Modifizierte Angstkonditionierung zur Induktion von Fluchtverhalten bei Mäusen

Zusammenfassung

Um das Flugverhalten in einem ängstlichen Kontext zu untersuchen, führen wir ein modifiziertes Angstkonditionierungsprotokoll ein. Dieses Protokoll stellt sicher, dass Mäuse während der Signalpräsentation in der Angstkonditionierung konsistent Flugverhalten zeigen.

Zusammenfassung

Die angemessene Ausprägung von Abwehrverhalten in einer bedrohlichen Situation ist überlebenswichtig. Die vorherrschende Theorie besagt, dass ein aktives Abwehrverhalten, wie z. B. Springen oder schnelles Schießen, bei hoher Bedrohungsunmittelbarkeit oder tatsächlicher Bedrohung zum Ausdruck kommt, während passives Abwehrverhalten, wie z. B. Einfrieren, zum Ausdruck kommt, wenn die Bedrohung vorhergesagt wird, die Bedrohungsunmittelbarkeit jedoch relativ gering ist. Bei der klassischen Angstkonditionierung zeigen die Probanden typischerweise Erstarren als konditionierte Abwehrreaktion, wobei in den meisten Fällen wenig aktives Abwehrverhalten zum Ausdruck kommt. Hier stellen wir ein modifiziertes Angstkonditionierungsverfahren für Mäuse vor, um den Übergang vom Einfrieren zum Fliegen und umgekehrt zu beobachten, das fünf sich wiederholende Paarungen von konditionierten Reizen (CS; Dauerton, 8 kHz, 95 dB SPL (Schalldruckpegel)) und unkonditionierten Reizen (US; Fußschock, 0,9 mA, 1,0 s) über zwei Tage umfasst. Dieses modifizierte Angstkonditionierungsverfahren erfordert eine relativ große Anzahl von Konditionierungssitzungen und Konditionierungstagen, erfordert jedoch keinen hochintensiven Fußschock für eine bescheidene Ausprägung des Flugverhaltens. Die Verwendung desselben Kontexts für die Konditionierung und hervorstechende CS-Präsentationen ist unerlässlich, um das Flugverhalten zu ermitteln. Dieses modifizierte Angstkonditionierungsverfahren ist eine zuverlässige Methode zur Beobachtung aktiver Abwehrverhaltensweisen bei Mäusen und bietet die Möglichkeit, die feinen Mechanismen und Eigenschaften solcher Verhaltensweisen in einem ängstlichen Kontext aufzuklären.

Einleitung

Die richtige Auswahl von Abwehrverhalten unter bedrohlichen Umständen ist entscheidend für das Überleben aller Tiere. Abwehrverhalten verschiebt sich allmählich von einem zum anderen, basierend auf der Nähe der Bedrohung, wie z. B. dem Übergang zwischen Erstarrungs- und Fluchtverhalten ^1,2,3. Eine Dysregulation dieser Verhaltensweisen wird häufig bei verschiedenen psychischen Störungen beobachtet⁴. Die posttraumatische Belastungsstörung (PTBS) ist eine solche Störung, die durch übertriebene Abwehrverhaltensweisen wie Panikreaktionen auf nicht bedrohliche Reize gekennzeichnet^{ist 4}.

Die klassische Angstkonditionierung bei Nagetieren wird häufig als Modell für PTBS verwendet ^5,6,7, aber Nagetiere zeigen in diesem Modell kein Fluchtverhalten (panikähnlich)⁸. Folglich fehlt dem klassischen Angstkonditionierungsmodell, das oft als "Nagetier-PTBS-Modell" bezeichnet wird, die Gesichtsvalidität für PTBS beim Menschen, insbesondere bei der Erfassung von Flucht- oder panikähnlichen Symptomen, die nicht gut untersucht wurden.

