Extensão da vida útil dos neutrófilos com CLON-G e ensaio de morte espontânea in vitro

Resumo

Este protocolo detalha a preparação do CLON-G para estender a vida útil dos neutrófilos para mais de 5 dias e fornece um procedimento confiável para avaliar a morte de neutrófilos com citometria de fluxo e microscopia de fluorescência confocal.

Resumo

O tempo médio de vida de um neutrófilo é inferior a 24 horas, o que limita a pesquisa básica sobre neutrófilos e a aplicação de estudos com neutrófilos. Nossa pesquisa anterior indicou que múltiplas vias poderiam mediar a morte espontânea de neutrófilos. Um coquetel foi desenvolvido visando simultaneamente essas vias, caspases-membrana lisossômica permeabilização-oxidante-necroptose inibição mais fator estimulador de colônias de granulócitos (CLON-G), que prolongou a vida útil dos neutrófilos para mais de 5 dias sem comprometer significativamente a função dos neutrófilos. Concomitantemente, um protocolo confiável e estável para avaliação e avaliação da morte de neutrófilos também foi desenvolvido. Neste trabalho, mostramos que o CLON-G pode prolongar a vida útil dos neutrófilos in vitro para mais de 5 dias, e exibimos o prolongamento da vida útil dos neutrófilos com FACS e microscopia de fluorescência confocal. Este relato introduz procedimentos para a preparação de CLON-G e mostra um ensaio in vitro de morte espontânea de neutrófilos, que pode ser usado para o estudo de neutrófilos e para subsequentemente interrogar a morte de neutrófilos, fornecendo assim um recurso confiável para a comunidade de neutrófilos.

Introdução

Os neutrófilos são conhecidos por compreender um arsenal de grânulos citoplasmáticos abundantes, nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase, enzimas antimicrobianas e várias organelas que defendem contra micróbios invasores; Além disso, são altamente móveis e são as primeiras células recrutadas para o local da inflamação, ou seja, os neutrófilos são a primeira linha de defesa do sistema imune inato ^1,2. A terapia de transfusão de granulócitos tornou-se, portanto, um tratamento clínico promissor para infecções relacionadas à neutropenia para aumentar transitoriamente a imunidade neutrofílica ^3,4,5. Descobertas recentes têm mostrado claramente que os neutrófilos também funcionam como efetores multifacetados em muitos cenários fisiopatológicos⁶. O tempo médio de vida de um neutrófilo é inferior a 24 h e, portanto, a pesquisa básica sobre neutrófilos e a aplicação de estudos de neutrófilos são tremendamente difíceis devido às limitações relacionadas à manipulação genética estável e ao armazenamento a longo prazo 7,8,9,10,11 . Existem algumas linhagens celulares que podem apresentar parcialmente algumas funções neutrófilas, como HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 e células-tronco pluripotentes^induzidas12. Essas linhagens celulares podem alcançar edição gênica e criopreservação; no entanto, eles ainda diferem imensamente dos neutrófilos primários e, portanto, não podem recapitular fielmente as funções dos neutrófilos¹³. Assim, a maior parte da pesquisa nesse campo ainda se baseia em neutrófilos primários recém-isolados. O campo ainda depende da geração de camundongos knock-out condicionais caros e demorados para investigar funções gênicas específicas em neutrófilos, mas nenhum modelo humano existe atualmente.

