Verlängerung der Lebensdauer von Neutrophilen mit CLON-G und einem In-vitro-Spontantod-Assay

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von CLON-G, um die Lebensdauer der Neutrophilen auf mehr als 5 Tage zu verlängern, und bietet ein zuverlässiges Verfahren zur Beurteilung des Neutrophilentods mit Durchflusszytometrie und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie.

Zusammenfassung

Die durchschnittliche Lebensdauer eines Neutrophilen beträgt weniger als 24 h, was die Grundlagenforschung an Neutrophilen und die Anwendung von Neutrophilenstudien einschränkt. Unsere bisherigen Forschungen zeigten, dass mehrere Signalwege den spontanen Tod von Neutrophilen vermitteln könnten. Es wurde ein Cocktail entwickelt, der gleichzeitig auf diese Signalwege abzielt, Caspasen-lysosomale Membranpermeabilisierung-Oxidationsmittel-Nekroptose-Hemmung sowie Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (CLON-G), der die Lebensdauer der Neutrophilen auf mehr als 5 Tage verlängerte, ohne die Neutrophilenfunktion signifikant zu beeinträchtigen. Gleichzeitig wurde ein zuverlässiges und stabiles Protokoll zur Beurteilung und Bewertung des Neutrophilentods entwickelt. In dieser Arbeit zeigen wir, dass CLON-G die Lebensdauer von Neutrophilen in vitro auf mehr als 5 Tage verlängern kann, und wir zeigen die Verlängerung der Lebensdauer von Neutrophilen mit FACS und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie. Dieser Bericht stellt Verfahren zur Herstellung von CLON-G vor und stellt einen in vitro Spontantodtest von Neutrophilen vor, der für die Untersuchung von Neutrophilen und für die anschließende Untersuchung des Neutrophilentods verwendet werden kann und somit eine zuverlässige Ressource für die Neutrophilengemeinschaft darstellt.

Einleitung

Es ist bekannt, dass Neutrophile ein Arsenal an reichlich zytoplasmatischen Granula, Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH)-Oxidase, antimikrobiellen Enzymen und verschiedenen Organellen enthalten, die sich gegen eindringende Mikroben verteidigen. Darüber hinaus sind sie sehr beweglich und die ersten Zellen, die an die Entzündungsstelle rekrutiert werden, was bedeutet, dass Neutrophile die erste Verteidigungslinie des angeborenen Immunsystems sind ^1,2. Die Granulozyten-Transfusionstherapie ist daher zu einer vielversprechenden klinischen Behandlung für neutropeniebedingte Infektionen geworden, um die Immunität der neutrophilen Granulozyten vorübergehend zu stärken ^3,4,5. Neuere Entdeckungen haben deutlich gezeigt, dass Neutrophile in vielen physiopathologischen Szenarien auch als vielschichtige Effektoren fungieren⁶. Die durchschnittliche Lebenserwartung eines Neutrophilen beträgt weniger als 24 Stunden, so dass die Grundlagenforschung an Neutrophilen und die Anwendung von Neutrophilenstudien aufgrund der Einschränkungen im Zusammenhang mit stabiler Genmanipulation und Langzeitlagerung enorm schwierig sind 7,8,9,10,11 . Es gibt einige Zelllinien, die teilweise einige neutrophile Funktionen aufweisen können, wie z. B. HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 und induzierte pluripotente Stammzellen¹². Diese Zelllinien können eine effektive Genom-Editierung und Kryokonservierung erreichen. Sie unterscheiden sich jedoch immer noch recht stark von den primären Neutrophilen und können daher die Funktionen der Neutrophilen nicht originalgetreu rekapitulieren¹³. Daher stützt sich der größte Teil der Forschung auf diesem Gebiet immer noch auf frisch isolierte primäre Neutrophile. Das Feld beruht immer noch auf der Erzeugung teurer und zeitaufwändiger bedingter Knock-out-Mäuse, um bestimmte Genfunktionen in Neutrophilen zu untersuchen, aber derzeit gibt es keine menschlichen Modelle.

