Adjuvante Aktivität von Mycobacterium paratuberculosis bei der Verbesserung der Immunogenität von Autoantigenen während der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein alternatives Protokoll vor, um eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in C57BL/6-Mäusen aktiv zu induzieren, indem wir das immunogene Epitop Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG)_35-55 verwenden, das in einem unvollständigen Freund-Adjuvans suspendiert ist, das die hitzeabgetötete Mycobacterium avium-Subspezies paratuberculosis enthält.

Zusammenfassung

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE), die durch Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) induziert wird, erfordert eine Immunisierung durch ein MOG-Peptid, das in vollständigem Freund-Adjuvans (CFA) mit inaktiviertem Mycobacterium tuberculosis emulgiert ist. Die antigenen Bestandteile des Mykobakteriums aktivieren dendritische Zellen, um T-Zellen zur Produktion von Zytokinen anzuregen, die die Th1-Antwort über Toll-like-Rezeptoren fördern. Daher stehen die Menge und Art der Mykobakterien, die während der antigenen Herausforderung vorhanden sind, in direktem Zusammenhang mit der Entwicklung von EAE. In dieser Arbeit wird ein alternatives Protokoll zur Induktion von EAE in C57BL/6-Mäusen unter Verwendung eines modifizierten unvollständigen Freund-Adjuvans vorgestellt, das den hitzeabgetöteten Mycobacterium avium-Subspezies Paratuberculosis-Stamm K-10 enthält.

M. paratuberculosis, ein Mitglied des Mycobacterium avium-Komplexes, ist der Erreger der Johne-Krankheit bei Wiederkäuern und wurde als Risikofaktor für mehrere menschliche T-Zell-vermittelte Erkrankungen, einschließlich Multipler Sklerose, identifiziert. Insgesamt zeigten Mäuse, die mit Mycobacterium paratuberculosis immunisiert wurden, einen früheren Krankheitsbeginn und einen höheren Schweregrad der Erkrankung als Mäuse, die mit CFA immunisiert wurden, die den Stamm von M. tuberculosis H37Ra in der gleichen Dosis von 4 mg/ml enthielt. Die antigenen Determinanten des Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) Stammes K-10 waren in der Lage, während der Effektorphase eine starke Th1-Zellantwort zu induzieren, die durch eine signifikant höhere Anzahl von T-Lymphozyten (CD4+, CD27+), dendritischen Zellen (CD11c+, I-A/I-E+) und Monozyten (CD11b+, CD115⁺) gekennzeichnet war) in der Milz im Vergleich zu Mäusen, die mit CFA immunisiert wurden. Darüber hinaus schien die proliferative T-Zell-Antwort auf das MOG-Peptid in M. paratuberculosis-immunisierten Mäusen am höchsten zu sein. Die Verwendung eines Enzephalitogens (z. B. MOG_35-55), das in einem Adjuvans emulgiert ist, das M. paratuberculosis in der Formulierung enthält, kann eine alternative und validierte Methode sein, um dendritische Zellen für das Priming von Myelinepitop-spezifischen CD4⁺ T-Zellen während der Induktionsphase von EAE zu aktivieren.

Einleitung

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein gängiges Modell für die Untersuchung menschlicher demyelinisierender Erkrankungen¹. Es gibt verschiedene Modelle der EAE: die aktive Immunisierung mit verschiedenen Myelinpeptiden in Kombination mit potenten Adjuvantien, die passive Immunisierung durch In-vitro-Transfer von myelinspezifischen CD4⁺ -Lymphozyten und transgene Modelle der spontanen EAE². Jedes dieser Modelle verfügt über spezifische Merkmale, die es ermöglichen, verschiedene Aspekte der EAE zu untersuchen, wie z. B. den Beginn, die Effektorphase oder die chronische Phase. Das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein-Modell (MOG) der EAE ist ein gutes Modell, um die immunvermittelten Mechanismen der chronischen Neuroinflammation und Demyelinisierung zu untersuchen, da es durch mononukleäre entzündliche Infiltration, Demyelinisierung in der peripheren weißen Substanz und reduzierte Erholung nach dem Krankheitshöhepunkt^{gekennzeichnet ist 1}.