Tendo nos empenhado em explorar os processos heterogêneos envolvidos na morte de neutrófilos e as múltiplas vias que regulam esses processos^14,15, um novo tratamento denominado CLON-G (caspases-membrana lisossômica permeabilização-oxidante-inibição da necroptose mais fator estimulador de colônias de granulócitos) foi recentemente relatado ¹⁶. O CLON-G consiste em Q-VD-oph (quinolil-valil-O-metilaspartil-[-2,6-difluorofenoxi]-metil cetona), Hsp70 (proteína de choque térmico 70), DFO (deferoxamina), NAC (N-acetilcisteína), Nec-1s (necrostatina-1s) e G-CSF (fator estimulador de colônias de granulócitos). A morte espontânea dos neutrófilos é mediada por múltiplas vias, incluindo apoptose, necroptose e piroptose. A Q-VD-OPH inibe a apoptose de neutrófilos como inibidor da pan-caspase, tendo como alvo a caspase 1, caspase 3, caspase 8 e caspase^{9 17}. A necroptose neutrofílica é dependente de uma via de sinalização envolvendo a proteína quinase-1 de interação com o receptor (RIPK1) e a proteína de domínio semelhante ao domínio da linhagem mista de linhagem quinase (MLKL)¹⁸. Como um inibidor de RIPK1, Nec-1s inibem a necroptose de neutrófilos. Hsp70 e DFO podem inibir a permeabilização da membrana lisossômica (LMP), o que poderia induzir apoptose neutrofílica¹⁹ e piroptose²⁰. As espécies reativas de oxigênio (EROs) desempenham papéis vitais na morte de neutrófilos, mediando LMP¹⁹ e apoptose²¹ e inibindo sinais de sobrevivência²². Como um antioxidante que pode reduzir o acúmulo de EROs, NAC retarda a morte de neutrófilos. Como fator de crescimento, o G-CSF ativa sinais de sobrevivência de neutrófilos e inibe a apoptose induzida pela calpaína^23,24. Ao visar simultaneamente múltiplas vias de morte espontânea de neutrófilos, o tempo de vida dos neutrófilos pode ser efetivamente estendido para mais de 5 dias sem comprometer sua função. O tratamento com CLON-G amplia as possibilidades de preservação, transporte e manipulação gênica de neutrófilos, o que pode acelerar a pesquisa na comunidade de neutrófilos. Enquanto isso, com base no conhecimento da morte de neutrófilos, os protocolos atualmente aprovados para ensaios de morte celular podem causar danos inesperados aos neutrófilos¹⁴, de modo que esses protocolos foram refinados para serem mais apropriados para estudos com neutrófilos. Este relatório fornece protocolos detalhados para cultura de neutrófilos com CLON-G e um ensaio in vitro de morte celular de neutrófilos de camundongos usando citometria de fluxo e imagem de fluorescência. O CLON-G é eficaz em neutrófilos humanos e de camundongos; no entanto, as amostras de camundongos são demonstradas aqui para simplificar esse protocolo. A concentração de NAC é de 1 mM para neutrófilos de camundongos e 10 μM para neutrófilos humanos. A Hsp70 é espécie-específica e, portanto, deve ser utilizada de acordo com a fonte do neutrófilo. Para este protocolo, não importa se os neutrófilos são isolados do sangue periférico ou da medula óssea e como são isolados.

Para o presente estudo, os neutrófilos foram isolados da medula óssea de camundongos para obter neutrófilos suficientes para os experimentos, pois cerca de 1 x 10 7-1,5 x 10⁷ neutrófilos podem ser obtidos da medula óssea, enquanto apenas 1 x 10 6 neutrófilos podem ser isolados do sangue periférico de um único camundongo C57BL/⁶ de 8-12 semanas de idade (de ambos os sexos). A centrifugação por gradiente foi realizada para evitar possíveis danos e ativação a partir da estimulação mecânica da classificação FACS ou MACS.

Protocolo

O Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Boston Children's Hospital and State Key Laboratory of Experimental Hematology (SKLEH) aprovou e monitorou todos os procedimentos. A Figura 1 apresenta o fluxograma da cultura de neutrófilos com CLON-G e o ensaio de morte in vitro .

1. Extensão da vida útil dos neutrófilos com CLON-G

NOTA: Todas as operações e materiais mencionados devem ser estéreis. Certifique-se de que todas as soluções estejam bem misturadas e distribuídas uniformemente.

