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  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das rekombinante Adeno-assoziierte Virus (rAAV) wird häufig für die klinische und präklinische Genverabreichung eingesetzt. Eine unterschätzte Anwendung für rAAVs ist die robuste Transduktion von kultivierten Zellen, ohne dass eine Aufreinigung erforderlich ist. Für Forscher, die neu in der rAAV sind, stellen wir ein Protokoll für das Klonen von Transgenkassetten, die Produktion von Rohvektoren und die Transduktion von Zellkulturen zur Verfügung.

Zusammenfassung

Rekombinante Adeno-assoziierte virale Vektoren (rAAV) können eine starke und dauerhafte Transgenexpression erreichen, ohne sie in ein breites Spektrum von Gewebetypen zu integrieren, was sie zu einer beliebten Wahl für die Genverabreichung in Tiermodellen und in klinischen Umgebungen macht. Neben therapeutischen Anwendungen sind rAAVs ein nützliches Laborwerkzeug für die Verabreichung von Transgenen, die auf die experimentellen Bedürfnisse und wissenschaftlichen Ziele des Forschers in kultivierten Zellen zugeschnitten sind. Einige Beispiele sind exogene Reportergene, Überexpressionskassetten, RNA-Interferenz und CRISPR-basierte Werkzeuge, einschließlich solcher für genomweite Screenings. rAAV-Transduktionen sind weniger schädlich für Zellen als Elektroporation oder chemische Transfektion und erfordern keine spezielle Ausrüstung oder teure Reagenzien für die Herstellung. Rohe Lysate oder konditionierte Medien, die rAAVs enthalten, können ohne weitere Aufreinigung direkt zu kultivierten Zellen hinzugefügt werden, um viele Zelltypen zu transduzieren – ein unterschätztes Merkmal von rAAVs. Hier stellen wir Protokolle für die grundlegende Klonierung von Transgenkassetten zur Verfügung und zeigen, wie rohe rAAV-Präparate hergestellt und auf kultivierte Zellen angewendet werden. Als Proof of Principle demonstrieren wir die Transduktion von drei Zelltypen, die bisher noch nicht in rAAV-Anwendungen beschrieben wurden: Plazentazellen, Myoblasten und Dünndarmorganoide. Wir diskutieren geeignete Anwendungen für rohe rAAV-Präparate, die Grenzen von rAAVs für die Genübertragung und Überlegungen zur Kapsidwahl. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache, kostengünstige und effektive Methode für Forscher, um eine produktive DNA-Verabreichung in Zellkulturen mit rAAV zu erreichen, ohne dass mühsame Titrations- und Reinigungsschritte erforderlich sind.

Einleitung

Um die molekularen Grundlagen zellulärer Funktionen aufzuklären, ist häufig die Expression transgener DNA in Zellkulturen erforderlich. Um exprimiert zu werden, müssen Transgene die selektive Membran einer Zelle durchdringen und den Zellkern erreichen 1,2. Daher ist die Fähigkeit, die physischen Barrieren der Zelle effektiv zu umgehen und ihre zentralen Prozesse zu manipulieren, eine Notwendigkeit für die Anwendung der Transgenese, um neue biologische Phänomene aufzudecken. Ein Ansatz nutzt die intrinsische Fähigkeit von Viren, fremde DNA zu transportieren und zu exprimieren 3,4.

Das Adeno-assoziierte Virus (AAV) ist eines der kleinsten Säugetierviren: Sein 4,7 Kilobase (kb) großes, einzelsträngiges DNA-Genom enthält zwei Gene, rep (für Replikose) und cap (für Kapsid), die in einem 60-mer-ikosaedrischen Kapsid mit einer Größe von 25 nm verpackt sind. Die rep/cap-Gene verfügen über mehrere Promotoren, Leserahmen und Spleißprodukte, die für mindestens neun einzigartige Proteine kodieren, die für die virale Replikation, Produktion und Verpackung erforderlich sind 5,6. Darüber hinaus enthalten beide Enden des Genoms sekundäre Strukturen, die als invertierte terminale Wiederholungen (ITRs) bezeichnet werden und für die DNA-Replikation, die Genomverpackung und die nachgelagerte Verarbeitung während der Transduktion erforderlich sind 7,8,9,10. Die ITRs sind die einzigen DNA-Elemente, die für die Verpackung des Genoms in das Kapsid erforderlich sind, und daher kann AAV für die Verabreichung von Transgenen kloniert werden, indem die viralen rep/cap-Gene durch regulatorische Elemente und/oder Gene von Interesse nach Wahl des Forschers ersetztwerden 6. Das daraus resultierende rekombinante AAV (rAAV) mit einem manipulierten Vektorgenom (VG) wird in der Klinik häufig für die Gentherapie beim Menschen eingesetzt und hat Erfolge erzielt11. Eine unterschätzte Verwendung des Vektors ist im Labor; rAAVs können die Transgenexpression in kultivierten Zellen effizient erreichen, um die experimentellen Anforderungen eines Forschers zu erfüllen12.

Die gebräuchlichste Methode zur Herstellung von rAAV ist die Triple-Plasmid-Transfektion in HEK293- oder 293T-Zellen (Abbildung 1). Das erste Plasmid, allgemein als cis-Plasmid bezeichnet, enthält das gewünschte Transgen, das von ITRs (pAAV) flankiert wird. Je nach Anwendung sind cis-Plasmide mit gemeinsamen Elementen, wie z.B. starken Promotoren oder CRISPR-basierten Werkzeugen, käuflich zu erwerben. Das zweite ist das pRep/Cap-Plasmid, das die Wildtyp-AAV-Rep- und Cap-Gene enthält, die in-trans bereitgestellt werden – d. h. auf einem separaten, nicht-ITR-haltigen Plasmid, das regulatorische und strukturelle Elemente exprimiert, die dann mit dem cis-Plasmid interagieren – und daher als Trans-Plasmid bezeichnet wird. Neben der physikalischen Umschließung des VG beeinflusst das Kapsid den zellulären Tropismus12,13. Durch die Bereitstellung des Serotyp-spezifischen Cap-Gens in-trans sind Forscher leicht in der Lage, die Transduktionseffizienz zu maximieren, indem sie einen optimierten Kapsid-Serotyp für ihre jeweilige Zielzelle auswählen. Schließlich benötigt AAV als Dependoparvovirus ein Helfervirus, um die rep/cap-Expression seiner viralen Promotoren zu aktivieren, die durch adenovirale Helfergene erreicht wird, die auf einem dritten Plasmid wie pAdΔF614,15 bereitgestellt werden. Nach 72 h Triple-Plasmid-Transfektion kann der Vektor durch wiederholte Gefrier-/Auftauzyklen aus den Produzentenzellen in die Kulturmedien freigesetzt werden. Der gesamte Platteninhalt wird dann gesammelt und große Zelltrümmer werden durch Zentrifugation entfernt. Der resultierende Medienüberstand ist ein rohes rAAV-Präparat, das für nachgeschaltete Transduktionen bereit ist.

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Abbildung 1: Überblick über die rohe rAAV-Vektorproduktion. Die rohe rAAV-Produktion und -Transduktion kann innerhalb von 5 Tagen durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

rAAV kann für die Verabreichung von Transgenen günstiger sein als andere Transfektionsmethoden, die üblicherweise mit zellulärer Toxizität, geringer Effizienz und teuren Reagenzien und Geräten in Verbindung gebracht werden, wie z. B. für die Elektroporation oder die Transfektion auf chemischer/lipidbasierter Basis16,17. rAAV umgeht diese Hindernisse und bietet oft eine starke Transgenexpression mit minimaler Toxizität und minimalem Hands-on-Zeitaufwand. Wichtig ist, dass die Herstellung von rAAV und seine Anwendung in der Zellkultur einfach ist und nur selten eine Aufreinigung des Vektors aus dem Kulturmedium erfordert (Abbildung 1). Darüber hinaus integriert rAAV seine VG im Gegensatz zur Lentiviralen Transgenabgabe nicht in das Wirtsgenom und senkt so das Risiko einer insertionellen Mutagenese18. Trotz der potenziellen Vorteile der Verwendung von rAAV für die Verabreichung von Transgenen müssen Einschränkungen berücksichtigt werden. Wichtig ist, dass die Größe des Transgens, einschließlich der ITRs, aufgrund der physikalischen Einschränkungen des Kapsids 4,9 kb nicht überschreiten sollte, wodurch die Fähigkeit eines Forschers, große regulatorische Elemente und Transgene effektiv zu verabreichen, eingeschränkt wird. Da rAAV ein nicht-integrierendes Virus ist, führt die Transduktion zu einer vorübergehenden Transgenexpression in sich teilenden Zellen und ist für eine stabile Expression möglicherweise nicht praktikabel. Methoden mit dualem rAAV-verabreichtem Cas9 und HDR-Templates (Homology-Directed Repair) können jedoch verwendet werden, um Sequenzen stabil an bestimmten genomischen Loci einzufügen, wenn ein Forscher dies wünscht19.