Nachdem wir unsere Anstrengungen unternommen haben, um die heterogenen Prozesse zu erforschen, die am Tod von Neutrophilen beteiligt sind, und die vielfältigen Signalwege, die diese Prozesse regulieren^14,15, wurde kürzlich über eine neue Behandlung namens CLON-G (Caspasen-lysosomale Membranpermeabilisation-Oxidationsmittel-Nekroptose-Hemmung plus Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor) berichtet ¹⁶. CLON-G besteht aus Q-VD-oph (Chinolyl-Valyl-O-methylaspartyl-[-2,6-difluorphenoxy]-methylketon), Hsp70 (Hitzeschockprotein 70), DFO (Deferoxamin), NAC (N-Acetylcystein), Nec-1s (Necrostatin-1s) und G-CSF (Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor). Der Spontantod von Neutrophilen wird durch mehrere Wege vermittelt, darunter Apoptose, Nekroptose und Pyroptose. Q-VD-oph hemmt die Apoptose von Neutrophilen als Pan-Caspase-Inhibitor, indem es auf Caspase 1, Caspase 3, Caspase 8 und Caspase 9 abzielt¹⁷. Die Nekroptose der Neutrophilen ist von einem Signalweg abhängig, an dem die Rezeptor-interagierende Proteinkinase-1 (RIPK1) und das gemischte Kinase-Domänen-ähnliche Protein (MLKL) beteiligt ^sind18. Als RIPK1-Inhibitor hemmen Nec-1s die Nekroptose von Neutrophilen. Hsp70 und DFO können die lysosomale Membranpermeabilisierung (LMP) hemmen, was die Apoptose der neutrophilen Granulozyten¹⁹ und die Pyroptose²⁰ induzieren könnte. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine wichtige Rolle beim Tod von Neutrophilen, indem sie LMP¹⁹ und Apoptose²¹ vermitteln und Überlebenssignale²² hemmen. Als Antioxidans, das die Akkumulation von ROS reduzieren kann, verzögert NAC den Tod von Neutrophilen. Als Wachstumsfaktor aktiviert G-CSF die Überlebenssignale der neutrophilen Granulozyten und hemmt die Calpain-induzierte Apoptose^23,24. Durch die gleichzeitige Ausrichtung auf mehrere spontane Todeswege der Neutrophilen kann die Lebensdauer der Neutrophilen effektiv auf mehr als 5 Tage verlängert werden, ohne ihre Funktion zu beeinträchtigen. Die CLON-G-Behandlung erweitert die Möglichkeiten der Konservierung, des Transports und der Genmanipulation von Neutrophilen, was die Forschung in der Gemeinschaft der Neutrophilen beschleunigen kann. In der Zwischenzeit können die derzeit zugelassenen Protokolle für Zelltod-Assays auf der Grundlage des Wissens über den Tod von Neutrophilen unerwartete Schäden an Neutrophilen verursachen¹⁴, so dass diese Protokolle verfeinert wurden, um für Neutrophilenstudien besser geeignet zu sein. Dieser Bericht enthält detaillierte Protokolle für die Kultivierung von Neutrophilen mit CLON-G und einen In-vitro-Zelltodtest von Maus-Neutrophilen mittels Durchflusszytometrie und Fluoreszenzbildgebung. CLON-G ist sowohl auf Maus- als auch auf menschliche Neutrophile wirksam; Die Mausproben werden hier jedoch demonstriert, um dieses Protokoll zu vereinfachen. Die Konzentration von NAC beträgt 1 mM für Maus-Neutrophile und 10 μM für humane Neutrophile. Hsp70 ist speziesspezifisch und sollte daher entsprechend der Quelle der Neutrophilen eingesetzt werden. Bei diesem Protokoll spielt es keine Rolle, ob und wie Neutrophile aus peripherem Blut oder Knochenmark isoliert werden.

