Medindo a cinética do tecido adiposo in vivo em humanos usando a abordagem de marcação de deutério (2H)

Resumo

Apresenta-se aqui um protocolo para medir a cinética do tecido adiposo in vivo em humanos usando o método de marcação com deutério (²H).

Resumo

O tecido adiposo branco é um órgão altamente plástico necessário para manter a homeostase energética de todo o corpo. A massa do tecido adiposo e as mudanças na massa ou distribuição de gordura são reguladas por mudanças na síntese e quebra (ou seja, renovação) de células adiposas e triacilgliceróis. As evidências sugerem que a maneira e a magnitude da expansão do tecido adiposo subcutâneo (ou seja, hipertrofia vs. hiperplasia) e a renovação podem influenciar a saúde metabólica, pois a adipogênese tem sido implicada na patogênese da obesidade e doenças relacionadas. Apesar do papel potencial do turnover adiposo na saúde humana, há uma falta de conhecimento sobre a cinética in vivo das células adiposas. Isso se deve, em parte, à lenta taxa de renovação das células no tecido adiposo e à complexidade prática de rotular diretamente seus precursores metabólicos in vivo. Aqui, descrevemos métodos para medir a cinética adiposa in vivo e as taxas de renovação em humanos por meio do consumo de água marcada com deutério (²H). A incorporação de ²H nas porções de desoxirribonucleotídeos do DNA em pré-adipócitos e adipócitos fornece uma medida precisa da formação e morte celular (renovação adiposa). No geral, esta é uma abordagem inovadora para medir a cinética adiposa in vivo e representa um afastamento substantivo de outras avaliações in vitro .

Introdução

A obesidade é uma doença caracterizada pelo excesso de tecido adiposo branco (TA) e é um fator de risco significativo para o desenvolvimento de diabetes tipo II e doença cardiovascular¹. O TA branco é um órgão altamente plástico que armazena energia na forma de triacilgliceróis (TGs) e é essencial para a homeostase metabólica². O TA branco retém a capacidade de expandir, reduzir e remodelar durante a idade adulta³, e a massa de TA é determinada por mudanças dinâmicas no volume dos adipócitos (via síntese e quebra de TG), formação contínua de adipócitos por meio da proliferação e diferenciação de pré-adipócitos (ou seja, hiperplasia ou adipogênese) e morte celular adiposa⁴.

As evidências sugerem que existe uma ligação importante entre a renovação subcutânea do TA (por exemplo, formação e morte de adipócitos) e a saúde cardiometabólica ^5,6,7,8, e o papel da adipogênese na patogênese dos distúrbios relacionados à obesidade permanece discutível⁴. No entanto, pouco se sabe sobre a renovação in vivo do AT em humanos devido, em parte, à lenta taxa de renovação dos componentes celulares do AT e à complexidade de rotular diretamente seus precursores metabólicos in vivo. Embora os métodos in vitro tenham fornecido algumas informações, essas abordagens não fornecem uma avaliação abrangente in vivo dentro do ambiente natural do TA.

Um método foi desenvolvido pelo laboratório Hellerstein⁹ para avaliar in vivo o turnover do TA usando a incorporação do isótopo estável deutério (²H) da água pesada (²H₂O) no TA (Figura 1)¹⁰. O protocolo, que foi validado em camundongos e humanos, inclui um aumento inicial de ²H₂O para aumentar o enriquecimento de ²H da água corporal, seguido de ingestão diária adequada para manter valores de enriquecimento estáveis e próximos ao platô. O ²H do ²H₂O (ou seja, água pesada) é incorporado à porção desoxirribose (dR) de desoxirribonucleotídeos no DNA das células adiposas, e o enriquecimento isotópico é medido no DNA por espectrometria de massa e aplicação de análise de distribuição de isotômeros de massa (MIDA) ^{9 , 10 , 11}. A marcação da porção desoxirribose de desoxirribonucleotídeos de purina no DNA com precursores de isótopos estáveis tem várias vantagens em relação aos métodos anteriores, como aqueles que envolviam a marcação com porções de base de nucleotídeos de pirimidina (por exemplo, de ³H-timidina ou bromo-desoxiuridina). É importante notar que a reincorporação endógena de bases, especialmente para pirimidinas, mas não dR, no DNA replicante confundiu anteriormente a interpretação da incorporação do rótulo¹². Além disso, a incorporação de um marcador de isótopo estável em dR não causa genotoxicidade, em contraste com a incorporação de agentes radioativos ou genotóxicos, como ³H (trítio) ou bromo-desoxiuridina. Portanto, o uso a longo prazo dessa técnica em modelos animais e humanos é seguro.