Protokoll

1. Plasmid-Akquisition

HINWEIS: Bei diesem Protokoll wird ein Gen of Interest (GOI) in ein ITR-haltiges Plasmid mit einem Cytomegalievirus (CMV)-Promotor und einer SV40-Polyadenylierungssequenz (pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40) geklont. Dieses Plasmid kann jedoch ohne weitere Klonierung zur Herstellung von rAAVs verwendet werden, wobei ein praktischer dualer EGFP- und Luciferase-Reporter verpackt ist. Plasmide mit unterschiedlichen regulatorischen Elementen oder für unterschiedliche Anwendungen, z. B. für CRISPR-basierte Experimente, sind online verfügbar und folgen ähnlichen Klonierungsschritten wie die folgenden (siehe Diskussion für weitere Klonierungsschritte). Darüber hinaus können rep/cap- oder trans-Plasmide für verschiedene Serotypen verwendet werden – dieses Protokoll verwendet rep/cap für AAV-Serotyp 2.

  1. Kaufen Sie bakterielle Stiche, die ein ITR-haltiges cis-Plasmid , ein Adenovirus-Helferplasmid, ein Rep/Cap-Plasmid und ein Plasmid mit einer GOI enthalten. Streichen Sie die Bakterien auf einzelne Agarplatten, die Antibiotika enthalten, die spezifisch für die Resistenz jedes Plasmids sind. Inkubieren Sie die Bakterien über Nacht bei 30 °C, um zu wachsen.
    HINWEIS: Wenn ein Plasmid mit einer indonesischen Regierung nicht ohne weiteres erhältlich ist, kann ein synthetisches DNA-Fragment (siehe Materialtabelle) online erworben werden. Darüber hinaus kann ein synthetisches DNA-Fragment verwendet werden, um den gesamten PCR-Prozess auf Wunsch zu überspringen.
  2. Wählen Sie eine einzelne Kolonie von jeder Platte aus und züchten Sie 3 ml Luria Bertani (LB)-Puffer, ergänzt mit dem entsprechenden Antibiotikum, bei 30 °C über Nacht und schütteln Sie bei 180 U/min. 1 ml der Bakterien wird in einen sterilen 250-ml-Erlenmeyerkolben überführt, der 50 ml LB-Puffer enthält, der mit dem entsprechenden Antibiotikum ergänzt wurde. Über Nacht bei 30 °C bei 180 U/min schütteln.
  3. Die Bakterien in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführen und 20 Minuten lang bei 3.000 x g Raumtemperatur zentrifugieren. Überstand verwerfen. Isolieren Sie das Plasmid mit einem endotoxinarmen oder -freien Midiprep-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    HINWEIS: ITRs sind instabile Strukturen. Um ITR-Deletionen oder -Mutationen zu verhindern, sollten Bakterienzellen bei 30 °C gezüchtet werden, um die Zellteilung zu verlangsamen und Fehler bei der Replikation zu vermeiden. Um die Plasmidausbeute und -reinheit zu erhöhen, ist ein Midiprep- oder Maxiprep-Kit ideal. Es wird empfohlen, ein endotoxinarmes oder -freies Kit zu verwenden, um die nachgeschaltete Endotoxinkontamination von Zellen zu reduzieren. Es ist nicht notwendig, eine Plasmidisolierung in einer Laminar-Flow-Haube durchzuführen, da eine Kontamination der Plasmidpräparation unwahrscheinlich ist, wenn sie auf einer Standardbank durchgeführt wird.