Für die vorliegende Studie wurden Neutrophile aus dem Knochenmark der Maus isoliert, um genügend Neutrophile für die Experimente zu erhalten, da etwa 1 x 10 7-1,5 x 10⁷ Neutrophile aus dem Knochenmark gewonnen werden können, während nur 1 x 10 6 Neutrophile aus dem peripheren Blut einer einzelnen 8-12 Wochen alten C57BL/^6-Maus (beiderlei Geschlechts) isoliert werden können. Es wurde eine Gradientenzentrifugation durchgeführt, um eine mögliche Beschädigung und Aktivierung durch die mechanische Stimulation der FACS-Sortierung oder MACS-Sortierung zu vermeiden.

Protokoll

Das Boston Children's Hospital and State Key Laboratory of Experimental Hematology (SKLEH) Animal Care and Use Committee genehmigte und überwachte alle Verfahren. Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm der Kultivierung von Neutrophilen mit CLON-G und dem In-vitro-Todestest .

1. Verlängerung der Lebensdauer von Neutrophilen mit CLON-G

HINWEIS: Alle genannten Vorgänge und Materialien müssen steril sein. Stellen Sie sicher, dass alle Lösungen gut gemischt und gleichmäßig verteilt sind.

1. Konservierung der CLON-G-Komponenten
   1. Lösen Sie 50 mg Q-VD-oph (siehe Materialtabelle) bis zu einer Endkonzentration von 100 mM auf, indem Sie 973,7 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzufügen, und pipettieren Sie die Flüssigkeit, bis die Mischung klar wird. 50 μl pro Röhrchen aliquotieren und bei −20 °C aufbewahren.
      VORSICHT: DMSO ist eine schädliche chemische Flüssigkeit. Tragen Sie einen Laborkittel, eine Schutzbrille und eine Maske, um Hautkontakt, Augenkontakt und Einatmen zu vermeiden.
   2. Hsp70 (siehe Materialtabelle) bei 4 °C auftauen und den Inhalt der Durchstechflasche herunterschleudern. 1 μl Hsp70 pro Röhrchen auf Eis aliquotieren und bei −80 °C haltbar machen.
      HINWEIS: Hsp70 ist ein Protein; Eine ultrakalte Lagerung ist notwendig, um es stabil zu halten. Vermeiden Sie den Frost-Tau-Zyklus.
   3. 1 mg DFO (siehe Materialtabelle) mit 7,61 ml RPMI 1640 auflösen, um einen Vorrat von 200 μM zu erhalten. Aliquot 500 μl pro Röhrchen und bei −20 °C aufbewahren.
   4. Lösen Sie 0,1 g NAC (siehe Materialtabelle) mit 2,5 ml RPMI 1640 in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen auf und stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7-7,4 ein. Fügen Sie RPMI 1640 zu einem Endvolumen von 3,06 ml hinzu, um ein 200-mM-NAC-Material herzustellen. Filtern Sie es mit einer 0,2 μm Filtereinheit. 500 μl pro Röhrchen aliquotieren und bei −20 °C aufbewahren.
      HINWEIS: Das Auflösen von NAC in dieser hohen Konzentration ist nicht einfach, und Vortexing kann helfen, es aufzulösen. Phenolrot in RPMI 1640 ist ein perfekter Indikator für den pH-Wert; wenn die NAC gerade aufgelöst ist, ist die Farbe gelblich; Passen Sie es an, bis es rosa wird. NAC-Stammlösungen sind bis zu 1 Monat bei −20 °C stabil.
   5. Lösen Sie 10 mg Nec-1s ( siehe Materialtabelle) auf 20 mM mit 1,8 ml DMSO auf und pipettieren Sie die Mischung, bis sie klar wird. 50 μl pro Röhrchen aliquotieren und bei −20 °C aufbewahren. Vor Licht schützen.