A medição da síntese de DNA marcado com ²H denota a passagem de uma célula pela fase S da divisão celular e identifica pré-adipócitos e adipócitos recém-formados (via diferenciação pré-adipócitos) ou adipogênese¹³. As células que sofrem renovação rápida (por exemplo, monócitos) substituem seu DNA rapidamente e atingem um platô no enriquecimento de ²H, fornecendo assim uma referência interna para o ensaio. A razão entre o enriquecimento de ²H do DNA das células adiposas e o dos monócitos (células de referência) ou a medição de ²H₂O do corpo integrado permite o cálculo da fração de células adiposas recém-sintetizadas. Aqui, este protocolo descreve métodos para medir as taxas de renovação de células adiposas in vivo (adipogênese) em humanos por meio do protocolo de marcação metabólica ²H, incluindo técnicas refinadas para purificar os adipócitos por meio de seleção imunológica negativa e enriquecer a população de pré-adipócitos¹⁴.

Protocolo

O Conselho de Revisão Institucional (IRB) do Pennington Biomedical Research Center aprovou todos os procedimentos (# 10039-PBRC) e todos os seres humanos deram consentimento informado por escrito.

1. Período de rotulagem de oito semanas ²H₂O

1. Administre alíquotas de água marcada com deutério a 70% ou 99,9% (²H₂O) em recipientes plásticos estéreis.
2. Instrua os participantes a beber doses de 35 mL de ²H₂O enriquecido a 99,9% ou doses de 40 mL de ²H₂O enriquecido a 70% três vezes ao dia na semana 1 (período de preparação) e a beber duas doses de 35 mL ou 50 mL, respectivamente, por dia nas semanas 2-8.
   NOTA: Tontura ou vertigem transitória são os únicos efeitos adversos conhecidos da ingestão de ²H₂O e estão relacionados a mudanças rápidas no fluxo de água em massa, que são percebidas pelos folículos pilosos do ouvido interno. Portanto, instrua os participantes a tomar as doses com pelo menos ~ 2 h de intervalo para evitar a rara ocorrência de tontura ou vertigem transitória¹⁵. Pelo mesmo motivo, não compense as doses esquecidas dobrando uma única dose. A administração da dose descrita acima (separada por ≥2 h) torna este efeito adverso extremamente raro em seres humanos (<1% de várias centenas de indivíduos).
3. Monitore a adesão à ingestão ^{de 2}H₂O por meio de coletas de urina para medir o enriquecimento de ²H na água corporal e também pelo retorno semanal dos frascos vazios para contagem.
   1. Limpe as amostras de urina usando carvão ativado e um filtro.
      1. Adicione 8 mL de urina a um tubo de 10 mL com 1 mL de carvão ativado.
      2. Coloque a amostra em um balancim por 10 min e centrifugue por 5 min a 800 x g para que o carvão se mova para o fundo do tubo. Filtrar a amostra com um filtro de seringa de 0,2 μm.
   2. Meça o enriquecimento de ²H₂O na água corporal (urina) por espectrometria de massa de razão isotópica (IRMS).
      NOTA: O enriquecimento de ²H₂O pode ser analisado por diferentes métodos, incluindo cromatografia gasosa-espectrometria de massa¹⁶, analisador elementar de conversão de alta temperatura (TC / EA) acoplado ao IRMS¹⁷, espectroscopia de infravermelho de anel de cavidade (IRIS) ¹⁸ ou com um H / Dispositivo conectado a um espectrômetro de massa (por exemplo, IRMS) ¹⁹ .
   3. Use os enriquecimentos médios de ²H₂O medidos na urina durante o período de marcação de 8 semanas para calcular a exposição do precursor ²H₂O e a fração de células AT recém-sintetizadas (consulte a seção 7 e a seção 8 abaixo).

NOTA ^{: O protocolo}de marcação 2 H₂O mantém o enriquecimento próximo ao platô de ²H na água corporal dentro da faixa de 1,0% a 2,5% durante o período de rotulagem de 8 semanas (Figura 2)¹⁰.

