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Method Article
Humane iPSC-abgeleitete 3D-Leberorganoide stellen ein potenzielles Werkzeug dar, um die Wirkung des Schilddrüsenhormons auf die Leberentwicklung zu verstehen.
Die Gewinnung stabiler Leberzellen in Kultur stellt eine große Herausforderung für Leberstudien dar. Vor diesem Hintergrund wird ein optimiertes Verfahren dargestellt, bei dem humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) zur Erzeugung von 3D-Kulturen von humanen Leberorganoiden (HHOs) verwendet werden. Die Verwendung von HHOs bietet einen wertvollen Ansatz zum Verständnis der Leberentwicklung, zur Entschlüsselung von Lebererkrankungen, zur Durchführung von Hochdurchsatzstudien für die Arzneimittelentwicklung und zur Erforschung des Potenzials für Lebertransplantationen. In der ersten Untersuchung wurde die Progression durch Immunfluoreszenz und quantitative RT-PCR-Techniken überwacht, indem das Vorhandensein verschiedener Zellpopulationen, wie z. B. Hepatoblasten und der beiden Arten von Hepatoblasten-abgeleiteten Zellen: Cholangiozyten oder hepatozytenähnliche Zellen, über verschiedene Entwicklungsstadien hinweg identifiziert wurde. Dieser Bericht stellt ein einfaches 3D-Protokoll vor, das von hiPSC ausgeht und HHOs erfasst, die die Stadien der menschlichen Embryonalentwicklung widerspiegeln. Das Protokoll, das sich über 46 bis 50 Tage erstreckt, umfasst mehrere Schritte: (i) sorgfältiges Management der hiPSC-Kultur zur Erzeugung von HHOs, (ii) Initiierung der Zelldifferenzierung in 2D und den anschließenden Übergang zu 3D und (iii) eine optimierte Dissoziationsstrategie zur Zerlegung von HHOs in Einzelzellen für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Um die breite Anwendung dieses Ansatzes zu veranschaulichen, wurde das vorliegende Protokoll zuvor angewendet, um die Rolle der Schilddrüsenhormon-Signalübertragung bei der Entwicklung von Leberzellen zu entschlüsseln.
Die Leber erfüllt verschiedene Stoffwechselfunktionen, wie z.B. die Regulierung der Verfügbarkeit von leicht nutzbaren Energiesubstraten wie Glukose- und Ketonkörpern sowie die Entgiftung xenobiotischer Verbindungen. In den letzten Jahren ist ein signifikanter Anstieg der Prävalenz von Lebererkrankungen zu verzeichnen, die weitgehend auf die nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) zurückzuführen sind und unbehandelt zu Leberzirrhose oder Krebs führen können1. Daher ist es unerlässlich, die Stoffwechselfunktionen der Leber und der damit verbundenen Krankheiten zu verstehen, um die Entwicklung wirksamer Behandlungen zu erleichtern 2,3.
Das Aufkommen dreidimensionaler (3D) Kulturen hat zur Entwicklung des Organoidmodells geführt, das einen bahnbrechenden und innovativen Ansatz darstellt, um die Funktionalität und Komplexität der Organentwicklung zu untersuchen4. Organoide sind definiert als selbstorganisierte 3D-Aggregate differenzierter Zellen, die die Funktionen und die Zytoarchitektur des jeweiligen Organs nachahmen5.
In den letzten Jahrzehnten hat eine Vielzahl von Protokollen für humane Leberorganoide (HHO) ein breites Interesse geweckt, das von der Verwendung verschiedener humaner iPSC-abgeleiteter Zellen6 oder ausschließlich hepatozytenähnlicher Zellen7 bis hin zum Einbau einer Vielzahl komplizierter Mikroumgebungen von Wachstumsfaktoren oder Inhibitoren und der Differenzierung von Vorläuferzellen in Monoschicht7 oder 3D8 reicht. Diese Ansätze eignen sich für eine Vielzahl potenzieller Ziele, vom Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening9 bis hin zur Gewinnung weiterer Einblicke in die Mechanismen, die Lebererkrankungen zugrunde liegen10.
Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll der HHO-Differenzierung auf der Grundlage der genannten chemischen Hinweise11 durchgeführt, mit methodisch angepassten Variationen. Dieses Protokoll beginnt mit der angemessenen Handhabung und Kultivierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) und beschreibt Techniken für die Manipulation von extrazellulären Matrixgelen, die Zellpassage und die Differenzierung in HHOs. Der Prozess beginnt mit der Stimulierung der Differenzierung von hiPS-Zellen in ein definitives Endoderm (DE)12 und anschließend mit der Nachahmung der In-vivo-Effekte von FGF und BMP, um die Entwicklung von Monolayer-Zellen des hinteren Vorderdarms (PFG) zu fördern13. Die 3D-Architektur wird an Tag 10 erreicht, wenn die PFG-Zellen in eine unreife Leberphase differenziert werden, die zu den Hepatoblasten wird, der fetalen Vorläuferzelle der Cholangiozyten und Hepatozyten2. Schließlich werden die 3D-Strukturen für RNA-Sequenzierungsstudien in einzelne Zellen dissoziiert. Als Beispiel für die Anwendbarkeit dieses Protokolls wurde gezeigt, wie sich dieses HHO-Modell für die Untersuchung der Wirkung von Schilddrüsenhormonen und der Typ-2-Deiodinase (D2) auf die Entwicklung von Hepatozyten und Cholangiozyten eignet14.
1. Management von hiPSC
HINWEIS: hiPSCs (CS03iCTR-n3-Zelllinie) wurden kommerziell gekauft. Das richtige Management der extrazellulären Matrix-Gel-Beschichtung und des hiPS-Mediums ist der Schlüssel, um die hiPSCs an den Platten zu befestigen und ihnen zuzuführen. Hier wurden die Volumina beschrieben, die für eine 6-Well-Platte benötigt werden. Die verbleibenden hiPS-Zellen aus der 6-Well-Platte, die sich nicht in Organoide differenzieren, können zur Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff gelagert werden.
2. Schrittweise Differenzierung von hiPSC in Leberorganoide
HINWEIS: Die Rekonstitution der Reagenzien wurde gemäß den Richtlinien des Herstellers durchgeführt und befolgt.
3. Einzelzell-Dissoziation
HINWEIS: Dieser Schritt ist für die Einzelzell-RNA-Sequenzierungstechnik von entscheidender Bedeutung. Die Anzahl der Organoide kann je nach Größe variieren, und je älter der Tag der Dissoziation ist, desto größer ist die Anzahl der Zellen in den Organoiden. In früheren Zeiten nahm die Anzahl der dissoziierten Organoide zu, und die Dissoziationszeiten verkürzten sich bei gleichen Mengen. Die Dissoziation wurde mit 10 Organoiden an D-14 und D-17, 8 Organoiden an D-23 und D-26 und 6 Organoiden an D-30 und D-45 durchgeführt. Die Verfahren für einen Cluster von Organoiden sind detailliert beschrieben (Abbildung 1F).
Jede Stufe dieses Protokolls der schrittweisen Differenzierung von hiPSC in HHOs wurde unter Verwendung quantitativer Messungen mittels qPCR und Immunfluoreszenz von stadienspezifischen bekannten Markern aus der Bibliographie definiert (Abbildung 2). Die Schritt-für-Schritt-Vorgehensweise beider Techniken und die erzielten Ergebnisse in Bezug auf die korrekte Differenzierung in HOs wurden in14 dargestellt. In der vorangegangenen Unte...
Das aktuelle Protokoll bietet verschiedene methodische Details zum Umgang mit hiPS-Zellen und den anschließenden 3D-Organoidkulturen. Dazu gehören die beiden wichtigsten kritischen Schritte: (i) das Ablösen der 2D-Kulturen und ihre Entwicklung zu 3D-Leberorganoiden nach 10 Tagen sowie (ii) die zarte Dissoziation einer 3D-Struktur in einzelne Zellen. Basierend auf den verfügbaren Informationen ist dies der erste Bericht über ein 3D-HHO-Modell zur Untersuchung der Wirkung von Schilddr...
Antonio C. Bianco ist Berater für Abbvie, Acella, Aligos und Synthonics. Die anderen Autoren haben keine relevanten Angaben.