MOG-EAE wird durch Immunisierung empfänglicher Mäuse mit dem Peptid MOG_35-55 im vollständigen Freund'schen Adjuvans (CFA) induziert, gefolgt von einer intraperitonealen Injektion von Pertussis-Toxin. Dadurch erhöht sich die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke und Myelin-spezifische T-Zellen, die in der Peripherie aktiviert werden, gelangen ins zentrale Nervensystem (ZNS), wo sie reaktiviert werden³. CFA spielt eine Schlüsselrolle bei der Induktion von EAE, indem es die Antigenaufnahme durch antigenpräsentierende Zellen und die Expression von Zytokinen im Zusammenhang mit humoralen und zellvermittelten Reaktionen erhöht⁴. Dieser Mechanismus ist hauptsächlich auf das Vorhandensein von abgetötetem Mycobacterium tuberculosis zurückzuführen, das in Öl emulgiert ist und dessen Bestandteile einen starken Reiz für das Immunsystem darstellen⁵. Tatsächlich steht die Induktion von EAE in direktem Zusammenhang mit der Menge an Mykobakterien, die während der Antigen-Provokation vorhanden ist⁶.

Die Zugabe anderer abgetöteter Mykobakterien, wie z.B. Mycobacterium butyricum, zu unvollständigem Freund-Adjuvans⁷ sowie die Wirkung von Adjuvanskombinationen⁸ können den klinischen Verlauf der EAE modulieren und somit die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse beeinflussen. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), der ätiologische Erreger der Johne-Krankheit bei Wiederkäuern, wurde mit entzündlichen Erkrankungen des menschlichen ZNS in Verbindung gebracht 9, da seine antigenen Komponenten in der Lage sind, bei Patienten mit Multipler Sklerose und Neuromyelitis-optica-Spektrum-Störung^eine starke humorale und zellvermittelte Reaktion hervorzurufen⁹. Daher zeigen wir in diesem Protokoll eine alternative und reproduzierbare Methode zur Induktion von MOG-EAE, indem M. tuberculosis in CFA durch M. paratuberculosis ersetzt wird.

Protokoll

Alle Mausversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Juntendo University School of Medicine genehmigt (Zulassungsnummer 290238) und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health für Tierversuche durchgeführt.

1. Allgemeine Bemerkungen zum Experiment

1. Die Mäuse werden in Einzelkäfigen in der Tierhaltung unter kontrollierten, erregerfreien Bedingungen bei 23 °C ± 2 °C mit 50 % ± 10 % Luftfeuchtigkeit und einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit ad libitum Zugang zu Futter und Wasser untergebracht.
2. Injizieren Sie den Mäusen phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Antigen und CFA und verwenden Sie sie als Negativ- bzw. Positivkontrolle.

2. Herstellung von mykobakteriellen Antigenen

1. Der Stamm M. paratuberculosis K-10 wird in Middlebrook flüssigem Medium 7H9 angereichert mit 10 % OADC (Ölsäure, Albumin, Dextrose, Katalase), 0,005 % Tween 80 und 2 mg/l Mycobactin J 2 Wochen lang in T25-Gewebekulturflaschen bei 37 °C gezüchtet. Beurteilen Sie das Wachstum der Kolonie regelmäßig durch Sichtprüfung.
   VORSICHT: Behandeln Sie M. paratuberculosis in einer Einrichtung der biologischen Sicherheitsstufe 2 (BSL-2).
2. Den 500 ml Erlenmeyerkolben mit einer Suspension von 1,7 ×^{10 5} koloniebildenden Einheiten (KBE)/ml in einem Endvolumen von 200 ml (gleiches Medium wie Schritt 2.1) 1 Woche lang in einem Schüttelinkubator züchten.
   HINWEIS: Da kontaminierende Organismen die Ergebnisse beeinflussen können, müssen die Bakterien auf festem Middlebrook 7H10-Medium inokuliert werden, um die Koloniemorphologie zu bestimmen und die Reinheit mit herkömmlichen PCR-Nachweiskits (Polymerase-Kettenreaktion) für M. paratuberculosis zu überprüfen.
3. Die Bakteriensuspensionen 5-10 min bei 70 °C inaktivieren und bei 3.000 × g 10 min zentrifugieren. Das gewogene Pellet wurde zweimal in PBS gewaschen, durch Beschallung unterbrochen und bei -20 °C gelagert.
4. Übertragen Sie das Pellet in einen sterilen Behälter und frieren Sie es mit Trockeneis oder flüssigem Stickstoff ein. Sofort in eine Gefriertrocknungskammer überführen.
5. Gefriertrocknen (4 h bei -50 °C unter Vakuum) M. paratuberculosis gemäß Maschinenhandbuch.
6. Am Ende der Gefriertrocknung nehmen Sie den Edelstahlbehälter aus dem Gefriertrockner und geben ihn auf eine Bioreinigungsbank. Verwenden Sie einen Edelstahlspatel, um die getrockneten MAP-Klumpen, die an der Innenwand des Edelstahlbehälters haften, zu entfernen und so fein wie möglich zu pulverisieren.
7. Wiegen Sie die pulverisierten Zellen mit einer elektronischen Waage und geben Sie sie manuell in eine aseptische 10-ml-Durchstechflasche mit einer Konzentration von 10 mg/ml.
   HINWEIS: Die Zelldichte wurde als Gramm Trockengewicht pro Liter Probe quantifiziert. Nach 3 Wochen enthält 1 mg (Nassgewicht) bakterielles Zellpellet ca. 2,5 × 10⁸ KBE.

