hydrolyse-Cocktail-Rohling, einen Säulenrohling aus dem DNA-Extraktionskit und 500 ng DNA-Standards.
   1. Zur Herstellung des 5x Hydrolysepuffers geben Sie 94 ml molekularbiologisches Reinwasser in ein steriles Becherglas. 3,08 g Natriumacetat und 21,5 mg Zinksulfat abwiegen, Wasser hinzufügen und mischen, bis es sich aufgelöst hat. Stellen Sie den pH-Wert mit Eisessig auf 5,0 ein und testen Sie mit pH-Papier. Fügen Sie Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 100 ml zu erreichen.
   2. Um das Phosphatase-Enzym herzustellen, resuspendieren Sie ein Fläschchen mit saurer Phosphatase in 1 ml reinem Wasser.
   3. Um das 0,5 U/μl S1-Nuklease-Enzym herzustellen, verdünnen Sie 2,5 μl S1-Nuklease in 2 mL 1x Hydrolysepuffer (fügen Sie 1 mL 5x Hydrolysepuffer zu 4 mL reinem Wasser hinzu).
3. Derivatisieren Sie die Hydrolysate zu Pentafluorbenzylhydroxylamin (PFBHA)-Derivaten. Konkret wird den verdauten DNA-Proben, einschließlich der Standards und Leerproben, in 16 mm x 100 mm (10 mL) Schraubverschlussröhrchen direkt Folgendes zugesetzt: 100 μl Pentafluorbenzylhydroxylaminhydrochlorid (PFBHA; 1 mg/ml) und 75 μl Eisessigsäure. (kurz) vortexen, die Fläschchen verschließen und die Hydrolysatproben 30 Minuten lang auf einen auf 100 °C eingestellten Heizblock legen.
4. Nehmen Sie die Proben heraus und lassen Sie sie ~5 Minuten lang auf RT abkühlen. Nach dem Abkühlen werden 2 ml Essigsäureanhydrid und 100 μl 1-Methylimidazol in jedes Röhrchen unter einem Abzug gegeben. Stellen Sie die Röhren für 5 min auf einen 100 °C heißen Heizblock.
5. Entnehmen Sie die Proben und lassen Sie sie dann ~15-20 Minuten abkühlen. Nach dem Abkühlen 3 ml molekularbiologisches Wasser zu jeder Probe hinzufügen, kurz vortexen und 10 Minuten ruhen lassen.
6. Geben Sie 2 ml Dichlormethan (DCM) in die Röhrchen und wirbeln Sie die Proben 15 s lang kräftig ein, um das Derivat in die organische Phase zu extrahieren.
7. Zentrifugieren Sie bei 800 x g für 5 min, um die Phasen zu trennen. Übertragen Sie die untere Dichlormethanschicht vorsichtig in ein sauberes 1,6-ml-GC-Fläschchen.
   HINWEIS: Übertragen Sie keine der wässrigen Phasen, da dies den Hintergrund erhöht.
8. ~20 min lang mit Stickstoff bis zur Trockenheit verdampfen, um das DCM und die restliche Essigsäure zu entfernen, gefolgt von einem ~10 min Trocknen in einem Geschwindigkeitsvakuum bei RT, um alle Spuren der Reagenzien zu entfernen.

7. Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) Analyse der DNA

1. Nach dem Trocknen resuspendieren Sie die PFBHA-Derivate in 150 μl Ethylacetat und verschließen. Als nächstes analysieren Sie auf den Einbau von ²H in die DNA auf einem Gaschromatographie (GC)/Massenspektrometrie-Instrument (MS), das mit einer DB-225-Säule ausgestattet ist, wobei methannegative chemische Ionisation verwendet wird und die Ionen im selektiven Ionenüberwachungsmodus bei m/z 435, m/z 436 und m/z 437 (die die Massenisotopomere M₀, M₁ und M₂ darstellen) gesammelt werden. bzw. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für das verwendete Instrument.
   1. Stellen Sie die GC-Bedingungen wie folgt ein: Säule: 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 μm Filmbeschichtung; Chromatograph: Helium-Trägergas bei 1,0 mL/min konstantem Durchfluss; gepulste split-lose Injektionen; Temperatur des Injektors: 250 °C; MS-Transferleitung: 325 °C; Ofenbedingungen: Anfangstemperatur 100 °C, 2 min halten, bei 40 °C/min auf 220 °C hochfahren, 7,5 min halten, zweite Rampe bei 40 °C/min auf 320 °C hochfahren, 1 min halten. Die Gesamtlaufzeit beträgt 16.0 min. Die typischen dR-Elutionszeiten betragen 10,5 min bzw. 10,8 min für den ersten und zweiten Peak.
   2. Stellen Sie die MS-Bedingungen wie folgt ein: Methannegative chemische Ionisationsquelle mit Detektion im Einzelionenüberwachungsmodus; für dR gesammelte Ionen: m/z 435, m/z 436 und m/z 437 (repräsentieren M₀, M₁ bzw. M₂ Massenisotopomere).
      HINWEIS: Silikonisieren Sie die offene Glasauskleidung mit einem kleinen Stöpsel aus silikonisierter Glaswolle im unteren Teil der Auskleidung. Wechseln Sie diese Einlage häufig (alle ~100 Injektionen).
2. Berechnen Sie die M1-Verhältnisse der Massenisotopomerhäufigkeit in der unangereicherten dR-Ableitung (natürliche Abundanz) wie folgt:
   M1-Verhältnis = M1-Häufigkeit/(Summe der Häufigkeiten M0, M1 und M2)
   Subtrahieren Sie dann die M1-Verhältnisse der natürlichen Häufigkeit von den M1-Verhältnissen im dR der markierten Proben, um die Anreicherungen (überschüssige Isotopenhäufigkeiten oder %EM1)²¹ zu berechnen.
3. Messen Sie die Massenisotopomerhäufigkeiten der (nicht angereicherten) DNA-Standards zu Studienbeginn gleichzeitig über einen Bereich von M0-Ionenhäufigkeiten, der den Bereich der M0-Ionenhäufigkeiten in den analysierten Proben umfasst.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um die "Abundanzsensitivität" der mit GC/MS²² gemessenen Isotopenverhältnisse zu korrigieren.
4. Erstellen Sie ein Diagramm der gemessenen M0-Ionenhäufigkeit im Vergleich zu den gemessenen Massenisotopomer-M1-Verhältnissen in den unmarkierten Standards, um die Probenkonzentration in der Säule zu bestimmen, die für das M1-Massenisotopomer am genauesten ist (d. h. dort, wo sie dem bekannten, berechneten M1-Verhältnis der natürlichen Häufigkeit oder dem "Sweet Spot" am nächsten liegt). Das M1-Verhältnis für dieses unangereicherte dR-Derivat beträgt 0,1669.
5. Injizieren Sie die experimentellen Proben so, dass sie so nah wie möglich im M0-Peakbereich an diesem "Sweet Spot" liegen. Verwenden Sie eine quadratische Regression des M1-Verhältnisses der nicht angereicherten Standards im Vergleich zur M0-Peakfläche, um ein M1-Verhältnis der "angepassten natürlichen Abundanz" für jede Probe bei ihrer jeweiligen M0-Konzentration zu schätzen. Subtrahieren Sie dies vom M1-Verhältnis der Fettzellprobe, um die prozentuale Anreicherung über der natürlichen Abundanz oder %EM1 (Abbildung 3)²³ zu erhalten.
6. Berechnen Sie die theoretische maximale M 1-Anreicherung (EM1*) in den Fettzellen unter Verwendung der Gleichungen²⁴ der Massenisotopomerverteilungsanalyse (MIDA) auf der Grundlage der über den Zeitraum von 8 Wochen integrierten ²H₂O-Exposition des Körpers (gemessen im Urin) (Abbildung 4) oder der zwischenzeitlich gemessenen Monozytenanreicherungen (Schritt 7.5).