Diese Arbeit wurde unterstützt vom National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK -DK58538, DK65066, DK77148; ACB).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 µL Universal Pipette Tips Filtered, Low rentention, Pre-sterile | VWR | 613-6462 | All procedures |
1000 µL Universal Pipette Tips Filtered, Low rentention, Pre-sterile | VWR | 613-6470 | All procedures |
15 mL Polypropilene Conical Tube | Falcon (Corning) | 352097 | Dissociation Hepatic Organoids |
200 µL Universal Pipette Tips Filtered, Low rentention, Pre-sterile | VWR | 613-6465 | All procedures |
3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma | T2877-100 | Hepatic Organoid differentiation |
40 μm Cell Strainer | Corning | 431750 | Dissociation Hepatic Organoids |
50 mL tube | Falcon (Corning) | 352070 | All procedures |
6 well-plate Nunc Cell-Culture Treated Multidishes | Thermo fisher scientific | 140675 | hiPSC maintenance |
A83-01 | R&D Systems | 2939/10 | Hepatic Organoid differentiation |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | Hepatic Organoid differentiation |
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips | ART | 2069GPK | All procedures |
B27 supplement | Gibco | 17504044 | Hepatic Organoid differentiation |
BMP7 | R&D Systems | 354-BP-010/CF | Hepatic Organoid differentiation |
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Gibco | 15260037 | Dissociation Hepatic Organoids |
BSA, Fraction V, Fatty Acid Free for Tissue Culture | GoldBio | A-421-100 | Dissociation Hepatic Organoids |
CHIR99021 | R&D Systems | 4423/10 | Hepatic Organoid differentiation |
Corning 96-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment | Corning | 3474 | Hepatic Organoid differentiation |
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment | Corning | 3471 | Hepatic Organoid differentiation |
CS03iCTR-n3 human induced Pluripotent Stem Cell line | Cedar-sinai | hiPSC maintenance | |
DAPT | R&D Systems | 2634/10 | Hepatic Organoid differentiation |
dbCAMP | Millipore Sigma | D0627-100MG | Hepatic Organoid differentiation |
Dexamethasone | R&D Systems | 1126/100 | Hepatic Organoid differentiation |
DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | hiPSC maintenance |
DNAse I, RNase-free, HC | Thermo Fisher scientific | EN0523 | Dissociation Hepatic Organoids |
Falcon 10 mL Serological Pipet, Polystyrene, 0.1 Increments, Individually Packed, Sterile | Corning | 357551 | All procedures |
Falcon 5 mL Serological Pipet, Polystyrene, 0.1 Increments, Individually Packed, Sterile | Corning | 357543 | All procedures |
Falcon 50 mL Serological pipet, Polystyrene, 1.0 Increments, Individually Packed, Sterile | Corning | 357550 | All procedures |
Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) | Stemcell Technologies | 100-0485 | Hepatic Organoid differentiation |
Glutamax supplement | Gibco | 35050061 | Hepatic Organoid differentiation |
L-Thyroxine | Sigma | T1775-1G | Hepatic Organoid differentiation |
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free, 5 mL | Corning | 354277 | Extracellular matrix gel |
mFreSR | Stemcell Technologies | 5855 | hiPSC cryopreservation medium |
mTeSR 5x Supplement | Stemcell Technologies | 100-0276 | hiPSC medium |
mTeSR Plus | Stemcell Technologies | 100-0276 | hiPSC medium |
Multi Platform Shaker | Fisherbrand (Thermo Fisher technologies) | 88861021 | Hepatic Organoid differentiation |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | Hepatic Organoid differentiation |
Nicotinamide | R&D Systems | 4106/50 | Hepatic Organoid differentiation |
PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | hiPSC maintenance |
Recombinant human BMP4 | R&D Systems | 314-BP-010/CF | Hepatic Organoid differentiation |
Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG-200 | Hepatic Organoid differentiation |
Recombinant human FGF basic/FGF2/bFGF | R&D Systems | 233-FB-010/CF | Hepatic Organoid differentiation |
Recombinant human FGF19 | R&D Systems | 959-FG-025/CF | Hepatic Organoid differentiation |
Recombinant human HGF | R&D Systems | 294-HG-005/CF | Hepatic Organoid differentiation |
Recombinant Human Jagged-1 Fc Chimera | R&D Systems | 1277-JG-050 | Hepatic Organoid differentiation |
Recombinant human KGF/FGF7 | R&D Systems | 251-KG-010/CF | Hepatic Organoid differentiation |
ReLeSR | Stemcell Technologies | 100-0483 | hiPSC detaching medium |
RNAse Inhibitor Ambion, cloned, 40 U/μL | Invitrogen | AM2682 | Dissociation Hepatic Organoids |
RNase Zap | Invitrogen | AM9780 | Dissociation Hepatic Organoids |
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75004539 | All procedures |
STEMdiff Definitive Endoderm Kit | Stemcell Technologies | 5110 | Hepatic Organoid differentiation |
Trypan Blue solution (0.4%) | Gibco | 15250061 | Dye solution |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | Cell Dissociation enzyme |
Trypsin 0.5% - EDTA (10X) | Gibco | 15400054 | Dissociation Hepatic Organoids |
Valproic acid, sodium salt | R&D Systems | 2815/100 | Hepatic Organoid differentiation |
Vari-Mix Platform Rocker | Thermo Fisher scientific | M79735Q | Dissociation Hepatic Organoids |
Y-27632 dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Hepatic Organoid differentiation |
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