   6. 250 μg G-CSF (siehe Materialtabelle) werden mit 1,25 ml RPMI 1640 auf 200 μg/ml gelöst. 50 μl pro Röhrchen aliquotieren und bei 4 °C aufbewahren.
2. Herstellung von 2x CLON-G Nährmedium
   1. Bereiten Sie das Grundmedium vor. Geben Sie 39,5 ml RPMI 1640, 10 ml fötales Kälberserum (FBS) und 0,5 ml Pen-Streptokokken (Antibiotika) in ein 50-ml-Röhrchen, um RPMI 1640 mit 20 % FBS und 1 % PS als Basismedium herzustellen.
      HINWEIS: Diese hohe FBS-Konzentration wird verwendet, um die verlängerte Kultur von Neutrophilen zu gewährleisten, die länger als 5 Tage dauern kann. Wenn die Kultivierungszeit 1-2 Tage beträgt, sind 10%-15% FBS ausreichend.
   2. Tauen Sie alle Stammlösungen der CLON-G-Komponenten auf Eis auf.
   3. Verdünnen Sie 1 μl Hsp70 auf 20 μM durch Zugabe von 606 μl des Basismediums. Verdünnen Sie 1 μl von 200 μg/mL G-CSF auf 20 μg/ml durch Zugabe von 9 μl des Basismediums.
   4. Geben Sie 976 μl Basismedium in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 1 μl Q-VD-oph (100 mM), 10 μl DFO (200 μM), 1 μl Hsp70 (20 μM), 10 μl NAC (200 mM), 1 μl Nec-1s (20 mM) und 1 μl G-CSF (20 μg/ml) hinzu, um 1 ml 2x CLON-G-Medium herzustellen.
      HINWEIS: Das 2x CLON-G Medium sollte sofort nach der Zubereitung verwendet werden. Man kann das 2x CLON-G bei 4 °C zwischenlagern. Übrig gebliebene 20 μM Hsp70 müssen verworfen werden.
3. Kultur der neutrophilen Granulozyten
   1. Isolierung von Mausneutrophilen durch Gradientenzentrifugation im Anschluss an einen früheren Bericht²⁵. Resuspendieren Sie die isolierten Maus-Neutrophilen im Basismedium (1 Million Zellen/100 μL).
      Anmerkungen: Vermeiden Sie es, die Neutrophilen zu aktivieren, indem Sie sie vorsichtig behandeln. Vermeiden Sie Schaumbildung während des gesamten Prozesses.
   2. Geben Sie 500 μl 2x CLON-G-Medium, 400 μl des Basismediums und 100 μl der Zellsuspension auf 24-Well-Kulturplatten ohne Gewebe (siehe Materialtabelle) und pipettieren Sie vorsichtig drei- bis viermal.
      HINWEIS: Hohe Konzentrationen der Komponenten im 2x CLON-G-Medium können die Neutrophilen schädigen; Vermeiden Sie es, sie ohne das Basismedium zu addieren. Die nicht gewebekulturierte Kulturplatte ist notwendig, um eine Adhäsion von Neutrophilen zu vermeiden.
   3. Legen Sie die Kulturplatte glatt in einen Inkubator mit 37 °C und 5 % CO₂ .
      HINWEIS: Es ist nicht erforderlich, das Zellmedium innerhalb von 7 Tagen auszutauschen. Die Endkonzentrationen der CLON-G-Zusammensetzung betragen 50 μM Q-VD-Oph, 1 μM DFO, 10 pM Hsp70, 1 mM NAC, 10 μM Nec-1 s und 10 ng/mL G-CSF.
   4. Färben Sie die kultivierten Neutrophilen mit Wright-Giemsa-Compound-Färbung (siehe Materialtabelle) und analysieren Sie sie mit einem Lichtmikroskop (Abbildung 2A-D). Alternativ kann mit APC-CD11b- und PE-Cy7-Ly6G-Antikörpern gefärbt und mit Durchflusszytometrie (Abbildung 2E-I) analysiert werden, wie zuvor beschrieben²⁶.