2. Coletas de biópsia de tecido adiposo de seres humanos

1. Após a limpeza da pele com solução de iodopovidona, administre anestesia tópica (por exemplo, lidocaína a 2%/bupivacaína a 0,5%), faça uma incisão de ~0,75 cm na pele e colete biópsias subcutâneas de TA por meio da técnica de lipoaspiração com agulha em condições estéreis¹³.
2. Pese um tubo estéril de 50 mL contendo 5 mL de tampão HEPES 1 M à temperatura ambiente (RT), pH 7,3. Coloque imediatamente o AT no tubo com o tampão HEPES para processamento.
3. Pese o tubo de 50 mL contendo o AT e registre o peso.

3. Isolamento de adipócitos purificados

1. Adicione uma solução de colagenase tipo 1 / HEPES (2 mg / mL) a 2 g / mL AT.
2. Digerir o TA incubando em banho-maria com agitação (100 rpm) durante 1 h a 37 °C até obter uma mistura homogénea com alguns pedaços grandes e intactos de AT.
3. Centrifugue o tubo a 500 x g por 8 min em RT para separar os adipócitos e a fração estromal-vascular (SVF).
4. Remova suavemente a camada superior de gordura (adipócitos) e transfira-a para um tubo separado. Não interrompa o pellet (SVF) no fundo do tubo.
5. Como descrito anteriormente¹⁴, purifique os adipócitos usando a separação celular imunomagnética.
   NOTA: Esta etapa importante é feita para "limpar" os adipócitos, pois outros tipos de células com rápida renovação celular, incluindo hematopoiéticas, endoteliais e células-tronco, podem aderir aos adipócitos flutuantes e impactar as medições.
   1. Coloque ~ 400 μL de adipócitos em um tubo de 5 mL para imunopurificação negativa.
   2. Adicione o anticorpo bloqueador FcR (100 μL / mL).
   3. Adicione um coquetel de anticorpos biotinilados contra marcadores de células endoteliais (anti-CD31 humano; 1:100), células hematopoiéticas (anti-CD45 humano; 1:400) e células-tronco mesenquimais (anti-CD34 humano; 1:100) à solução de adipócitos por 15 min em RT.
   4. Adicione um coquetel de seleção de biotina (100 μL / mL) à solução de adipócitos, misture bem e incube por 15 min em RT com inclinação / rotação suave.
   5. Misture as nanopartículas magnéticas pipetando para cima e para baixo, adicione as partículas (50 μL / mL) à solução de adipócitos, misture bem e incube por 10 min em RT com rotação suave (10 rpm).
   6. Adicione PBS / 2% FBS / 1 mM EDTA tampão à solução de adipócito para um volume total de 1 mL.
   7. Coloque o tubo no ímã e deixe descansar por 5 min.
   8. Pegue o ímã e, em um movimento contínuo, inverta o ímã que contém o tubo e despeje o conteúdo em um novo tubo de 5 mL. Não bata no tubo durante o despejo. As células ligadas aos anticorpos são ligadas pelas nanopartículas magnéticas e removidas, enquanto os adipócitos imunopurificados são retidos.
   9. Congele rapidamente os adipócitos purificados em N₂ líquido e armazene-os a -80 ° C até a extração do DNA.

4. Isolamento de pré-adipócitos

1. Para isolar uma população enriquecida de pré-adipócitos, empregue um protocolo para explorar sua capacidade de se ligar ao plástico após uma cultura de curto prazo do SVF²⁰.
2. Em uma capela de fluxo laminar, ressuspenda o pellet SVF em 5 mL de tampão de lise eritrocitária por 5-10 min em RT (misture bem) e centrifugue a 800 x g. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10% FBS em alfa (α) MEM.
3. Coloque as células em uma placa de cultura de plástico por ~ 8-12 h em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C e com uma atmosfera de 5% de CO₂ .
4. Após ~8-12 h, lave suavemente as células não aderentes da placa de cultura com PBS dentro de uma capela de fluxo laminar.
5. Após aspirar o PBS, adicione 1-1,5 mL de tripsina a 0,25% / 1 mM de EDTA à placa de cultura para separar as células aderentes (população enriquecida de pré-adipócitos). Coloque a placa de cultura na incubadora a 37 °C por ~5-8 min para ajudar a levantar as células.
6. Adicione 10% de FBS / αMEM à placa e lave bem a placa para coletar todas as células da placa. Transfira a solução celular para um tubo de 15 ml ou 50 ml e centrifugue a 800 x g durante 8 min.
7. Remova o sobrenadante e armazene o pellet (pré-adipócitos) a -80 ° C até a extração do DNA.