2. Klonierung des interessierenden Gens in AAV-ITR-haltiges Plasmid

  1. Öffnen Sie die Plasmidkarte mit der GOI in einer DNA-Anzeigesoftware.
    HINWEIS: Die volle Kassette, einschließlich der ITRs, sollte 4,9 kb nicht überschreiten, da die physische Verpackung des Kapsids begrenzt ist. Darüber hinaus kann die PCR-Amplifikation aufgrund von Sekundärstrukturen nicht durch ITRs erreicht werden. Daher wird die Gibson-Assemblierung nicht für die Klonierung von rAAV-Transgenen empfohlen.
    1. Klicken Sie auf die Registerkarte Sequenz, um die vollständige Sequenz des Plasmids anzuzeigen. Scrollen Sie zur äußersten 5'-Region der GOI-Sequenz und klicken Sie auf das erste Nukleotid , während Sie es nach innen in Richtung des Genkörpers ziehen, um einen Vorwärtsprimer zu erstellen. Freisetzen, sobald eine Schmelztemperatur (Tm) von ~55 °C erreicht ist.
    2. Klicken Sie auf Forward Primer. Fügen Sie die Sequenz für eine EcoRI-Restriktionsstelle (5' GAATTC 3') manuell am äußersten Ende der Primersequenz von 5' ein. Zusätzlich fügen Sie sechs zusätzliche zufällige Basen am 5'-Ende dieser Restriktionsstelle hinzu, damit das Enzym effizient mit der DNA interagieren kann. Klicken Sie auf Primer hinzufügen. Abbildung 2 zeigt ein repräsentatives Beispiel.
    3. Überprüfen Sie den Primer, um sicherzustellen, dass er keine Haarnadeln oder Primer-Dimere bilden kann (mit Ausnahme der Restriktionsstelle, die palindromisch ist). Wenn sich Haarnadeln bilden, ändere die zufällige Reihenfolge der sechs zusätzlichen Basen. Stellen Sie außerdem sicher, dass der Primer an keiner anderen Stelle des Plasmids bindet.
    4. Wiederholen Sie die Schritte, um einen umgekehrten Primer in der 3'-Region des GOI nach innen zum Genkörper zu erstellen. Klicken Sie auf Reverse Primer und fügen Sie eine NotI-Restriktionsseite hinzu (5' GCGGCCGC 3').
      HINWEIS: Die indonesische Regierung darf keine EcoRI- oder NotI-Restriktionsstellen enthalten – in diesem Fall müssen andere Restriktionsenzyme verwendet werden.
  2. Die indonesische Regierung wird in einer 50-μl-PCR-Reaktion amplifiziert. Verwenden Sie die erforderlichen Einzelkomponenten aus Tabelle 1.
    1. Geben Sie die Reaktion in einen Thermocycler und folgen Sie den Zyklusparametern aus Tabelle 2 zur Programmierung. Wenn Primer unterschiedliche T m haben, verwenden Sie das untere Tm für das Programm.
    2. Überprüfen Sie die Amplifikation des korrekten PCR-Fragments, indem Sie 1 μl Gelbeladungsfarbstoff (6x) zu 5 μl PCR-Reaktion hinzufügen. Eine DNA-Leiter und die PCR-Mischung auf ein 0,8%iges Agarose-Gel mit Ethidiumbromid auftragen und mit UV-Licht visualisieren.
      VORSICHT: Ethidiumbromid ist ein bekanntes Mutagen.
    3. Wenn eine einzelne, spezifische Bande auf dem Gel erscheint, reinigen Sie das verbleibende PCR-Produkt im PCR-Streifenröhrchen mit einem säulenbasierten PCR-Reinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Wenn mehrere Banden auftreten (aufgrund einer unspezifischen Amplifikation), schneiden Sie die gewünschte Bande heraus und reinigen Sie die DNA mit einem Gelextraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  3. Das gereinigte PCR-Produkt und das Rückgratplasmid pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 werden in einer 50-μl-Reaktion mit den erforderlichen Einzelkomponenten aus Tabelle 3 für 1 h bei 37 °C verdaut. Eine größere Menge an pAAV-Plasmid-DNA ist erforderlich, da nach der Gelextraktion eine ineffiziente Ausbeute zu erwarten ist.
    HINWEIS: Bei den verwendeten Restriktionsenzymen handelt es sich um High-Fidelity-Versionen (HF). Regular NotI kann nicht mit dem CutSmart-Puffer verwendet werden. Wenn unterschiedliche Enzyme verwendet werden, kann eine andere Inkubationstemperatur und ein anderer Puffer erforderlich sein.
    1. Reinigen Sie das verdaute PCR-Produkt mit einem säulenbasierten PCR-Reinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    2. Bereiten Sie das verdaute Rückgratplasmid pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 für die Gelelektrophorese vor, indem Sie 10 μl Gelbeladungsfarbstoff (6x) zu 50 μl Verdauungsreaktion hinzufügen. Laden Sie eine DNA-Leiter, eine Verdauungsreaktion und 250 ng unverdautes Plasmid (Negativkontrolle) auf ein 0,8%iges Agarose-Gel, das Ethidiumbromid mit breiten Zähnen enthält. Visualisieren Sie mit UV-Licht, entfernen Sie das gewünschte Fragment (~4,5 kb) und reinigen Sie die DNA mit einem Gelextraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  4. Das verdaute PCR-Produkt und das verdaute pAAV-Rückgratplasmid werden in einer 20-μl-Ligationsreaktion mit den erforderlichen Einzelkomponenten aus Tabelle 4 ligiert. Um die Menge der benötigten PCR-Produkte zu berechnen, verwenden Sie Formel 1. In der Regel wird ein molares Verhältnis von 3:1 zwischen PCR-Produkt (Einsatz) und Rückgrat (pAAV) mit einer Masse von 50 ng Rückgrat verwendet.
    figure-protocol-8107Formel 1
  5. Führen Sie eine Negativkontrolle durch, indem Sie das PCR-Produkt durch Wasser ersetzen. Ligaturreaktionen bei 16 °C über Nacht oder 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  6. Tauen Sie ein Fläschchen mit kompetenten, rekombinationsdefizienten Bakterienzellen (z. B. Stbl3-Zellen) auf Eis auf und geben Sie 50 μl in ein 1,5-ml-Röhrchen. Geben Sie 3 μl der Ligationsreaktion direkt auf die Zellen und inkubieren Sie 30 Minuten lang auf Eis.
    HINWEIS: ITRs sind instabile Strukturen und erfordern daher rekombinationsarme Bakterienstämme, um die ITR-Deletion und Rekombinationsereignisse zu begrenzen. DH5α-Zellen können intermittierend (ein- oder zweimal) zur Vermehrung verwendet werden, werden jedoch nicht für den langfristigen Gebrauch empfohlen. Die ITR-Integrität sollte nach der Midiprep-Aufreinigung regelmäßig überprüft werden.
    1. Die Bakterien werden in einem 42 °C warmen Wasserbad 30 s lang einem Hitzeschock unterzogen und dann sofort für 2 Minuten auf Eis gelegt. 200 μl LB-Puffer zugeben und 1 h bei 30 °C und 180 U/min schütteln.
    2. 125 μl der Mischung mit dem entsprechenden Antibiotikum auf eine Agarplatte verteilen und über Nacht (~18 h) bei 30 °C inkubieren. Wählen Sie mehrere Klone aus und geben Sie sie jeweils in ein steriles Plastikkulturröhrchen mit 3 ml LB, das das entsprechende Antibiotikum enthält. Über Nacht unter Schütteln bei 30 °C, 180 U/min inkubieren.
      HINWEIS: Um ITR-Deletionen oder -Mutationen zu verhindern, sollten Bakterienzellen bei 30 °C gezüchtet werden, um die Zellteilung zu verlangsamen und Fehler bei der Replikation zu minimieren. Darüber hinaus sollten kleinere Kolonien ausgewählt werden, da solche ohne ITRs einen Wachstumsvorteil gegenüber anderen haben können.
    3. Pipettieren Sie 1,8 ml jeder Kultur in ein 2-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei 6.000 x g für 3 Minuten bei Raumtemperatur. Isolieren Sie die DNA mit einem Miniprep-Kit. Die restlichen 1,2 ml Kultur werden bei 4 °C gelagert. Verifizieren Sie korrekte Klone durch DNA-Sequenzierung oder diagnostischen Restriktionsenzymverdau.
      HINWEIS: Die Sanger-Sequenzierung des Einsatzes wird empfohlen, aber die Prozessivität durch ITRs ist mit Standardmethoden nicht erreichbar. ITRs sollten wie unten beschrieben durch einen Restriktionsdigest verifiziert werden.
    4. 50 ml LB-Puffer mit dem entsprechenden Antibiotikum in einen sterilen 250-ml-Erlenmeyerkolben geben. 500 μl der verbleibenden Kultur werden in den Kolben gegeben und bei 30 °C und 180 U/min geschüttelt, bis ein OD600 von 0,2-0,5 erreicht ist (~18 h). Die Bakterien werden in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt und 20 Minuten lang bei 3.000 x g, 4 °C zentrifugiert. Isolieren Sie die DNA mit einem endotoxinarmen oder -freien Midiprep-Kit.
    5. Überprüfen Sie die ITR-Integrität mit 20 μl diagnostischem Restriktionsenzymverdau unter Verwendung von XmaI (oder SmaI). Bereiten Sie eine Reaktion vor, die 500 ng Plasmid, 0,5 μl Enzym und 1x Puffer enthält. 1 Stunde bei 37 °C inkubieren. Führen Sie die Reaktion mit einem 0,8%igen Agarose-Gel durch. Wenn die ITRs intakt sind, ergibt die Verdauung eine Bande mit ~2,9 kb und eine weitere Bande in der Größe der Kassette. Wenn diese eindeutige Bande nicht beobachtet wird, ist die ITR möglicherweise nicht intakt, und das Klonen muss erneut durchgeführt werden.
      HINWEIS: Bei Plasmiden, die XmaI- (oder SmaI-) Restriktionsstellen enthalten (zusätzlich zu denen in den ITRs), erscheinen zusätzliche Banden auf dem Gel.

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Abbildung 2: Repräsentatives Beispiel für ein Primer-Design. Vorwärts- und Rückwärts-Primer-Design für ein mScarlet-Transgen (repräsentatives Beispiel). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

MengeBestandteil
X μlVorlage DNA (25 ng)
1 μlF-Primer (10 μM)
1 μlR Primer (10 μM)
1 μldNTP (10 mM)
10 μlPhusion-Puffer (5x)
1 μlPhusion-Polymerase
X μlWasser
50 μlEndgültiger Band

Tabelle 1: PCR-Amplifikationsreagenzien. Die erforderlichen Komponenten für eine erfolgreiche PCR-Reaktion.

SchrittTemperaturZeit
Anfängliche Denaturierung98 °C1 min
30 Zyklen98 °C10 Sek.
Tm der Grundierung30 Sek.
72 °C30 s pro KB
Letzte Verlängerung72 °C10 min
Halten4 °Cauf unbestimmte Zeit

Tabelle 2: PCR-Amplifikationsprogrammierung. Die erforderlichen Zyklusparameter für eine erfolgreiche PCR-Reaktion.

MengeBestandteil
X μlPCR-Produkt (1 μg) oder pAAV-Plasmid (3 μg)
5 μlPuffer (10x)
1 μlEcoRI-HF
1 μlNotI-HF
X μlWasser
50 μlEndgültiger Band

Tabelle 3: Reagenzien für den Aufschluss. Die benötigten Komponenten für eine erfolgreiche Verdauungsreaktion.

MengeBestandteil
X μlEinfügen (X ng)
X μlRückgrat (50 ng)
2 μlT4 DNA-Ligase-Puffer (10x)
1 μlT4-DNA-Ligase
X μlWasser
20 μlEndgültiger Band

Tabelle 4: Ligationsreagenzien. Die erforderlichen Komponenten für eine erfolgreiche Ligationsreaktion.

3. Vektorproduktion mit Triple-Plasmid-Transfektion

HINWEIS: Die folgenden Werte sind für eine einzelne Vertiefung einer 6-Well-Platte optimiert, die ein endgültiges Rohaufbereitungsvolumen von 2 ml ergibt. Alle Werte können für eine 15-cm-Platte, die ein Endvolumen von 20 ml ergibt, um das 10-fache vergrößert oder für eine 24-Well-Platte mit einem Endvolumen von 500 μl um das 4-fache verkleinert werden.