In jüngster Zeit haben mehrere modifizierte Angstkonditionierungsprotokolle erfolgreich gezeigt, dass Nagetiere während dieser Verfahren ein Flugverhalten zeigen. Zum Beispiel ermöglichten sich wiederholende Assoziationen eines konditionierten Stimulus (CS) und eines unkonditionierten Stimulus (US) sieben Mal am Tag weiblichen Ratten, ein schnelles Verhalten zu zeigen, das dem Flugverhalten ähnelt⁹. In zweitägigen Angstkonditionierungen mit seriellen zusammengesetzten Reizen (SCS; bestehend aus Ton, gefolgt von Lärm) begannen Mäuse, während des Lärmteils der SCS-Präsentationen Flugverhalten zu zeigen 10,11,12. Die detaillierte Beschreibung des SCS-Verfahrens ist in einem Protokollbericht¹³ enthalten. Eine dreitägige Angstkonditionierung mit SCS wirkte auch bei Ratten, um Fluchtverhalten zu induzieren¹⁴. Diese neuen Protokolle weisen jedoch einige Einschränkungen auf. Zum Beispiel erlaubt die Verwendung der seriellen Cue-Präsentation nicht den Ausschluss des Einflusses der Proximity-Schätzung auf das Verteidigungsverhalten. Im Fall der siebenfachen Assoziation von CS-US bei Ratten wurde die Mehrheit der Fluchtreaktionen bei Weibchen und nicht bei Männchen beobachtet.

Vor diesem Hintergrund führen wir ein modifiziertes Angstkonditionierungsprotokoll für Mäuse ein, um das Flugverhalten in einem ängstlichen Kontext zu untersuchen. Männliche Mäuse zeigen während unserer modifizierten Angstkonditionierung durchweg ein Flugverhalten. In diesem Protokoll wird der hervorstechende Ton als CS anstelle von SCS verwendet. Zusätzlich sind mindestens fünf Paarungen von CS-US an einem Tag für mindestens zwei Tage erforderlich, zusammen mit der Angstpotenzierung durch den konditionierten Kontext. Das Protokoll bietet eine weitere Option zur Untersuchung des Flugverhaltens und ergänzt je nach Forschungszweck frühere Protokolle.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde in Übereinstimmung mit den Leitprinzipien der Physiologischen Gesellschaft Japans durchgeführt und vom Tierpflegeausschuss der Kanazawa Medical University (2021-32) genehmigt. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Für die Studie wurden erwachsene männliche C57BL/6J-Mäuse (3-6 Monate alt) verwendet, und es wurde zuvor bestätigt, dass diese Mäuse das in diesem Manuskript beschriebene Flugverhalten zeigten¹⁵.

1. Tierische Vorbereitung

1. Gruppenhausmäuse (3-4 pro Käfig; gehalten bei 23-27 °C; unter einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus; ad libitum Zugang zu Futter und Wasser) bis zum Beginn der Experimente.
2. Halten Sie jede Maus einzeln für mindestens 3 Tage in einem Plexiglaskäfig (14 cm × 21 cm × 12 cm), bevor Sie sich dieser modifizierten Angstkonditionierung unterziehen.

2. Einrichten der Werkzeuge/Geräte

1. Angst-Konditionierungsbox (Abbildung 1A)
   1. Verwenden Sie eine Angstkonditionierungskammer (25 cm × 25 cm × 25 cm), die in einer schalldämpfenden Box (67 cm × 53 cm × 55 cm) eingeschlossen ist (siehe Materialtabelle).
   2. Es sind zwei Kontexte (A und B) erforderlich. Erstellen Sie für Kontext A schwarz-weiße Streifen an den Wänden, indem Sie weißen Plastikkarton mit schwarzen Klebebändern (3 cm Breite, 4 auf einem Brett) anbringen. Verwenden Sie eine weiße, glatte Kunststoffplatte für den Boden.
   3. Wischen Sie die Wände und den Boden vor jeder Sitzung mit Heptanol (1%) ab.
      HINWEIS: Es wird kein aktives Belüftungssystem verwendet. Die Reinigung mit Alkohol am Ende der Sitzung verringert den Heptanol-Geruch.
   4. Machen Sie für Kontext B das Erscheinungsbild von Wänden vollständig schwarz, indem Sie die in Kontext A verwendete Platte entfernen. Der Boden ist ein Rasterboden.
      HINWEIS: Es wird kein spezifischer Geruch außer einem leichten Alkoholgeruch zur Reinigung angezeigt.
   5. Beleuchten Sie die Experimentierbox mit einer weißen Overhead-Leuchtdiode (LED, 240 Lux) (siehe Materialtabelle).
2. Schauerroman
   1. Verbinden Sie einen Scramble-Schocker (siehe Materialtabelle) mit einem Gitterboden aus Edelstahlstangen. Dies wird verwendet, um Fußstöße bereitzustellen. Die Fußschockintensität wurde auf 0,9 mA festgelegt^, wobei die üblichen Methoden der Angstkonditionierung 10,11,12,13 befolgt wurden.
3. Audio-Generator
   1. Stellen Sie einen Lautsprecher (siehe Materialtabelle) an die Decke. Alle akustischen Reize werden verstärkt.
   2. Ändern und kalibrieren Sie die Gesamtamplituden jedes Stimulus digital, um Schalldruckpegel (SPL, d. h. 20 μ Pa) an der 5 cm Vorderseite des Lautsprechers mit einem 1/4-Zoll-Mikrofon zu erhalten. Präsentieren Sie einen kontinuierlichen Ton, der durch diesen Lautsprecher bricht.
      HINWEIS: Die Kalibrierung des Tonlautsprechers ist entscheidend, um die feinen Auswirkungen von Schallreizen auf das Abwehrverhalten während dieser modifizierten Angstkonditionierung zu untersuchen.
4. Absolutwertübertrager
   1. Legen Sie den Boden der Prüfkammer auf einen Wandler (siehe Materialtabelle), um Vibrationen zu erkennen. Das Signal des Wandlers wird an eine Soundkarte mit einer Abtastfrequenz von 8 kHz übertragen, um die Verhaltensschwingungen aufzuzeichnen.
5. Videokamera
   1. Positionieren Sie eine CMOS-Kamera (siehe Materialtabelle) an der Decke, um die Bewegungen des Motivs zu verfolgen und den Ton in der Konditionierungsbox aufzuzeichnen.
6. Auslösesystem
   1. Verwenden Sie eine Soundsoftware (siehe Materialtabelle), um Töne oder Fußstöße zu festgelegten Zeiten auszulösen.
      HINWEIS: Jeder handelsübliche Stimulator eignet sich dafür.