3. Herstellung der MOG _35-55 Emulsion

1. Mahlen Sie den Inhalt einer Durchstechflasche mit getrocknetem M. paratuberculosis (10 mg) mit einem Mörser und Stößel zu einem feinen Pulver und fügen Sie 10 ml zu unvollständigem Freund-Adjuvans hinzu, um eine 10 mg/ml Stammlösung zu erhalten. Bei -4 °C lagern.
2. Vor der Immunisierung wird die Stammlösung auf eine Endkonzentration von 4 mg/ml verdünnt.
3. Das Peptid MOG_35-55 wird in_ddH2Oauf eine Endkonzentration von 2 mg/ml verdünnt und bei -20 °C gelagert.
4. Mischen Sie mit einem Homogenisator die MOG_{35-55-Lösung} (2 mg/ml) mit einem gleichen Volumen Adjuvans (4 mg/ml) aus Schritt 3.2 in einem 5-ml-Röhrchen, bis eine dickflüssige Emulsion entsteht. Geben Sie die Lösung nach jeweils 10 Sekunden des Mischens für 20 Sekunden auf Eis und drehen Sie das Röhrchen, um die gesamte Lösung zurückzugewinnen.
5. Übertragen Sie die Emulsion in eine 1-ml-Spritze, entfernen Sie die gesamte Luft und fügen Sie eine 27-g-Nadel hinzu. Die Emulsion ist nun bereit für die Injektion.
   ANMERKUNG. Da bei der Herstellung ein gewisser Verlust der viskosen Emulsion von MOG_35-55 auftritt, ist es am besten, das 1,5-fache der benötigten Menge herzustellen.

4. Impfung von Tieren

1. Betäuben Sie die Tiere mit Inhalation von Isofluran, um den Stress für die Tiere zu minimieren.
2. Injizieren Sie die Emulsion (200 μl mit 200 μg/Maus MOG_35-55) subkutan in den unteren Rücken.
3. Verabreichen Sie eine Dosis Pertussistoxin (100 μl mit 200 ng/Maus) intraperitoneal an den Tagen 0 und 2 nach der Immunisierung.
   ACHTUNG: Pertussis-Toxin hat eine mehrfach unterdrückende Wirkung auf das Immunsystem; Vermeiden Sie das Verschlucken und den Kontakt mit Augen und Haut.