  1. Stellen Sie einen Vorrat von 1 μg/μl Polyethyleniminhydrochlorid (PEI) MAX her, indem Sie 100 mg PEI MAX in 100 ml destilliertem Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,1 ein. Filter sterilisieren die Mischung mit einem 0,22-μm-Filter und frieren 1 ml Aliquots bei -20 °C für die Langzeitlagerung ein. Nach dem Auftauen wird das Reagenz 1 Monat lang bei 4 °C gelagert.
  2. Besäen Sie 3 x 10 5 HEK293 oder HEK293T Zellen in eine 6-Well-Platte mit vorgewärmtem modifiziertem Adlermedium von Dulbecco (DMEM,4,5 g/l Glukose, 110 mg/l Natriumpyruvat), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS). Wachsen Sie in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 auf ~75%-90% Konfluenz (Abbildung 3).
    HINWEIS: Es wurde beobachtet, dass Zellen, die mit Penicillin/Streptomycin (P/S) kultiviert wurden, die Vektorproduktionsausbeute verringern. Durch die Verwendung der richtigen sterilen Technik wird die Notwendigkeit der Verwendung von P/S umgangen, und daher wird empfohlen, HEK293-Zellen nicht mit dem Antibiotikum20 zu kultivieren. Wenn P/S in nachgeschalteten Transduktionen benötigt wird, wird empfohlen, P/S nach der Ernte der Rohaufbereitung zuzusetzen.
  3. In einem 2-ml-Röhrchen wird eine Mischung mit 1,3 μg pAAV2/2 (Rep/Cap, Serotyp 2), 1,3 μg pAAV.GOI, 2,6 μg pAdΔF6 und serumfreiem (SF) DMEM (4,5 g/l Glukose, 110 mg/l Natriumpyruvat) zu einem Gesamtvolumen von 100 μl hergestellt (siehe Ergänzende Tabelle 1 für praktische Berechnungen).
  4. Bereiten Sie eine Negativkontrolle in einem separaten Röhrchen vor, indem Sie pRep/Cap durch ein nicht verwandtes Plasmid ersetzen. Die Negativkontrolle berücksichtigt unverpacktes pAAV.GOI-Plasmid, das in der Rohzubereitung vorhanden ist und möglicherweise Zellen während der Transduktion transfizieren könnte, wenn auch selten.
    HINWEIS: Endotoxin-armes oder -freies Maxiprep- oder Midiprep-Plasmid ist ideal für die Dreifachtransfektion und erzeugt im Allgemeinen einen höheren Titervektor im Vergleich zu Miniprep-DNA, obwohl Miniprep-DNA für schnelle und schmutzige Vortests verwendet werden kann.
  5. 5,2 μl PEI MAX zur Plasmidmischung geben; Dabei handelt es sich um ein Plasmid:PEI-Gemisch mit einem Verhältnis von 1:1. Mischen Sie gut, indem Sie 10-15 Mal auf einem Vortex-Mixer pulsieren, der auf 7 eingestellt ist. Wenn mehrere Vektorpräparationen hergestellt werden, wird PEI zu jeder Plasmidmischung in gestaffelten Zeitintervallen von 1 Minute zugegeben (d. h. Präparation 1 bei t = 0 min, Präparation 2 bei t = 1 min usw.), um ein ausreichendes Timing für die Absaugung von Vertiefungen und die Verdünnung der Reaktion in den folgenden Schritten zu ermöglichen.
    HINWEIS: Es wurde beobachtet, dass ein Verhältnis von 1:1 von Plasmid zu PEI optimal ist. Einzelne Benutzer können dieses Verhältnis jedoch optimieren, um maximale Effizienz zu erzielen. Weitere Informationen zur Durchführung der PEI-Optimierung finden Sie in der Erläuterung (siehe auch Ergänzende Tabelle 2).
  6. Jedes Röhrchen wird genau 15 Minuten lang inkubiert und dann die Reaktion mit 1,9 ml SF DMEM (4,5 g/l Glukose, 110 mg/l Natriumpyruvat) für ein Endvolumen von 2 ml verdünnt. Zum Mischen vorsichtig 2x pipettieren. Eine Übermischung stört die Plasmid/PEI-Komplexe und führt zu einer geringeren Transfektionseffizienz.
  7. Saugen Sie das Medium aus der Vertiefung ab und fügen Sie vorsichtig eine Plasmid-PEI-Mischung auf den Well-Seiten hinzu, um eine Zellablösung zu verhindern. Die Zellen werden 72 h lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Zelllyse und -ablösung während der Inkubation ist ein normaler Prozess der rAAV-Produktion (Abbildung 4).

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Abbildung 3: HEK293-Zellen bereit für die Transfektion. Die ideale Konfluenz (75%-90%) der HEK293-Zellen, die für die Triple-Plasmid-Transfektion erforderlich ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: HEK293-Zellen nach der Transfektion. Das Auftreten von HEK293-Zellen vor und nach 1, 2 oder 3 Tagen nach der Transfektion mit pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40, pAAV2/2, pAdΔF6 und einem Verhältnis von 1:1 von Plasmid:PEI . Maßstabsleisten: 400 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Ernte von rohen Vektorzubereitungen

  1. Die gesamte Platte der transfizierten Zellen wird für 30 min bei -80 °C eingefroren, gefolgt von einem 30-minütigen Auftauen bei 37 °C. Wiederholen Sie dies für insgesamt drei Gefrier-/Auftauzyklen. Entfernen Sie den Deckel nicht – die Platte muss innen steril bleiben. Die Platten können bei -80 °C bleiben, bis sie bereit sind, mit den nächsten Schritten fortzufahren.
    HINWEIS: Ein nicht befeuchteter Inkubator eignet sich am besten zum Auftauen, wodurch die Kondensation an der Außenseite der Platten minimiert wird, die zu einer versehentlichen Kontamination führen kann.
  2. Führen Sie die folgenden beiden Schritte in einer Laminar-Flow-Haube mit aseptischen Techniken durch. Mischen Sie jede Vertiefung durch Pipettieren, um einen maximalen Aufschluss der Zellen zu gewährleisten. Lysat in ein 2-ml-Röhrchen überführen und 15 Minuten bei 15.000 x g Raumtemperatur zentrifugieren, um Zelltrümmer zu entfernen.
  3. Überstand vorsichtig in ein neues 2-ml-Röhrchen umfüllen. Dieses Rohpräparat kann sofort ohne Titration oder Reinigung verwendet werden. Vector kann bei 4 °C mehrere Monate oder -20 °C über Jahre gelagert werden.
    HINWEIS: Bei Bedarf können die Titer mittels quantitativer PCR (qPCR) berechnet werden, indem die Anzahl der Vektorgenome (VG) in DNase-resistenten Partikeln quantifiziert wird. Daher werden die Titer in der Einheit VG/ml angegeben. Der Vektor, der mehrere Monate bei 4 °C gelagert wurde, sollte vor der Verwendung erneut titriert werden, da der Vektor die Röhrchenwände aggregieren und/oder binden kann, wodurch der Titer des Präparats verringert wird.

5. Transduktion

  1. Platten Sie den gewünschten Zelltyp (z. B. Huh7) in einer 96-Well-Platte mit einer Zielkonfluenz von 50 % bis 75 %, abhängig von der Dauer der Transduktion. Eine größere Konfluenz kann zu einer verringerten AAV-Transduktionseffizienz führen.
  2. Hinzufügen von Vektoren (z. B. CMV.mScarlet) zu Zellen, ohne den Titer des Rohpräparats zu kennen, für Anwendungen, bei denen die Dosis nicht relevant ist, wie z. B. das Testen einer Gruppe von Kapsiden auf Transduktion in einem neuen Zelltyp. Führen Sie eine 1:3-Verdünnungsreihe der Rohpräparation in serumfreien Medien (SF) durch, um die optimale Menge an Vektor zu erhalten, die für die Anwendung erforderlich ist. Saugen Sie das Medium von der 96-Well-Platte ab und geben Sie 50-100 μl verdünnte Rohölpräparation in die Wells. Die Zellen werden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
    HINWEIS: Serum kann Antikörper enthalten, die den AAV-Vektor neutralisieren und die Transduktionseffizienz verringern können. Serum kann jedoch während der Transduktion für empfindliche Zelltypen verwendet werden.
  3. Entfernen Sie den Vektor nach 48 Stunden nach der Transduktion (hpt) und waschen Sie die Zellen einmal mit vorgewärmter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Vektoren können bei empfindlichen Zelltypen auch bereits ab 2 hpt entfernt und durch serumhaltige Medien ersetzt werden. Für viele Anwendungen sollten Sie eine Inkubation über Nacht durchführen, um die Zellen zu transduzieren, und morgens die Vertiefungen durch frische, serumhaltige Medien ersetzen. Robuste Zelltypen, wie z.B. Huh7 und U2-OS, benötigen keinen Medienwechsel.
  4. Beenden Sie die Transduktion, indem Sie die Zellen 10 Minuten lang in 4% Paraformaldehyd (PFA) fixieren. Je nach Anwendung können auch verschiedene Terminierungsmethoden verwendet werden (z. B. Lyse). Für die meisten Zelltypen tritt die maximale Expression bei 48 hpt auf und ist daher ein üblicher experimenteller Endpunkt.