2. In-vitro-Spontantodtest von Neutrophilen

1. Durchflusszytometrische Analyse
   1. Kultivieren Sie isolierte Neutrophile in einer Dichte von 1 Million Zellen/ml im Basismedium bei 37 °C und 5 % CO₂. Die 24-Well-Kulturplatte ist nicht gewebekultiviert. Fügen Sie 1 ml Zellmedium pro Vertiefung hinzu.
   2. Lösen Sie 1 g CaCl₂ mit 45 ml Kochsalzlösung auf, um 200 mM_CaCl2 herzustellen. Filtern Sie es mit einer 0,2 μm Filtereinheit. Bei 4 °C haltbar machen.
   3. Bereiten Sie die Färbemischung vor. Geben Sie 7 μl Kochsalzlösung pro Probe in ein 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie 0,4 mg/ml FITC-Annexin-V, 0,5 mg/ml Propidiumiodid (PI) und 200 mM CaCl2-Lösung_zu je 1 μl pro Probe hinzu. Gut mischen. Verwenden Sie die Lösung sofort nach der Zubereitung.
   4. Pipettieren Sie das Zellmedium vorsichtig fünf- bis siebenmal, um es gut zu mischen, und übertragen Sie anschließend 100 μl zu den gewünschten Zeitpunkten in ein Durchflusszytometrieröhrchen.
      Anmerkungen: Vermeiden Sie Schaumbildung während des gesamten Vorganges.
   5. Vortex-Zählperlen (siehe Materialtabelle), um sie gut zu mischen. 10 μl der gut gemischten Zählkügelchen werden in dasselbe Durchflusszytometrieröhrchen wie in Schritt 2.1.4 pipettiert.
   6. Die vorbereitete Färbemischung (Schritt 2.1.3) wird mit 10 μl in das Durchflusszytometrieröhrchen gegeben. Bei Raumtemperatur 5 Minuten vor Licht geschützt inkubieren.
   7. Geben Sie 100 μl Kochsalzlösung in das Röhrchen und mischen Sie es gut, um eine gleichmäßige Verteilung der Zählperlen und -zellen zu gewährleisten.
   8. Führen Sie eine durchflusszytometrische Analyse des Zellmediums durch. Sammeln Sie die Zellen mit einer niedrigen Rate von ~400 Ereignissen/s. Gate der APC-PE-Cy7-Zellen zu FSC-A und SSC-A und die intakten Zellen mit mittleren FSC-A- und SSC-A-Positionen zum FITC-Annexin-V und PE-PI; die Annexin-V^−PI−-Population wird als gesunde Zellen klassifiziert.
      HINWEIS: Die folgenden Gleichungen bestimmen die Gesamtzahl der gesunden Zellen pro Probe und die Lebensfähigkeit der neutrophilen Granulozyten:
      Gesamtzahl gesunder Zellen pro Probe²⁷ = (1.000/Anzahl der zählenden Kügelchen) × Anzahl der Annexin-V⁻PI⁻ Populationen × 10
      Lebensfähigkeit der Neutrophilen = Gesamtzahl der gesunden Zellen zum angegebenen Zeitpunkt/Gesamtzahl der gesunden Zellen zum Zeitpunkt Null
2. Fluoreszenz-Bild-Assay
   1. Kultivieren Sie isolierte Neutrophile in einer Dichte von 1 Million Zellen/ml im Basismedium bei 37 °C und 5 % CO 2 in einer konfokalen Platte mit₂ ml Zellmedium pro Platte.
      HINWEIS: Ein konfokales Fluoreszenzmikroskop hat die beste Bildqualität, aber jedes Fluoreszenzmikroskop mit 488/561/DIC-Kanälen ist ausreichend, um dieses Experiment zu unterstützen.
   2. Nehmen Sie den Teller zum angegebenen Zeitpunkt vorsichtig heraus. Jeweils 10 μl 0,4 mg/ml FITC-Annexin-V, 0,5 mg/ml PI und 200 mM_CaCl2 gleichmäßig auf die Platte geben. Bei Raumtemperatur 5 min färben.
      Anmerkungen: Vermeiden Sie Schütteln während des gesamten Vorganges. Fügen Sie die Färbemittel gleichmäßig und vorsichtig hinzu.
   3. Nehmen Sie Fluoreszenzbilder an 488 (Annexin-V)/561 (PI)/DIC-Kanälen mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop mit einer 20-fach-Objektivlinse auf (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die Belichtungszeit des Kanals 488 auf 500 ms, des Kanals 561 auf 200 ms und des DIC-Kanals auf 100 ms ein. Wählen Sie 5-10 zufällige Bereiche für jede Platte aus. Die Zelltypen sind in unserem bereits veröffentlichten Bericht¹⁴ definiert.