5. Isolamento de monócitos sanguíneos

NOTA: Os monócitos são analisados para representar uma população celular (quase) completamente virada, e a medição do enriquecimento de ²H nos monócitos pode ser usada como um marcador de referência de ^{exposição a 2}H_2Oem cada indivíduo. Alternativamente, o enriquecimento corporal ^{de 2}H₂O pode ser medido e usado para calcular a exposição ^{de 2}H₂O.

1. Retire sangue total fresco de seres humanos em tubos vacutainer contendo EDTA.
2. Centrifugue o sangue a 1.000-2.000 x g por 15 min a 4 ° C.
   NOTA: Não use o freio.
3. Remova a camada superior de plasma. Tenha cuidado para não tocar na camada branca logo abaixo do plasma.
4. Aspire o revestimento branco com uma pipeta de transferência e transfira-o para um tubo de 50 ml. Adicione ~ 10 mL de PBS ao casaco buffy.
5. Adicione suavemente 10 mL de um meio gradiente de densidade para colocar a camada buffy.
   NOTA: Certifique-se de que a ponta da pipeta toque o fundo do tubo e ejete com cuidado para que haja uma camada clara de meio gradiente de densidade na parte inferior. Evite introduzir bolhas.
6. Centrifugue o tubo a 800 x g por 30 min com o freio desligado.
7. Pipetar (~10 mL) a camada branca (fração mononuclear), fazendo movimentos circulares com a ponta da pipeta de transferência próxima à borda, mas sem tocar a camada superior. Transfira para um novo tubo de 50 mL e adicione 10 mL de PBS. Centrifugue a 800 x g durante 5 min (não utilize o travão) e elimine o sobrenadante.
8. Adicione 5 mL de tampão de lise eritrocitária ao pellet. Misture e deixe descansar por 2 min em RT.
9. Adicione 5 mL de PBS com BSA a 0,1% à solução tampão de lise eritrocitária/pellet, centrifugue a 800 x g por 5 min e descarte o sobrenadante.
10. Isole os monócitos como células CD14 ⁺ usando esferas imunomagnéticas. Realizar o isolamento das células CD14⁺ seguindo o protocolo do fabricante.
11. Armazene os monócitos isolados a -80 ° C até a extração do DNA.

6. Preparação de DNA (isolamento, hidrólise e derivatização)

1. Isole o DNA dos pré-adipócitos, adipócitos e monócitos do sangue usando um kit de extração de DNA seguindo as instruções do fabricante.
2. Para liberar os desoxirribonucleosídeos, hidrolisar enzimaticamente o DNA (~ 200 μL) durante a noite (não mais que 24 h) a 37 ° C em 50 μL de coquetel de hidrólise enzimática contendo 1 mL de nuclease S1, 1 mL de enzima fosfatase e 36,8 mL de tampão de hidrólise 5x em tubos de vidro com tampa de rosca de 16 mm x 100 mm (10 mL). Além disso, inclua as seguintes amostras: um branco de água, um branco de coquetel de hidrólise, um branco de coluna do kit de extração de DNA e 500 ng de padrões de DNA.
   1. Para preparar o tampão de hidrólise 5x, coloque 94 mL de água pura de grau de biologia molecular em um béquer estéril. Pese 3,08 g de acetato de sódio e 21,5 mg de sulfato de zinco, adicione água e misture até dissolver. Ajuste o pH para 5,0 com ácido acético glacial e teste usando papel de pH. Adicione água até atingir um volume total de 100 mL.
   2. Para preparar a enzima fosfatase, ressuspenda um frasco de fosfatase ácida em 1 mL de água pura.
   3. Para preparar a enzima nuclease S1 0,5 U / μL, dilua 2,5 μL de nuclease S1 em 2 mL de tampão de hidrólise 1x (adicione 1 mL de tampão de hidrólise 5x a 4 mL de água pura).
3. Derivatizar os hidrolisados em derivados de pentafluorobenzilhidroxilamina (PFBHA). Especificamente, adicione o seguinte diretamente às amostras de DNA digeridas, incluindo os padrões e brancos, em tubos de tampa de rosca de 16 mm x 100 mm (10 mL): 100 μL de cloridrato de pentafluorobenzil hidroxilamina (PFBHA; 1 mg / mL) e 75 μL de ácido acético glacial. Vortex (brevemente), tampe os frascos e coloque as amostras de hidrolisado em um bloco de aquecimento regulado a 100 ° C por 30 min.
4. Remova as amostras e deixe-as esfriar por ~ 5 min até RT. Após o resfriamento, adicione 2 mL de anidrido acético e 100 μL de 1-metilimidazol a cada tubo sob uma capela de exaustão. Coloque os tubos em um bloco de calor de 100 °C por 5 min.
5. Remova as amostras e deixe-as esfriar por ~ 15-20 min. Depois de esfriar, adicione 3 mL de água de grau de biologia molecular a cada amostra, vortex brevemente e deixe descansar por 10 min.
6. Adicione 2 mL de diclorometano (DCM) aos tubos e vortex as amostras vigorosamente por 15 s para extrair o derivado para a fase orgânica.
7. Centrifugue a 800 x g por 5 min para separar as fases. Transfira cuidadosamente a camada inferior de diclorometano para um frasco de GC limpo de 1,6 mL.
   NOTA: Não transfira nenhuma fase aquosa, pois isso aumentará o fundo.
8. Evaporar até a secura com nitrogênio por ~ 20 min para remover o DCM e o ácido acético residual, seguido por ~ 10 min de secagem em vácuo rápido em RT para remover todos os vestígios dos reagentes.