5. Klinische Bewertung

1. Überwachen Sie die Mäuse täglich auf Gewicht und klinische Symptome. Verwenden Sie das folgende Bewertungssystem: 0 = keine klinischen Symptome; 1 = schlaffer Schwanz; 2 = Beeinträchtigung des Aufrichtungsreflexes und Schwäche der Hintergliedmaßen; 3 = vollständige Lähmung der Hintergliedmaßen; 4 = vollständige Lähmung der Hintergliedmaßen mit teilweiser Lähmung der Vordergliedmaßen; 5 = moribund.
   HINWEIS: Nach der ersten Beobachtung klinischer Symptome erhalten die Tiere einen verbesserten Zugang zu Wasser und Futter. Nagetierfutter wird aufgeweicht und angefeuchtet und dann aus dem Futterbehälter auf den Käfigboden gelegt. Bei dehydrierten Tieren wird eine subkutane Flüssigkeitsergänzung verabreicht oder eine Nagetier-Chow-Aufschlämmung über eine orale Sonde verabreicht. Wenn eine Maus diese Art von Hilfe länger als 3 Tage benötigt, wird eine Euthanasie durchgeführt.
2. Um Schmerzen und Leiden des Tieres zu vermeiden oder zu minimieren, verwenden Sie die folgenden menschlichen Endpunkte: Körpergewichtsverlust von mehr als 20 %, klinischer Wert ≥4,0, Fehlen des Aufrichtungsreflexes bei Punktzahl 3 und wenn das Tier 24 Stunden lang keinen Zugang zu Futter oder Wasser hat.
   HINWEIS: Die Mäuse wurden am 30. Tag nach der EAE-Induktion durch intraperitoneale Injektionen von Pentobarbital (≥150 mg/kg) euthanasiert.

Ergebnisse

Gruppen von C57BL/6-Mäusen (gesamt n = 15/Gruppe) wurden mit MOG_35-55 in einer M. paratuberculosis-haltigen Emulsion oder mit der üblichen Methode mit CFA immunisiert. Alle Gruppen von Mäusen zeigten eine akute monophasische Erkrankung, die durch einen einzigen Höhepunkt der Behinderung nach 14-17 Tagen gekennzeichnet war, gefolgt von einer teilweisen Erholung der Symptome in den nächsten 10 Tagen (Abbildung 1A). Mäuse, die mit dem M...

Diskussion

Wir demonstrierten ein robustes alternatives Protokoll zur aktiven Induktion schwerer EAE in C57BL/6J-Mäusen unter Verwendung des Peptids MOG_35-55 , das in einem Adjuvans mit M. paratuberculosis¹⁰ emulgiert wurde. Die Induktion von EAE durch diese Methode führte zu einer schwereren Erkrankung als diejenige, die durch das gemeinsame Protokoll mit CFA induziert wurde. Dieser Unterschied könnte auf die unterschiedlichen Lipidkomponenten in der Zellwand der Mykobakterien zurück...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-mouse CD115 antibody	Biolegend, USA	135505	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11b antibody	Biolegend, USA	101215	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11c antibody	Biolegend, USA	117313	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD16/32  antibody	Biolegend, USA	101302	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD4  antibody	Biolegend, USA	116004	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD8a  antibody	Biolegend, USA	100753	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse I-A/I-E antibody	Biolegend, USA	107635	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse Ly-6C  antibody	Biolegend, USA	128023	for cytofluorimetry 1:1,000
BBL Middlebrook OADC Enrichment	Thermo Fisher Scientific, USA	BD 211886	for isolation and cultivation of mycobacteria
C57BL/6J mice	Charles River Laboratory, Japan		3 weeks old, male and female
FBS 10279-106	Gibco Life Techologies, USA	42F9155K	for cell culture, warm at 37 °C before use
Freeze Dryer machine	Eyela, Tokyo, Japan	FDU-1200	for bacteria lyophilization
incomplete e Freund’s adjuvant	Difco Laboratories, MD, USA	263810	for use in adjuvant
Middlebrook 7H9 Broth	Difco Laboratories, MD, USA	90003-876	help in the growth of Mycobacteria
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10	ATCC, USA	BAA-968	bacteria from bovine origin
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated	BD Biosciences, USA	743-26880-EA	for use in adjuvant
Mycobactin J	Allied Laboratory, MO, USA		growth promoter
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55	AnaSpec, USA	AS-60130-10	encephalotigenic peptide
Ovalbumin (257-264)	Sigma-Aldrich, USA	S7951-1MG	negative control antigen  for proliferative assay
pertussis toxin solution	Fujifilm Wako, Osaka Japan	168-22471	From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability
Polytron homogenizer PT 3100	Kinematica		for mixing the antigen with the adjuvant
RPMI 1640 with L-glutamine	Gibco Life Techologies, USA	11875093	For cell culture
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	NET027W001MC	for proliferation assay, use (1 μCi/well)
Zombie NIR Fixable Viability Kit	Biolegend, USA	423105	cytofluorimetry, for cell viability