1. Preservação dos componentes do CLON-G
   1. Dissolver 50 mg de Q-VD-oph (ver Tabela de Materiais) para uma concentração final de 100 mM, adicionando 973,7 μL de dimetilsulfóxido (DMSO), e pipetar o líquido até que a mistura fique clara. Alíquota 50 μL por tubo e conservar a -20 °C.
      CUIDADO: O DMSO é um líquido químico nocivo. Use jaleco, óculos e máscara para evitar contato com a pele, contato visual e inalação.
   2. Descongelar a Hsp70 (ver Tabela de Materiais) a 4 °C e girar o conteúdo no frasco para injetáveis. Alíquota 1 μL de Hsp70 por tubo sobre gelo e conservar a -80 °C.
      NOTA: Hsp70 é uma proteína; O armazenamento ultrafrio é necessário para mantê-lo estável. Evite o ciclo de congelamento-descongelamento.
   3. Dissolver 1 mg de DFO (ver Tabela de Materiais) com 7,61 mL RPMI 1640 para obter um estoque de 200 μM. Alíquota 500 μL por tubo e conservar a -20 °C.
   4. Dissolver 0,1 g de NAC (ver Tabela de Materiais) com 2,5 mL de RPMI 1640 em um tubo de centrífuga de 15 mL e ajustar o pH para 7-7,4 com NaOH. Adicione RPMI 1640 a um volume final de 3,06 mL para fazer um estoque NAC de 200 mM. Filtre-o com uma unidade de filtragem de 0,2 μm. Alíquota 500 μL por tubo e conserva a -20 °C.
      NOTA: Dissolver NAC nesta alta concentração não é fácil, e vórtice pode ajudar a dissolvê-lo. O vermelho de fenol no RPMI 1640 é uma indicação perfeita do pH; quando o NAC é apenas dissolvido, a cor é amarelada; ajustá-lo até que fique rosado. As soluções de estoque NAC são estáveis por até 1 mês a -20 °C.
   5. Dissolver 10 mg de Nec-1s (ver Tabela de Materiais) para 20 mM com 1,8 ml de DMSO e pipetar a mistura até ficar clara. Alíquota 50 μL por tubo e conservar a -20 °C. Proteger da luz.
   6. Dissolver 250 μg de G-CSF (ver Tabela de Materiais) para 200 μg/mL com 1,25 mL de RPMI 1640. Alíquota 50 μL por tubo e conservar a 4 °C.
2. Preparo de meio de cultura 2x CLON-G
   1. Prepare o meio básico. Adicionar 39,5 mL de RPMI 1640, 10 mL de soro fetal bovino (SFB) e 0,5 mL de pen-strep (antibióticos) a um tubo de 50 mL para fazer RPMI 1640 com 20% de SFB e 1% de PS como meio básico.
      NOTA: Esta alta concentração de FBS é usada para fornecer a cultura prolongada de neutrófilos, que pode ser superior a 5 dias. Se o tempo de cultivo for de 1-2 dias, 10%-15% FBS é suficiente.
   2. Descongele todas as soluções de estoque dos componentes CLON-G no gelo.
   3. Diluir 1 μL de Hsp70 a 20 μM adicionando 606 μL do meio básico. Diluir 1 μL de 200 μg/mL G-CSF para 20 μg/mL adicionando 9 μL do meio básico.
   4. Adicionar 976 μL de meio básico a um tubo de centrífuga de 15 mL. Adicionar 1 μL de Q-VD-oph (100 mM), 10 μL de DFO (200 μM), 1 μL de Hsp70 (20 μM), 10 μL de NAC (200 mM), 1 μL de Nec-1s (20 mM) e 1 μL de G-CSF (20 μg/mL) para fazer 1 mL de meio 2x CLON-G.
      NOTA: O meio CLON-G 2x deve ser usado imediatamente após o seu preparo. Pode-se armazenar o 2x CLON-G temporariamente a 4 °C. Restos de 20 μM Hsp70 devem ser descartados.
3. Cultura de neutrófilos
   1. Isolar neutrófilos de camundongos por centrifugação por gradiente seguindo relato anterior²⁵. Ressuspender os neutrófilos isolados de camundongos no meio básico (1 milhão de células/100 μL).
      NOTA: Evite ativar os neutrófilos manuseando-os suavemente. Evite espuma durante todo o processo.
   2. Adicionar 500 μL de 2x meio CLON-G, 400 μL do meio básico e 100 μL da suspensão celular a placas de cultura não cultivadas em tecidos de 24 poços (ver Tabela de Materiais) e pipetar suavemente três a quatro vezes.
      NOTA: Altas concentrações dos componentes no meio 2x CLON-G podem danificar os neutrófilos; evite adicioná-los sem o meio básico. A placa de cultura não cultivada em tecidos é necessária para evitar a adesão de neutrófilos.
   3. Colocar a placa de cultura numa incubadora a 37 °C e a 5 % de CO₂ sem problemas.
      NOTA: É desnecessário trocar o meio celular dentro de 7 dias. As concentrações finais da composição do CLON-G são 50 μM Q-VD-Oph, 1 μM DFO, 10 pM Hsp70, 1 mM NAC, 10 μM Nec-1 s e 10 ng/mL G-CSF.
   4. Colorir os neutrófilos cultivados com o composto Wright Giemsa (ver Tabela de Materiais) e analisar com microscópio de luz (Figura 2A-D). Alternativamente, corar com os anticorpos APC-CD11b e PE-Cy7-Ly6G e analisar com citometria de fluxo (Figura 2E-I), conforme descrito anteriormente²⁶.