8. Berechnung des Anteils neu synthetisierter Zellen oder in vivo Adipogenese

1. Berechnen Sie den Anteil neuer Zellen (%), der ein Maß für die In-vivo-Adipogenese oder die Bildung neu synthetisierter Prä-Adipozyten oder Adipozyten ist, mit der folgenden Formel:
   Anteil der neuen Zellen (%) = [(M 1-Anreicherung in der Probe [Fett-]Zellen)/EM1* (theoretische maximale M_{1-Anreicherung})] x 100
   HINWEIS: *Die 2-H-Anreicherung in Monozyten kann auch als Nenner der Gleichung verwendet werden. Diese Messung in Monozyten stellt einen Referenzzellmarker für die ²H₂O-Exposition bei jedem Individuum dar und kann verwendet werden, um die Berechnungen der theoretischen maximalen M1-Anreicherung aus den ^{gemessenen 2}H₂O-Werten des Körpers zu bestätigen.

Ergebnisse

Das ²H₂O-Markierungsprotokoll (Abschnitt 1) hält die Anreicherung von ²H im Körperwasser in der Nähe des Plateaus im Bereich von 1,0 % bis 2,5 % für die Dauer der 8-wöchigen Markierungsperiode^{aufrecht 10}, wie in Abbildung 2 gezeigt. Eine frühere Studie verwendete das ²H₂O-Markierungsprotokoll, um die Fettkinetik durch den Einbau von ²H in die DNA von Fett...

Diskussion

In-vivo-Bewertungen sind notwendig, um neue Erkenntnisse über die Dynamik des Umsatzes weißer AT und seine Rolle bei Adipositas und verwandten Stoffwechselerkrankungen zu gewinnen, da In-vitro-Bewertungen die natürliche Umgebung der AT nicht umfassen. Obwohl die Verwendung der retrospektiven Radiokohlenstoffdatierung zur Beurteilung der Fettdynamik informativ war ^7,25, ist dieser Ansatz nicht geeignet, um dyn...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-methylimidazole	MilliporeSigma	336092
2H2O	Sigma Aldrich
Acetic anhydride	Aldridge	539996
ACK Lysing Buffer (erythrocyte lysis buffer)	Quality Biological Inc (VWR)	10128-802
Agilent 6890/5973 GC/MS	Agilent
Anti-human CD31 (PECAM-1) Biotin	Invitrogen	13-0319-82
Anti-human CD34 Biotin	Invitrogen	13-0349-82
Anti-human CD45	BioLegend	304004
Antibiotic Antimycotic Solution	MilliporeSigma	A5955
Collagenase type 1	Worthington Biochemical Corporation	LS004196
Deoxyribose (2-deoxy d-ribose)	MilliporeSigma	31170
Deuterium Oxide	MilliporeSigma	756822
DB-225 column (30m, 0.25mm, 0.25um)	J&W Scientific	122-2232
Dichloromethane (DCM)	MilliporeSigma	34856
DNA standard (calf thymus DNA)	MilliporeSigma	D4764
Dneasy Blood and Tissue Kit (DNA extraction kit)	Qiagen	69504
Easy Sep Human Biotin kit	Stem Cell Technologies	17663
EasySep Human CD14 Positive Selection Cocktail	Stem Cell Technologies	18058C
Ethyl acetate	Fisher	EX0241-1
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube	VWR	60819-295
Ficoll-Paque Plus	MilliporeSigma	GE17-1440-02
GC vials (2 mL)	Fisher	C-4011-1W
GC vial inserts	Fisher	C-4011-631; C-4012-530
Glacial acetic acid	Fisher	AC14893-0010
Glass tubes (for hydrolysis)	Fisher	14-959-35AA
HEPES buffer	ThermoFisher	15630080
Hyclone Water, molecular biology grade	Thomas Scientific	SH30538.02
MEM alpha	Fisher Scientific	32561-037
PFBHA (o-(2, 3, 4, 5, 6)-penatfluorobenzylhydroxylamin hydrochloride)	MilliporeSigma	194484
pH indicator strips	Fisher	987618
Phosphatase acid	Calbiochem (VWR)	80602-592
S1 nuclease (from Aspergillus oryzae)	MilliporeSigma	N5661
Sodium sulfate	MilliporeSigma	23913