6. Variationen der Transduktionsmethode nach Zelltyp

HINWEIS: Unterschiedliche Zelltypen erfordern unterschiedliche Kulturbedingungen. Daher sollte die Zugabe von Vektoren für die Transduktion basierend auf den Bedürfnissen des Zelltyps optimiert werden. Im Folgenden finden Sie sehr spezifische Transduktionsprotokolle für die Zelltypen, die in den repräsentativen Ergebnissen enthalten sind, und veranschaulichen einige Variationen von Transduktionsprotokollen, die ein Forscher für seine eigenen Bedürfnisse ausprobieren möchte.

  1. Dünndarm-Organoide der Maus
    1. Ableitung von Maus-Dünndarm-Organoiden (mSIOs) aus einer Dünndarmkrypta-Vorbereitung von C57BL/6J-Mäusen. Einbetten von Organoiden in 90 % Basalmembranmatrix und Kultur in 24-Well-Platten, die entweder Organoid-Wachstumsmedium (ohne Antibiotika) oder Prätransduktionsmedium (50 % Wnt3a-konditioniertes Medium [intern unter Verwendung von L-Wnt-3A-Zellen in Organoid-Wachstumsmedium hergestellt], 10 mM Nicotinamid, 10 μM ROCK-Inhibitor und 2,5 μM CHIR99021) für eine Passage (5-7 Tage) vor der Transduktion bei 37 °C und 5 %CO2 enthalten.
    2. Vor der Transduktion werden Organoide mit D-PBS gespült, Basalmembran-Matrixkuppeln durch Pipettieren aufgebrochen und Organoide in kleine Zellcluster dissoziiert, indem sie 10 Minuten lang bei 37 °C in Dissoziationsmedium inkubiert und weiter pipettiert werden.
    3. Stoppen Sie den Zelldissoziationsprozess, indem Sie 5% FBS in DMEM/F-12 mit 15 mM HEPES hinzufügen, Zellcluster in Zentrifugenröhrchen überführen und Zellcluster durch Zentrifugation für 5 Minuten bei 1000 x g Raumtemperatur sammeln.
    4. Resuspendieren Sie die Zellcluster in Transduktionsmedium (Prätransduktionsmedium mit 10 μg/ml Polybrene oder organoides Wachstumsmedium mit 10 μg/ml Polybrene) und überführen Sie sie in 48-Well-Platten, gefolgt von der Zugabe von AAV-Rohpräparaten, die CMV.mScarlet für die Transduktion verpacken.
    5. Die Transduktion von Organoiden wird durchgeführt, indem die Platte 1 h lang bei 600 x g und 37 °C zentrifugiert und dann weitere 6 h bei 37 °C inkubiert wird. Die transduzierten Organoide werden in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt, 5 Minuten lang bei 1000 x g Raumtemperatur zentrifugiert und auf Eis gelegt.
    6. Nach dem Entfernen des Überstandes werden transduzierte Organoide in 90 % Basalmembranmatrix in Vortransduktionsmedium oder Organoid-Wachstumsmedium und Keimtröpfchen von 20 μl in eine Vertiefung eines vorgewärmten Kammerdeckglases resuspendiert.
    7. Nach einer Inkubation von 10 Minuten im Inkubator wird das Tröpfchen in 350 μl Prätransduktionsmedium oder organoides Wachstumsmedium eingebettet und bei 37 °C im Inkubator inkubiert. Bestimmen Sie die Transduktionseffizienz 2-5 Tage nach der Transduktion, indem Sie die transduzierten Organoide auf einem konfokalen Mikroskop abbilden und den Prozentsatz der rot fluoreszierenden Zellen pro Organoid schätzen.
  2. BeWo-Zellen
    1. 24 Stunden vor der Transduktion werden menschliche plazentare Choriokarzinom-BeWo-Zellen mit 10.000 Zellen pro Well einer 96-Well-Platte bestückt. Verdünnen Sie rohe AAV-Präparate, die CMV.mScarlet verpacken, auf 1:1 in serumfreiem F12-K BeWo-Medium bis zu einem Gesamtvolumen von 50 μl pro Well. Saugen Sie das Medium aus der Vertiefung ab und ersetzen Sie es durch 50 μl verdünntes AAV pro Vertiefung.
    2. Die Zellen werden über Nacht (~18 h) bei 37 °C inkubiert und dann 100 μl F12-K BeWo-Medium mit 10 % FBS zugegeben, um das Gesamtvolumen auf 150 μl zu erhöhen. Die Zellen werden für weitere 6 h für insgesamt 24 h nach der Transduktion (hpt) inkubiert.
    3. Für die Bildgebung färben Sie lebende Zellen 30 Minuten lang mit Hoechst-Farbstoff in F12-K-Medium und tauschen Sie das Medium dann gegen phenolfreies DMEM aus, das 10 % FBS, 1x Glutamax-Präparat und 1x Natriumpyruvat-Präparat für die Bildgebung enthält. Führen Sie Lebendzell-Bildgebung auf einem konfokalen Mikroskop mit DAPI- (für Hoechst-Bildgebung) und mCherry-Filtersätzen (für mScarlet-Bildgebung) mit 37 °C und 5 % CO2 durch.
  3. Hepa1-6- und Huh7-Zellen
    1. Platte murine Hepa1-6 Leberzellen und humane Huh7 Leberzellen in DMEM (4,5 g/L Glukose, 110 mg/L Natriumpyruvat, 10% FBS) bei 5.000 Zellen pro Well einer 96-Well-Platte 24 h vor der Transduktion.
    2. 50 μl unverdünnte rohe AAV-Präparate, die CMV.mScarlet verpacken, direkt in die Zellen geben und bei 37 °C für 48 h inkubieren. Die Zellen einmal in PBS waschen, in 4% PFA fixieren und 10 Minuten lang mit Hoechst-Farbstoff färben. Führen Sie die Bildgebung auf einem konfokalen Mikroskop mit den Filtersätzen DAPI (für die Hoechst-Bildgebung) und mCherry (für die mScarlet-Bildgebung) durch.
  4. C2C12- und HSkMC-Zellen
    1. Platte undifferenzierte murine C2C12-Myoblasten und undifferenzierte humane primäre Skelettmuskelzell-Myoblasten (HSkMC) bei 5.000 Zellen pro Well einer 96-Well-Platte, 72 h vor der Transduktion.
    2. Verdünnen Sie rohe AAV-Präparate, die CMV.mScarlet verpacken, auf 1:1 in DMEM (4,5 g/L Glukose, Penn/Streptokokken, 20 % FBS) für C2C12-Myoblasten oder Skelettmuskelwachstumsmedien für HSkMC-Myoblasten. Differenzierung von HSkMC-Myoblasten zu Myotuben, indem das Medium in Differenzierungsmedium umgewandelt wird.
    3. Myoblasten und Myotuben werden in verdünnten AAV-Präparaten für 24 h bei 37 °C inkubiert. Färben Sie lebende Zellen 10 Minuten lang mit Hoechst-Farbstoff und fotografieren Sie sie auf einem konfokalen Mikroskop mit den Filtersets DAPI (für Hoechst-Bildgebung) und mCherry (für mScarlet-Bildgebung).