2. Ensaio in vitro de morte espontânea de neutrófilos

1. Análise por citometria de fluxo
   1. A cultura isolou neutrófilos a uma densidade de 1 milhão de células/mL no meio básico a 37 °C e 5% CO₂. A placa de cultura de 24 poços é não cultivada em tecidos. Adicionar 1 mL de meio celular por poço.
   2. Dissolver 1 g de CaCl 2 com 45 mL de solução salina para produzir 200 mM de CaCl₂. Filtre-o com uma unidade de filtragem de 0,2 μm. Conservar a 4 °C.
   3. Prepare a mistura de coloração. Adicionar 7 μL de solução salina por amostra a um tubo de 1,5 ml e adicionar 0,4 mg/ml de FITC-Anexina-V, 0,5 mg/ml de iodeto de propídio (PI) e 200 mM de solução de CaCl₂ a 1 μL cada por amostra. Misture bem. Use a solução imediatamente após a preparação.
   4. Pipetar suavemente o meio celular cinco a sete vezes para misturar bem, seguido de transferir 100 μL para um tubo de citometria de fluxo nos pontos de tempo desejados.
      OBS: Evite espuma durante todo o processo.
   5. Contas de contagem de vórtices (consulte Tabela de Materiais) para misturá-las bem. Pipetar 10 μL das esferas de contagem bem misturadas para o mesmo tubo de citometria de fluxo que no passo 2.1.4.
   6. Adicionar 10 μL da mistura de coloração preparada (passo 2.1.3) ao tubo de citometria de fluxo. Incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos longe da luz.
   7. Adicione 100 μL de soro fisiológico ao tubo e misture bem para garantir a distribuição uniforme das esferas e células de contagem.
   8. Realizar análise por citometria de fluxo do meio celular. Colete as células a uma taxa baixa com ~400 eventos/s. Portar as células APC-PE-Cy7- para FSC-A e SSC-A, e portar as células intactas com posições médias FSC-A e SSC-A para o FITC-Annexina-V e PE-PI; a população de Anexina-V⁻PI⁻ é classificada como células saudáveis.
      NOTA: As seguintes equações determinam o número total de células saudáveis por amostra e a viabilidade dos neutrófilos:
      Número total de células saudáveis por amostra²⁷ = (1.000/número de contas de contagem) × número de população de Anexina-V⁻PI^{− ×} 10
      Viabilidade de neutrófilos = número total de células saudáveis no tempo indicado/número total de células saudáveis no tempo zero
2. Ensaio de imagem fluorescente
   1. A cultura isolou neutrófilos a uma densidade de 1 milhão de células/mL no meio básico a 37 °C e 5% CO 2 em uma placa confocal com₂ mL de meio celular por placa.
      NOTA: Um microscópio de fluorescência confocal tem a melhor qualidade de imagem, mas qualquer microscópio de fluorescência que tenha canais 488/561/DIC é suficiente para suportar este experimento.
   2. Retire o prato suavemente no momento indicado. Adicionar 10 μL cada de 0,4 mg/mL de FITC-Anexina-V, 0,5 mg/mL IP e 200 mM de CaCl₂ à placa uniformemente. Manchar à temperatura ambiente por 5 min.
      NOTA: Evite agitar durante todo o processo. Adicione os agentes corantes uniforme e suavemente.
   3. Capturar imagens de fluorescência em 488 (annexin-V)/561 (PI)/canais DIC usando um microscópio confocal de fluorescência com uma lente objetiva de 20x (ver Tabela de Materiais). Defina o tempo de exposição do canal 488 como 500 ms, o canal 561 como 200 ms e o canal DIC como 100 ms. Selecione 5-10 áreas aleatórias para cada placa. Os tipos celulares são definidos em nosso relato publicado anteriormente¹⁴.