3. Verhaltensexperiment

1. Planen Sie vier Tage Angstkonditionierungsverfahren ein: Gewöhnung (1 Tag, 5 Versuche), Konditionierung (2 Tage, jeweils 5 Versuche) und Test-/Extinktionssitzungen (1 Tag, 5 oder 15 Versuche). Die Intervalle zwischen den Versuchen variierten zwischen 60 und 75 s (Abbildung 1B).
   HINWEIS: Nehmen Sie vorzugsweise zehn oder mehr Probanden in eine Gruppe auf, um zuverlässige Verhaltenstendenzen zu erhalten. Je nach Zweck der Studie sind zwei oder drei Gruppen erforderlich.
   1. Präsentieren Sie während der Konditionierungssitzung den unkonditionierten Stimulus (US) (1 s, 0,9 mA) unmittelbar nach Beendigung des konditionierten Stimulus (CS) (kontinuierlicher Tonburst, 8 kHz, 20 s, 95 dB SPL), wie in Abbildung 1B gezeigt. Liefern Sie fünf CS-US-Paare an einem Konditionstag.
   2. Lassen Sie das Subjekt nach Beendigung des 5. Fußschocks 1 Minute lang im Kontext, bevor Sie es in den Heimkäfig zurückbringen. Wischen Sie die Kammer nach jedem Verhaltenstest zur Reinigung mit 70% Alkohol ab.
      HINWEIS: Die CS- und US-Intensität kann je nach Zweck der Studie geändert werden. Frühere Berichte haben gezeigt, dass eine stärkere CS-Intensität aktiveres Abwehrverhalten auslöst als weichere¹⁵. Konditionstage können auch verlängert werden.
2. Induzieren Sie das Flugverhalten während CS-Präsentationen nach dem unten genannten Zeitplan.
   HINWEIS: IN DIESEM EXPERIMENT WERDEN EIN CS (95 dB SPL) und ein US (0,9 mA) verwendet.
   1. Setzen Sie die Probanden an Tag 1 5 CS-Einzelstudien in Kontext A aus.
   2. An den Tagen 2 und 3 konditionieren Sie die Probanden mit 5 CS-US-Assoziationsstudien in Kontext B.
   3. Setzen Sie die Probanden an Tag 4 5 CS-Einzelversuchen für die Recall-Sitzung in Kontext B aus. Im Falle des Testens der Gedächtnisauslöschung werden die Probanden 15 CS-Einzelstudien ausgesetzt.
      HINWEIS: Um die Gedächtnisstabilität zu testen, hilft es, die Extinktionssitzungen um 2-3 Tage zu verlängern. Außerdem kann das Testen des Speichers eine Woche später statt an Tag 4 eine zusätzliche Bestätigung der Gedächtnisstabilität liefern.