Repräsentative Ergebnisse

Optimales Kapsid für die Transduktion von kultivierten Zellen von Interesse finden
Eine Vielzahl von Zelltypen wurde transduziert, um den Tropismus verschiedener Kapsid-Serotypen zu bestimmen (Abbildung 5). Die natürlichen Serotypen AAV214, AAV4 21, AAV5 22, AAV8 23, AAV9 24 und die modifizierten Kapsidvarianten Anc80 25, DJ 26, LK0327 undKP1 28 wurden mit einem Vektorgenom verpackt, das mScarlet unter einem CMV-Promotor exprimiert, der mit den in diesem Protokoll bereitgestellten Methoden kloniert wurde. Nicht titrierte rohe Vektorpräparate wurden in den entsprechenden Kulturmedien verdünnt und die Zellen wurden für 24+ h transduziert und abgebildet (Abbildung 5B). Die Transduktionseffizienz wurde anhand des Anteils der Gesamtzellen berechnet, die mScarlet+ waren, oder des Anteils der Zellen in einer einzelnen z-Ebene, die mScarlet+ waren (für Maus-Dünndarm-Organoide; Abbildung 5C). Transduktionseffizienzen (mScarlet+-Zellen) werden nicht für differenzierte C2C12- und HSkMC-Myotuben angegeben, sondern für undifferenzierte C2C12- und HSkMC-Myoblasten (Abbildung 5A).

AAV2 und KP1 waren die wirksamsten Serotypen in allen getesteten Zelllinien (Abbildung 5A). Es wurde auch beobachtet, dass ähnliche Zelltypen, die von verschiedenen Spezies stammen, mit unterschiedlicher Effizienz transduziert werden. Zum Beispiel zeigt Hepa1-6 (eine Leberzelllinie von Mäusen) eine deutliche Abnahme der Transduktion im Vergleich zu Huh7 (eine Leberzelllinie vom Menschen), wenn AAV2 verwendet wird (Abbildung 5B). Darüber hinaus spielen unterschiedliche Medienbedingungen bei der Transduktion eine wichtige Rolle. Dünndarm-Organoide (mSIOs) von Mäusen, die in Prä-Transduktionsmedien kultiviert wurden, werden im Vergleich zu solchen, die in organoiden Wachstumsmedien kultiviert wurden, weniger effektiv transduziert (Abbildung 5C). Darüber hinaus transduziert AAV2 effizient undifferenzierte HSkMC-Myoblasten und differenzierte HSkMC-Myotuben (Abbildung 5B), obwohl eine quantitative Analyse der Myotuben schwierig ist und daher nicht durchgeführt wird.

Die hohen Transduktionseffizienzen, die für verschiedene Zelltypen in Abbildung 5 beobachtet wurden, zeigen, dass rohe Vektorpräparate effektiv verwendet werden können, um eine Vielzahl von Zelltypen ohne weitere Schritte wie Reinigung und Titration zu transduzieren. Bei der Auswahl eines Kapsids sollte jedoch sorgfältig abgewogen werden, um die Transgenabgabe zu maximieren. Viele andere Zelllinien und Kapside wurden bereits getestet und veröffentlicht, allerdings mit gereinigten Vektorpräparaten12.

Ein vektorteilchenunabhängiger Effekt der Medienbedingungen kann die Effizienz der Transduktion beeinflussen. Es ist jedoch allgemein anerkannt, dass Tropismus (d. h. zelltypspezifische Aufnahme und Expression des Vektors) eine Eigenschaft ist, die kapsidspezifisch ist29. Es wurde noch nicht beobachtet, dass ein Vergleich zwischen dosisangepassten rohen und gereinigten Präparaten den zellulären Tropismus beeinflusst. Daher können rohe Vektorpräparate in ähnlicher Weise wie gereinigte Vektoren in der Zellkultur verwendet werden.

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Abbildung 5: Rohe Vektortransduktion verschiedener Zelltypen . (A) Prozentsatz von mScarlet+ nach Zugabe verschiedener AAV-Vektoren, die ein mScarlet-Transgen enthalten. (B) Zellen, die mScarlet exprimieren, das vom AAV-Serotyp 2 abgegeben wird. Maßstabsleisten: 100 μm (Hepa1-6, Huh7, C2C12 und HSkMC), 200 μm (BeWo), 20 μm (mSIO). Abkürzungen: hpt = Stunden nach der Transduktion. (C) Maus-Dünndarm-Organoide (mSIOs) wurden entweder mit rAAV in Prä-Transduktionsmedien oder in Organoid-Wachstumsmedien behandelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Tabelle 1: Arbeitsblatt zur Dreifach-Plasmidtransfektion. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Arbeitsblatt zur PEI-Optimierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Klonen
Das Klonierungsprotokoll ist nicht auf das oben verwendete Plasmid pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 beschränkt und kann je nach den experimentellen Anforderungen eines Forschers leicht geändert werden. Viele ITR-haltige Plasmide sind online erhältlich. Zum Beispiel sind Plasmide verfügbar, die sowohl Cas9 als auch eine sgRNA-Klonierungsstelle enthalten, erfordern jedoch nur wenige zusätzliche Schritte wie Oligonukleotid-Annealing und PNK-Behandlung30. Darüber hinaus können Plasmide gefunden werden, die eine multiple Klonierungsstelle (MCS) enthalten, die nur ITRs und keine inneren regulatorischen Elemente enthält31. Wenn verschiedene Plasmide verwendet werden sollen, sind die für die Verdauung verwendeten Restriktionsenzyme (RE) in der Regel die einzigen Elemente, die in diesem Protokoll geändert werden müssen. Eine Einschränkung von rAAV ist jedoch seine begrenzte Ladekapazität. Aufgrund der physikalischen Einschränkungen des Kapsids sollte das Vektorgenom nicht größer als 4,9 kb sein, einschließlich der ITRs.

Bei der Isolierung von Plasmiden aus Bakterien ist es wichtig, ein endotoxinarmes oder -freies Midiprep- oder Maxiprep-Kit zu verwenden, um die Schädigung der Zellen während der Triple-Plasmid-Transfektion oder -Transduktion zu minimieren. Plasmide aus Miniprep-Kits enthalten oft höhere Verunreinigungen, reduzierte Konzentrationen und weniger supercoiled DNA, was die nachgelagerte Produktion von rAAV beeinträchtigen kann und daher nicht empfohlen wird.

Es ist wichtig, die Struktur und die Eigenschaften von ITRs während des Klonens zu verstehen. Erstens ist es äußerst schwierig, die PCR über die ITR zu verwenden. Klondesigns, die eine PCR-Amplifikation durch ITRs erfordern, sollten vermieden werden und zusätzlich die Verwendung der Gibson-Assemblierungsklontechnik einschränken. Daher ist die Klonierung von Restriktionsenzymen die bevorzugte Methode für die Klonierung in ITR-haltige Plasmide. Darüber hinaus sind bestimmte Primer für die Sanger-Sequenzierung möglicherweise nicht kompatibel, wenn die sequenzierte Region die ITR enthält. Stattdessen wird empfohlen, Primer zu verwenden, die von den ITRs weg und in den Vektorgenomkörper sequenzieren, um präzisere Sequenzierungsergebnisse zu erhalten. Zweitens sind ITRs anfällig für Deletionen, Umlagerungen und Mutationen, wenn sie in Bakterien für die Plasmidamplifikation umgewandelt werden32,33. Um diese Ereignisse abzumildern, wird empfohlen, rekombinationsdefiziente kompetente Bakterienstämme wie Stbl3 zu verwenden und sie bei 30 °C zu inkubieren, um die Zellteilung zu verlangsamen. Schließlich wurde beobachtet, dass kleinere Kolonien mit Klonen ohne Umlagerungen oder Deletionen korrespondieren können, da solche ohne ITRs einen Wachstumsvorteil gewähren und größer sein können. Daher empfiehlt es sich, kleine Völker zu wählen.

Vektor-Produktion
Die erfolgreiche Produktion von rAAV-Vektoren kann durch mehrere Elemente beeinflusst werden. Ein kritischer Faktor ist die Gesundheit der HEK293- oder 293T-Zellen, die für die Transfektion verwendet werden. Im Allgemeinen sind niedrige Passagenzahlen ideal, da stark passageierte Zellen genotypische und phänotypische Varianzen aufweisen können, die die rAAV-Titer senken können. Darüber hinaus sollte die Dichte der ausgesäten Zellen 75%-90% Konfluenz für eine effektive Produktion betragen. Dünn besetzte Zellen erzeugen geringe Vektorausbeuten, da weniger Zellen für die Produktion von Vektoren zur Verfügung stehen, während überwucherte Zellen nicht effizient transfiziert werden.