Resultados

A morfologia corada por Wright-Giemsa (Figura 2A-D) e os fenótipos FACS (Figura 2E-J) dos neutrófilos tratados com CLON-G não foram afetados. A viabilidade dos neutrófilos tratados com CLON-G em 24 h foi de cerca de 90%+ com base na análise por citometria de fluxo (Figura 3) e nos ensaios de imagem fluorescente (Figura 4). Menor vi...

Discussão

Os neutrófilos desempenham papéis vitais na imunidade inata e adaptativa, e sua homeostase é fortemente regulada. Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue periférico humano e têm um turnover robusto e rápido. Um adulto saudável pode liberar 1 x 10⁹ neutrófilos/kg diariamente da medula óssea²⁸. A morte dos neutrófilos tornou-se, portanto, um dos enigmas intrigantes desse campo, e muito esforço tem sido dedicado para melhor compreendê-los. Acredita-se que ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm syringe filter	Pall Corporation	4612	Filtrate prepared CLON-G components.
1.5 mL micro centrifuge tube	LABSELECT	MCT-001-150	Lab consumable.
15 mL Centrifuge Tubes	LABSELECT	CT-002-15	Lab consumable.
24 well cell culture plate	Falcon	351147	Neutrophil culture plate.
50 mL Centrifuge Tubes	LABSELECT	CT-002-50	Lab consumable.
BD LSRII	BD		Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	C4901	Assitant of Annexin-V binding  to phosphatidylserine.
Confocal microscope	Perkinelmer	UltraVIEW VOX	Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.
Confocal plate	NEST	801001-20mm	Lab consumable for fluorescent image assay.
Counting beads	Thermo Fisher	C36950	Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.
DFO	Sigma Aldrich	D9533	Component of CLON-G. LMP inhibitor.
Dimethyl sulfoxide ( DMSO)	Sigma Aldrich	D2650	Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099141C	Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.
FITC-Annexin-V	BD	51-65874X	Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.
Hsp70	Abcam	ab113187	Component of CLON-G. LMP inhibitor.
NAC	Sigma Aldrich	A9165	Component of CLON-G. Antioxidant.
Nec-1s	EMD Millipore	852391-15-2	Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.
Penicillin-Streptomycin Solution (PS)	Gibco	15070063	Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.
Propidium Iodide (PI)	BioLegend	421301	For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA  but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.
Q-VD-oph	Selleck chem	S7311	Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.
Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF)	Chugai Pharma China	GRANOCYTE	Component of CLON-G.  Promote neutrophil survival through Akt pathway.
Round-Bottom Polystyrene Tubes	Falcon	100-0102	Lab consumable for flow cytometry analysis.
RPMI1640	Gibco	C11875500BT	Component of neutrophil culture basic medium.
Saline	LEAGENE	R00641	Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Sodium hydroxide (NaOH)	FENG CHUAN	13-011-00029	pH adjustion for NAC.
Wright-Giemsa Stain Solution	Solarbio	G1020	Neutrophil cytospin staining.