7. Análise de cromatografia gasosa acoplada ao DNA (GC-MS)

1. Depois de secos, ressuspenda os derivados PFBHA em 150 μL de acetato de etila e tampa. Em seguida, analise a incorporação de ²H no DNA em um instrumento de cromatografia gasosa (GC) / espectrometria de massa (MS) equipado com uma coluna DB-225 usando ionização química negativa de metano e coletando os íons no modo de monitoramento seletivo de íons em m / z 435, m / z 436 e m / z 437 (representando os isótopômeros de massa M₀, M₁ e M₂ , respectivamente). Siga as instruções do fabricante para o instrumento usado.
   1. Defina as condições de GC da seguinte forma: coluna: revestimento de filme de 30 m x 0,25 mm de diâmetro interno x 0,25 μm; cromatógrafo: gás portador de hélio a 1,0 mL/min de fluxo constante; injeções pulsadas sem divisão; temperatura do injetor: 250 °C; Linha de transferência MS: 325 °C; condições do forno: temperatura inicial de 100 °C, segure 2 min, rampa a 40 °C/min a uma temperatura de 220 °C, segure 7.5 min, segunda rampa a 40 °C/min a 320 °C, segure por 1 min. O tempo total de execução é de 16,0 min. Os tempos típicos de eluição de dR são 10,5 min e 10,8 min para o primeiro e segundo picos, respectivamente.
   2. Defina as condições de MS da seguinte forma: fonte de ionização química negativa de metano com detecção no modo de monitoramento de íons únicos; íons coletados para dR: m / z 435, m / z 436 e m / z 437 (representando os isotômeros de massa M₀, M₁ e M₂ , respectivamente).
      NOTA: Siliconize o revestimento de vidro aberto com um pequeno tampão de lã de vidro siliconizada na parte inferior do revestimento. Troque este forro frequentemente (a cada ~ 100 injeções).
2. Calcular as razões M1 da abundância de isótopómeros mássicos na derivada dR não enriquecida (abundância natural) do seguinte modo:
   Razão M1 = abundância M1/(soma das abundâncias M0, M1 e M2)
   Em seguida, subtraia as razões M1 de abundância natural das razões M1 no dR das amostras marcadas para calcular os enriquecimentos (abundância de isótopos em excesso ou %EM1)²¹.
3. Meça as abundâncias de isotômeros de massa dos padrões de DNA de linha de base (não enriquecidos) simultaneamente em uma faixa de abundâncias de íons M0 que abrangem a faixa de abundâncias de íons M0 nas amostras analisadas.
   NOTA: Esta etapa é essencial para corrigir a "sensibilidade à abundância" das proporções de isótopos medidas por GC / MS²².
4. Construa um gráfico da abundância de íons M0 medida versus as razões M1 do isótopo de massa medido nos padrões não rotulados para determinar a concentração da amostra na coluna que é mais precisa para o isótopo de massa M1 (ou seja, onde está mais próximo da razão M1 de abundância natural calculada conhecida, ou o "ponto ideal"). A razão M1 para esta derivada dR não enriquecida é 0,1669.
5. Injetar as amostras experimentais de modo a que fiquem o mais próximo possível da zona do pico M0 deste "sweet spot". Use uma regressão quadrática da razão M1 dos padrões não enriquecidos versus a área do pico M0 para estimar uma razão M1 de "abundância natural ajustada" para cada amostra em sua concentração M0 específica. Subtraia isso da proporção M1 da amostra de células adiposas para produzir o enriquecimento percentual acima da abundância natural, ou %EM1 (Figura 3)²³.
6. Calcule o enriquecimento máximo teórico de M₁ (EM1*) nas células adiposas usando as equações de análise de distribuição de massa isotômera (MIDA)²⁴ com base na exposição corporal ²H₂O (medida na urina) integrada durante o período de 8 semanas (Figura 4) ou nos enriquecimentos de monócitos medidos interinamente (etapa 7.5).