Variationen zwischen Reagenzienchargen, Zellbeständen und die allgemeine Variabilität von Labor zu Labor tragen zu Unterschieden in der Transfektionseffizienz und dem Produktionstiter bei. Ein optimierbarer Faktor, der zu Titerverbesserungen führen kann, ist das Plasmid:PEI-Verhältnis bei Transfektionsreaktionen. Es ist wichtig, frisches (<1 Monat altes) PEI MAX zu verwenden. Es wird empfohlen, ein Plasmid:PEI-Verhältnis von 1:1 als Ausgangspunkt zu verwenden, und wenn die Transfektions- oder Transduktionseffizienz schlecht erscheint, mehrere verschiedene Verhältnisse zu testen. Die Titeroptimierung ist am einfachsten, wenn ein Transgen mit einer visuellen Anzeige verwendet wird, wie z. B. das CMV.Luc.IRES.EGFP-Reportertränen, das hierin als Ausgangsmaterial für die Klonierung verwendet wird. Um die Optimierung durchzuführen, befolgen Sie Protokollschritt 3 mit einer 12-Well-Platte und verkleinern Sie die Plasmidmassen und Reagenzienvolumina um zwei (die endgültige Plasmidmasse beträgt 2,6 μg). Passen Sie das PEI-Volumen entsprechend an, um Verhältnissen von 1:0,75 bis 1:3 zu entsprechen, mit steigenden Schritten von 0,25 (Abbildung 6). Verdünnen Sie jede Reaktion nach 15 Minuten mit 950 μl SF-Medien. Der Einfachheit halber kann ein Mastermix, der die Dreifachplasmide enthält, hergestellt und einzeln in 1,5-ml-Röhrchen pipettiert werden, bevor PEI hinzugefügt wird - siehe Ergänzungsdatei 2. Ernten Sie den Vektor, transduzieren Sie die gewünschten Zellen und stellen Sie ein Bild dar. Die Vertiefung mit der höchsten Transduktionseffizienz (Anteil an GFP+-Zellen) entspricht dem höchsten Titer und dem optimalsten Verhältnis von PEI:DNA.

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Abbildung 6: PEI-Optimierungs-Workflow. Schematische Darstellung der Schritte, die für die PEI-Optimierung erforderlich sind. Mehrere Verhältnisse von Plasmiden: PEI werden getestet, um das optimale Verhältnis zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Überlegungen zu Ernte und Titer
Die Gefrier-/Auftautechnik, die zur Ernte des rAAV-Vektors verwendet wird, lysiert HEK293-Zellen effektiv in einer Weise, die mit der direkten Verwendung des geklärten Lysats zur Transduktion kultivierter Zellen kompatibel ist. Bestimmte rAAV-Serotypen, wie AAV1, AAV8 und AAV9, werden während der Vektorproduktion aus Zellen freigesetzt und können ohne Gefrier-/Auftauzyklen aus dem kultivierten Zellmedium geerntet werden34. Die hier beschriebene Methode liefert typischerweise Titer in der Größenordnung von 1 x 10 10 VG/ml bei Verwendung von AAV2-Kapsiden und 1 x10 11 VG/ml bei AAV8. Während höhere Titer durch Detergenzien oder andere chemische Lyse erreicht werden können, sind diese bei der nachgeschalteten Verwendung schädlich für die Zellen und erfordern, dass rAAVs weiter aus dem Lysat gereinigt werden. Ein niedrigerer Titer ist ein Kompromiss, den ein Forscher berücksichtigen sollte, wenn er feststellt, ob rohe Präparate für seine Forschungsbedürfnisse geeignet sind, aber die geringfügig niedrigeren Titer, die durch die hier beschriebenen Methoden erzeugt werden, können viele Zelltypen sehr gut transduzieren (siehe repräsentative Ergebnisse). Neben der Transfektionseffizienz und der Zellgesundheit variieren die Vektortiter je nach dem Kapsid, das während der rAAV-Produktion verwendet wird, sowie von der Größe und Sequenz des Transgens innerhalb des VG35.

Bei der Ernte von rohen Vektorpräparaten kann Plasmid-DNA vorhanden sein, die während der Triple-Plasmid-Transfektion verwendet wurde, und wenn auch selten, führt sie zu einer nachgeschalteten Transfektion während der Transduktion. Darüber hinaus können unverpackte VGs an die Außenseite von Kapsiden binden und eine angeborene Immunantwort auf nackte und fremde einzelsträngige DNA hervorrufen36,37. Daher kann es für empfindliche Zelltypen erforderlich sein, dass Vektorpräparate DNase-verdaut und gereinigt werden, um unverpackte VGs und Plasmide zu entfernen.

Wenn man den Titer einer Rohzubereitung berechnen möchte, kann qPCR durchgeführt werden, um die Anzahl der verpackten VG in DNase-resistenten Partikeln (DRP) zu quantifizieren. Kurz gesagt, eine kleine Menge Rohpräparat wird DNase-verdaut, um Plasmid-DNA, kontaminierende Nukleinsäuren oder teilweise verpacktes VG zu entfernen. Die Probe wird dann einer qPCR unterzogen und das geschützte VG innerhalb von DRPs wird quantifiziert, was zu einem Titer mit Einheiten des Vektorgenoms pro ml Rohpräparat38 führt. Es wird nicht empfohlen, eine Vektortitration mit ELISA-basierten Assays durchzuführen, die Kapsidtiter quantifizieren. Im Vergleich zum Wildtyp-AAV-Virus leidet rAAV unter einem Anteil an leeren und teilweise verpackten Kapsiden39. Der ELISA quantifiziert alle Kapside unabhängig von ihrem Genomgehalt und überschätzt die transduzierbaren Einheiten in einem Präparat, das eine verpackte VG erfordert.

Überlegungen zur Transduktion
Viele Faktoren beeinflussen die rAAV-Transduktionen, und bei jedem neuen Experiment sollten die richtigen Überlegungen angestellt werden. Abhängig vom Promotor, der die Transgenexpression antreibt, kann die Expression bereits 4 Stunden nach der Transduktion (hpt) beginnen, und die maximale Expression wird typischerweise bei 48 hpt erreicht. Es ist wichtig, die Zeitspanne von der ersten Aussaat der Zellen bis zum experimentellen Endpunkt im Auge zu behalten. Damit soll die anfängliche Konfluenz der Zellen abgeschätzt und sichergestellt werden, dass sie am Ende des Experiments nicht überwachsen. Wenn Zellen überkonfluent werden, kann das zelluläre Verhalten aufgrund einer Stressreaktion verändert werden und die experimentellen Ergebnisse verfälschen. Einige Zelltypen, wie z.B. U2-OS, können Überwucherung/Kontakthemmung recht gut tolerieren. Darüber hinaus können sie lange Zeiträume (48 h+) in serumfreiem, konditioniertem Medium überstehen – das Produkt dieses Produktionsprotokolls. Empfindliche Zelltypen können jedoch eine Serumzugabe oder Verdünnung des Rohpräparats mit einem speziellen Wachstumsmedium erfordern, um die Gesundheit während der Transduktion zu erhalten. Eine leicht reduzierte Transduktionseffizienz durch die Verwendung serumhaltiger Medien ist ein potenzieller Kompromiss für die Zellgesundheit und sollte vom Forscher in Betracht gezogen werden.

In der Regel ist für sich schnell teilende Zellen eine Startkonfluenz von etwa 50 % optimal für Anwendungen, die mit 48 hpt abgeschlossen werden. Die Konfluenz kann jedoch entsprechend den Anforderungen des Experiments angepasst werden. Es wird nicht empfohlen, immortalisierte Zelllinien vom Monolayer-Typ mit einer Konfluenz von mehr als 75 % zu transduzieren, da die Transduktionseffizienz vermindert ist. Die meisten kultivierten Zelltypen sind nach einer nächtlichen Inkubation mit rohen rAAV-Präparaten, gefolgt von einem Wechsel zu frischen, serumhaltigen Medien am Morgen, erfolgreich transduziert und gesund.