Ergebnisse

Die Wright-Giemsa-gefärbte Morphologie (Abbildung 2A-D) und die FACS-Phänotypen (Abbildung 2E-J) der mit CLON-G behandelten Neutrophilen wurden nicht beeinflusst. Die Viabilität der mit CLON-G behandelten Neutrophilen nach 24 h betrug etwa 90%+, basierend auf der durchflusszytometrischen Analyse (Abbildung 3) und den Fluoreszenzbild-Assays (A...

Diskussion

Neutrophile Granulozyten spielen eine wichtige Rolle bei der angeborenen und adaptiven Immunität, und ihre Homöostase ist streng reguliert. Neutrophile Granulozyten sind die am häufigsten vorkommenden Leukozyten im peripheren Blut des Menschen und haben einen robusten und schnellen Umsatz. Ein gesunder Erwachsener kann täglich 1 x 10⁹ Neutrophile/kg aus dem Knochenmark freisetzen²⁸. Das Absterben der Neutrophilen ist daher zu einem der rätselhaften Rätsel auf diesem Gebiet geworde...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm syringe filter	Pall Corporation	4612	Filtrate prepared CLON-G components.
1.5 mL micro centrifuge tube	LABSELECT	MCT-001-150	Lab consumable.
15 mL Centrifuge Tubes	LABSELECT	CT-002-15	Lab consumable.
24 well cell culture plate	Falcon	351147	Neutrophil culture plate.
50 mL Centrifuge Tubes	LABSELECT	CT-002-50	Lab consumable.
BD LSRII	BD		Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	C4901	Assitant of Annexin-V binding  to phosphatidylserine.
Confocal microscope	Perkinelmer	UltraVIEW VOX	Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.
Confocal plate	NEST	801001-20mm	Lab consumable for fluorescent image assay.
Counting beads	Thermo Fisher	C36950	Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.
DFO	Sigma Aldrich	D9533	Component of CLON-G. LMP inhibitor.
Dimethyl sulfoxide ( DMSO)	Sigma Aldrich	D2650	Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141C	Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.
FITC-Annexin-V	BD	51-65874X	Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.
Hsp70	Abcam	ab113187	Component of CLON-G. LMP inhibitor.
NAC	Sigma Aldrich	A9165	Component of CLON-G. Antioxidant.
Nec-1s	EMD Millipore	852391-15-2	Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.
Penicillin-Streptomycin Solution (PS)	Gibco	15070063	Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.
Propidium Iodide (PI)	BioLegend	421301	For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA  but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.
Q-VD-oph	Selleck chem	S7311	Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.
Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF)	Chugai Pharma China	GRANOCYTE	Component of CLON-G.  Promote neutrophil survival through Akt pathway.
Round-Bottom Polystyrene Tubes	Falcon	100-0102	Lab consumable for flow cytometry analysis.
RPMI1640	Gibco	C11875500BT	Component of neutrophil culture basic medium.
Saline	LEAGENE	R00641	Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Sodium hydroxide (NaOH)	FENG CHUAN	13-011-00029	pH adjustion for NAC.
Wright-Giemsa Stain Solution	Solarbio	G1020	Neutrophil cytospin staining.