8. Cálculo da fração de células recém-sintetizadas ou adipogênese in vivo

1. Calcular a fração de células novas (%), que é uma medida da adipogénese in vivo ou da formação de pré-adipócitos ou adipócitos recém-sintetizados, utilizando a seguinte fórmula:
   Fração de células novas (%) = [(enriquecimento de M₁ nas células [adiposas] da amostra)/EM1* (enriquecimento máximo teórico de M₁ )] x 100
   NOTA: *O enriquecimento de ²H em monócitos também pode ser usado como denominador da equação. Esta medição em monócitos representa um marcador celular de referência da exposição a ²H₂O em cada indivíduo e pode ser utilizada para confirmar os cálculos do enriquecimento máximo teórico de M₁a partir dos valores medidos de ²H₂O no organismo.

Resultados

O protocolo de rotulagem ²H₂O (seção 1) mantém o enriquecimento próximo ao platô de ²H na água corporal dentro da faixa de 1,0% a 2,5% durante o período de rotulagem de 8 semanas¹⁰, conforme mostrado na Figura 2. Um estudo anterior utilizou o protocolo de marcação ²H₂O para avaliar a cinética adiposa por meio da incorporação de ²H no DNA das célula...

Discussão

Avaliações in vivo são necessárias para fornecer novos conhecimentos sobre a dinâmica da renovação do TA branco e seu papel na obesidade e doenças metabólicas relacionadas, já que as avaliações in vitro não abrangem o ambiente natural do TA. Embora o uso de datação retrospectiva por radiocarbono para avaliar a dinâmica adiposa tenha sido informativo ^7,25, essa abordagem não é adequada para capt...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-methylimidazole	MilliporeSigma	336092
2H2O	Sigma Aldrich
Acetic anhydride	Aldridge	539996
ACK Lysing Buffer (erythrocyte lysis buffer)	Quality Biological Inc (VWR)	10128-802
Agilent 6890/5973 GC/MS	Agilent
Anti-human CD31 (PECAM-1) Biotin	Invitrogen	13-0319-82
Anti-human CD34 Biotin	Invitrogen	13-0349-82
Anti-human CD45	BioLegend	304004
Antibiotic Antimycotic Solution	MilliporeSigma	A5955
Collagenase type 1	Worthington Biochemical Corporation	LS004196
Deoxyribose (2-deoxy d-ribose)	MilliporeSigma	31170
Deuterium Oxide	MilliporeSigma	756822
DB-225 column (30m, 0.25mm, 0.25um)	J&W Scientific	122-2232
Dichloromethane (DCM)	MilliporeSigma	34856
DNA standard (calf thymus DNA)	MilliporeSigma	D4764
Dneasy Blood and Tissue Kit (DNA extraction kit)	Qiagen	69504
Easy Sep Human Biotin kit	Stem Cell Technologies	17663
EasySep Human CD14 Positive Selection Cocktail	Stem Cell Technologies	18058C
Ethyl acetate	Fisher	EX0241-1
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube	VWR	60819-295
Ficoll-Paque Plus	MilliporeSigma	GE17-1440-02
GC vials (2 mL)	Fisher	C-4011-1W
GC vial inserts	Fisher	C-4011-631; C-4012-530
Glacial acetic acid	Fisher	AC14893-0010
Glass tubes (for hydrolysis)	Fisher	14-959-35AA
HEPES buffer	ThermoFisher	15630080
Hyclone Water, molecular biology grade	Thomas Scientific	SH30538.02
MEM alpha	Fisher Scientific	32561-037
PFBHA (o-(2, 3, 4, 5, 6)-penatfluorobenzylhydroxylamin hydrochloride)	MilliporeSigma	194484
pH indicator strips	Fisher	987618
Phosphatase acid	Calbiochem (VWR)	80602-592
S1 nuclease (from Aspergillus oryzae)	MilliporeSigma	N5661
Sodium sulfate	MilliporeSigma	23913