Der Kapsid-Serotyp ist ein wichtiger Faktor, der bei der Produktion von rAAV zur Transduktion einer Zielzelle zu berücksichtigen ist, da das Kapsid die primäre Determinante des zellulären Tropismus und der anschließenden Transgenexpression ist13. AAV2 ist aufgrund seiner Fähigkeit, viele Arten von kultivierten Zellen effektiv zu transduzieren, ein weit verbreiteter Serotyp12. Diese Eigenschaft von AAV2 kann auf Heparinsulfat-Proteoglykane (HSPGs) zurückgeführt werden, die als primärer Bindungsfaktor für AAV2 dienen, und auf die hohen HSPG-Konzentrationen auf kultivierten Zellen von der Anpassung an das Wachstum in einer Schale40. Andere Kapside, wie z. B. AAV9, sind weniger effektiv bei der Transduktion breiter Zelltypen und können durch ihre Reliance-Bindungsfaktoren erklärt werden, die in dieser Einstellung nicht exprimiert werden41. Daher empfehlen wir AAV2 als Kapsid der ersten Wahl in kultivierten Zellen, wenn eine gewünschte Zielzelle in der Literatur noch nicht mit rAAV getestet wurde.

Bitte beachten Sie, dass eine wesentliche Einschränkung von rohen Vektorpräparaten darin besteht, dass sie für die Transduktion von Tiermodellen ungeeignet sind. In-vivo-Studien erfordern, dass die Präparate gereinigt und einer Qualitätsbewertung unterzogen werden.

Überlegungen zur Transgenexpression und möglichen Integration
rAAVs führen nicht zuverlässig zu einer dauerhaften Expression des Transgens. Im Laufe der Zeit können VGs zum Schweigen gebracht werden und die transgene Expression kann nach mehreren Passagen abgeschaltet werden42. Darüber hinaus bleibt die Mehrheit der VGs episomal, und rAAVs enthalten nicht die viralen Rep-Proteine, die eine häufige Integration in das Wirtsgenom wie bei einer lysogenen Wildtyp-Infektion des Virus vermitteln oder die Replikation von VGs43 fördern würden. Infolgedessen werden Episomen in transduzierten Zellen schließlich durch Teilungen unter den Tochterzellen verdünnt.

Die Integration auf basaler Ebene ist eine Möglichkeit für das gesamte angelieferte transgene DNA-Material. ITR-haltige VGs sind jedoch anfällig für eine Integration mit einer höheren Frequenz44. Daher kann die permanente Expression eines Transgens in einer kleinen Untergruppe von Zellen beobachtet werden. Anwender sollten diese Möglichkeit insbesondere bei der Verwendung von rAAV zur Verabreichung von DNA-schneidenden Enzymen wie Cas9 in Betracht ziehen, da Doppelstrangbrüche zu einer noch größeren Häufigkeit der Integration und dauerhaften Expression führen können45. Während dies rAAV zu einem guten Kandidaten für die Bereitstellung von homologiegesteuerten Reparaturschablonen für endogenes Tagging oder Genaddition macht, sollte die Möglichkeit einer Cas9-Insertion in Betracht gezogen werden19,46.

Offenlegungen

A.C.M. ist Berater für Janssen Pharmaceuticals und Mitglied des SAB für NewBiologix. Alle anderen Autoren haben keine Interessenkonflikte zu deklarieren.

Danksagungen

Wir danken Robert Tjian und Xavier Darzacq für ihre Unterstützung und den Einsatz von Laborgeräten. Wir danken Mark Kay für sein Geschenk der KP1 und LK03 rep/cap-Plasmide und Luk Vandenberghe für das AAV4 rep/cap-Plasmid. Die Finanzierung erfolgte durch das Howard Hughes Medical Institute (34430, R. T.) und das California Institute for Regenerative Medicine Training Program EDUC4-12790. N.W. bedankt sich für die Förderung durch das Berkeley Stem Cell Center über ein Siebel-Postdoc-Stipendium und durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) über ein Walter-Benjamin-Stipendium.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Snapgene DNA viewing sofrwareSnapgene
pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40AddGene105533
pAAV2/2 (Rep/Cap)AddGene104963
pAdΔF6AddGene112867
LB Agar CarbenicillinSigma-AldrichL0418
Boekel Scientific Economy Digital IncubatorBoekel Scientific133000
LB medium, powderMP Biomedicals113002042
Carbencillin (Disodium)GoldBioC-103-5
New Brunswick I26 ShakerEppendorfM1324-0000
50 mL Centrifuge TubesCorning430828
Centrifuge 5810 REppendorf22627040
QIAGEN Plasmid Plus Midi KitQiagen12945
PCR PULL-APART 8-TUBE STRIPSUSA Scientific1402-3900
Mastercycler nexusEppendorf6333000022
dNTPThermo Fisher Scientific18427013
5x Phusion BufferNEBB0518SProvided with purchase of Phusion Polymerase
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0530S
Gel Loading Dye, Orange (6X)NEBB7022S
DNA Clean & Concentrator-100ZymoD4029
Zymoclean Gel DNA Recovery KitZymoD4001
NotI-HFNEBR3189S
EcoRI-HFNEBR3101S
CutSmart Buffer (10x)NEBB6004SProvided with purchase of restriction enzyme
UltraPure AgaroseThermo Fisher Scientific16500100
Ethidium BromideSigma-AldrichE1510
T4 DNA LigaseNEBM0202S
T4 DNA Ligase Reaction BufferNEBB0202SProvided with purchase of T4 Ligase
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5mL)Eppendorf22363204
Precision Microprocessor Water BathThermo Scientific51221046
Sterile Plastic Culture TubesFisher Scientific149566B
2.0 mL Microcentrifuge TubeThomas Scientific1149Y01
ZR Plasmid Miniprep - ClassicZymoD4015
Xma1NEBR0180S
Sma1NEBR0141S
HEK 293T cellsATCCCRL-3216
Falcon 6-wellCorning353046
Gibco DMEM, high glucose, pyruvateThermo-Fisher11995065
Sanyo MCO-18AIC(UV) CO2 IncubatorMarshall ScientificMCO-18AIC
PEI MAX (Polyethylenimine Hydrochloride)Polysciences24765-100
Mixer Vortex Genie 2Electron Microscopy Sciences102091-234
Sanyo Ultra Low FreezerSanyo14656-15267-16219
INCU-Line IL 10 with transparent windowVWR390-0384
Eppendorf MicrocentrifugesEppendorf05-400-005
Falcon 96-wellCorning353072
C57BL/6J miceJAXstrain #000664
organoid growth mediumSTEMCELL Technologies6005
L Wnt-3A cellsATCCCRL-2647
nicotinamideSigmaN0636-100G
ROCK inhibitorSTEMCELL Technologies72302
CHIR99021STEMCELL Technologies72052
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement MembraneFisher356231
24-well plateFisher08-772-1
D-PBSThermo Fisher Scientific14-190-250
TrypLE ExpressFisher12604013
DMEM/F-12 with 15 mM HEPESSTEMCELL Technologies36254
polybreneMillipore SigmaTR-1003-G
48-well platesFisher08-772-3D
Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered CoverglassFisher12-565-470
BeWo cellsATCCCCL-98
F-12K MediumATCC30-2004
Hepa1-6ATCCCRL-1830
Huh7UC Berkeley BSD Cell Culture FacilityHUH-7
C2C12ATCCCRL-1772
HSkMCATCCPCS-950-010
Skeletal Muscle Cell Growth MediumSigmaC-23060
Skeletal Muscle Differentiation MediumSigmaC-23061
Invitrogen EVOS Digital Color Fluorescence MicroscopeFisher Scientific12-563-340
Perkin Elmer Opera PhenixPerkin ElmerHH14001000
PhenoPlate 96-wellPerkin Elmer6055302
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol redThermo-Fisher31053028
GlutaMAX SupplementThermo-Fisher35050079
Sodium PyruvateThermo-Fisher11360070
pAAV2/5 (Rep/Cap)Addgene104964
pAAV2/8 (Rep/Cap)Addgene112864
pAAV-DJ-N589X (Rep/Cap)Addgene130878
pAAV2/9n (Rep/Cap)Addgene112865
pAnc80L65AAPAddgene92307
KP1 (rep/cap)gifted by Professor Mark Kay (Stanford University)
LK03 (rep/cap)gifted by Professor Mark Kay (Stanford University)
pAAV4 (rep/cap)gifted by Professor Luk Vandenberghe (Harvard Medical School)
pAAV.Cas9.sgRNAAddgene61591
pAAV.MCSAddgene46954
gBlock (synthetic DNA fragement)IDT

Referenzen

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