4. Analyse von Abwehrverhalten

HINWEIS: Bewegung, Prozentsatz des Einfrierens und die Anzahl der Sprünge während CS-Präsentationen werden analysiert. Details werden im Folgenden beschrieben. Wenn möglich, wäre eine doppelblinde Analyse besser.

1. Synchronisieren Sie das Timing von Ereignissen im Video und das Timing von Stimuli (CS und US), indem Sie den im Video aufgezeichneten Tonbeginn verwenden.
2. Verwenden Sie einen maßgeschneiderten Code, um sowohl die gemittelten als auch die Gesamtbewegungen von Mäusen basierend auf der Differenz des Schwerpunkts der Motivsilhouette über die Bilder hinweg zu berechnen.
   HINWEIS: Für diese Messung wird eine beliebige Einheit verwendet, da die Bewegungsgeschwindigkeit von der Abtastrate des Films abhängt.
3. Um den Prozentsatz des Einfrierens zu messen, verwenden Sie das Wandlersignal in der Zeit.
   1. Verarbeiten Sie Wandlersignale mit einem 20-500-Hz-Bandpassfilter.
   2. Berechnen Sie die mittlere quadratische Amplitude des Wandlersignals in der Zeit für jeden 50-ms-Bin.
   3. Legen Sie einen Schwellenwert für die Signalamplitude fest, um die Immobilitätsperiode zu erkennen. Die Dauer der Immobilität ist die Signalperiode, die länger als 1 s unter dem Schwellenwert liegt.
   4. Messen Sie manuell die Dauer des Einfrierens, indem Sie das Video ansehen.
   5. Passen Sie den Schwellenwert der Signalamplitude für das Einfrieren an, indem Sie den manuell gemessenen Prozentsatz des Einfrierens mit dem aus dem Wandlersignal berechneten Prozentsatz vergleichen.
4. Zählen Sie die Anzahl der Sprünge manuell aus Videodateien.
   HINWEIS: Das Zählen der Anzahl der Darts ist auch nützlich, um die Flugreaktion zu beurteilen.

5. Statistische Auswertung

1. Legen Sie die statistische Signifikanz auf p < 0,05 fest.
2. Führen Sie für Vergleiche zwischen mehreren Gruppen und mehreren Faktoren eine Mehrwege-ANOVA durch, gefolgt von Post-hoc-Tests. Wenn ein bestimmter Tag des Konditionierungsplans getestet wird, führen Sie mehrere Vergleichstests oder Permutationstests durch.

Ergebnisse

Die Ergebnisse, die mit der modifizierten Angstkonditionierung bei männlichen Mäusen (C57BL/6J; 3-6 Monate alt) erzielt wurden, werden nach dem in Abbildung 1C gezeigten Zeitplan dargestellt. Das Experiment sollte untersuchen, wie der konditionierte Kontext die Ausprägung des Flugverhaltens beeinflusst. Es wurden zwei Gruppen zugeordnet: Gruppe 1 (n = 10) und Gruppe 2 (n = 10). In diesem Experiment wurden ein CS (95 dB SPL) und ein US (0,9 mA) verwendet.

An Tag...

Diskussion

Das in diesem Artikel vorgestellte modifizierte Angstkonditionierungsprotokoll ist eine stabile Methode zur Untersuchung des Flugverhaltens in einem ängstlichen Kontext. Durch die Anwendung dieses Protokolls haben wir festgestellt, dass das Flugverhalten von Mäusen im ängstlichen Kontext durch hervorstechende Reize ausgelöst wird und vom Kontext abhängt. Die Merkmale des Flugverhaltens wurden nicht gut untersucht, da es kein geeignetes Protokoll zur Beobachtung des Flugverhaltens gab. Dieses Protokoll wird eine der ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Audio speaker	Fostex	FT17H
Amplifier	Sony	TA-F500
CMOS camera	Sanwa Supply Inc.	CMS-V43BK
Fear conditioning chamber	Panlab S.L.U.	LE116
Food pellets	Nosan	Labo MR standard
LED	Yamazen	LT-B05N
Microphone	ACO	type 4156N
Scramble shocker	Panlab S.L.U.	LE 100-26
Sound card	Behringer	UMC202
Sound software	Syntrillium Software	Cool Edit 2000
Transducer	Panlab S.L.U.	LE 111