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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Humane iPSC-abgeleitete 3D-Leberorganoide stellen ein potenzielles Werkzeug dar, um die Wirkung des Schilddrüsenhormons auf die Leberentwicklung zu verstehen.

Zusammenfassung

Die Gewinnung stabiler Leberzellen in Kultur stellt eine große Herausforderung für Leberstudien dar. Vor diesem Hintergrund wird ein optimiertes Verfahren dargestellt, bei dem humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) zur Erzeugung von 3D-Kulturen von humanen Leberorganoiden (HHOs) verwendet werden. Die Verwendung von HHOs bietet einen wertvollen Ansatz zum Verständnis der Leberentwicklung, zur Entschlüsselung von Lebererkrankungen, zur Durchführung von Hochdurchsatzstudien für die Arzneimittelentwicklung und zur Erforschung des Potenzials für Lebertransplantationen. In der ersten Untersuchung wurde die Progression durch Immunfluoreszenz und quantitative RT-PCR-Techniken überwacht, indem das Vorhandensein verschiedener Zellpopulationen, wie z. B. Hepatoblasten und der beiden Arten von Hepatoblasten-abgeleiteten Zellen: Cholangiozyten oder hepatozytenähnliche Zellen, über verschiedene Entwicklungsstadien hinweg identifiziert wurde. Dieser Bericht stellt ein einfaches 3D-Protokoll vor, das von hiPSC ausgeht und HHOs erfasst, die die Stadien der menschlichen Embryonalentwicklung widerspiegeln. Das Protokoll, das sich über 46 bis 50 Tage erstreckt, umfasst mehrere Schritte: (i) sorgfältiges Management der hiPSC-Kultur zur Erzeugung von HHOs, (ii) Initiierung der Zelldifferenzierung in 2D und den anschließenden Übergang zu 3D und (iii) eine optimierte Dissoziationsstrategie zur Zerlegung von HHOs in Einzelzellen für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Um die breite Anwendung dieses Ansatzes zu veranschaulichen, wurde das vorliegende Protokoll zuvor angewendet, um die Rolle der Schilddrüsenhormon-Signalübertragung bei der Entwicklung von Leberzellen zu entschlüsseln.

Einleitung

Die Leber erfüllt verschiedene Stoffwechselfunktionen, wie z.B. die Regulierung der Verfügbarkeit von leicht nutzbaren Energiesubstraten wie Glukose- und Ketonkörpern sowie die Entgiftung xenobiotischer Verbindungen. In den letzten Jahren ist ein signifikanter Anstieg der Prävalenz von Lebererkrankungen zu verzeichnen, die weitgehend auf die nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) zurückzuführen sind und unbehandelt zu Leberzirrhose oder Krebs führen können1. Daher ist es unerlässlich, die Stoffwechselfunktionen der Leber und der damit verbundenen Krankheiten zu verstehen, um die Entwicklung wirksamer Behandlungen zu erleichtern 2,3.

Das Aufkommen dreidimensionaler (3D) Kulturen hat zur Entwicklung des Organoidmodells geführt, das einen bahnbrechenden und innovativen Ansatz darstellt, um die Funktionalität und Komplexität der Organentwicklung zu untersuchen4. Organoide sind definiert als selbstorganisierte 3D-Aggregate differenzierter Zellen, die die Funktionen und die Zytoarchitektur des jeweiligen Organs nachahmen5.

In den letzten Jahrzehnten hat eine Vielzahl von Protokollen für humane Leberorganoide (HHO) ein breites Interesse geweckt, das von der Verwendung verschiedener humaner iPSC-abgeleiteter Zellen6 oder ausschließlich hepatozytenähnlicher Zellen7 bis hin zum Einbau einer Vielzahl komplizierter Mikroumgebungen von Wachstumsfaktoren oder Inhibitoren und der Differenzierung von Vorläuferzellen in Monoschicht7 oder 3D8 reicht. Diese Ansätze eignen sich für eine Vielzahl potenzieller Ziele, vom Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening9 bis hin zur Gewinnung weiterer Einblicke in die Mechanismen, die Lebererkrankungen zugrunde liegen10.

Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll der HHO-Differenzierung auf der Grundlage der genannten chemischen Hinweise11 durchgeführt, mit methodisch angepassten Variationen. Dieses Protokoll beginnt mit der angemessenen Handhabung und Kultivierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) und beschreibt Techniken für die Manipulation von extrazellulären Matrixgelen, die Zellpassage und die Differenzierung in HHOs. Der Prozess beginnt mit der Stimulierung der Differenzierung von hiPS-Zellen in ein definitives Endoderm (DE)12 und anschließend mit der Nachahmung der In-vivo-Effekte von FGF und BMP, um die Entwicklung von Monolayer-Zellen des hinteren Vorderdarms (PFG) zu fördern13. Die 3D-Architektur wird an Tag 10 erreicht, wenn die PFG-Zellen in eine unreife Leberphase differenziert werden, die zu den Hepatoblasten wird, der fetalen Vorläuferzelle der Cholangiozyten und Hepatozyten2. Schließlich werden die 3D-Strukturen für RNA-Sequenzierungsstudien in einzelne Zellen dissoziiert. Als Beispiel für die Anwendbarkeit dieses Protokolls wurde gezeigt, wie sich dieses HHO-Modell für die Untersuchung der Wirkung von Schilddrüsenhormonen und der Typ-2-Deiodinase (D2) auf die Entwicklung von Hepatozyten und Cholangiozyten eignet14.

Protokoll

1. Management von hiPSC

HINWEIS: hiPSCs (CS03iCTR-n3-Zelllinie) wurden kommerziell gekauft. Das richtige Management der extrazellulären Matrix-Gel-Beschichtung und des hiPS-Mediums ist der Schlüssel, um die hiPSCs an den Platten zu befestigen und ihnen zuzuführen. Hier wurden die Volumina beschrieben, die für eine 6-Well-Platte benötigt werden. Die verbleibenden hiPS-Zellen aus der 6-Well-Platte, die sich nicht in Organoide differenzieren, können zur Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff gelagert werden.

  1. Dispensieren von extrazellulärem Matrixgel und hiPSC-Medium
    1. Tauen Sie die Flasche mit dem extrazellulären Matrix-Gel ordnungsgemäß auf, indem Sie sie über Nacht in ein Gefäß mit 4 °C Eis geben.
      HINWEIS: Überprüfen Sie vor der Aliquotierung das Analysezertifikat, um das Volumen für den Verdünnungsfaktor zu überprüfen. Dies stellt die Proteinkonzentration des extrazellulären Matrixgels dar; Daher variiert es von einer Charge zur anderen.
    2. Verteilen Sie das extrazelluläre Matrixgel entsprechend dem Verdünnungsfaktor (4x, 2x und 1x) in geeigneten Aliquoten mit vorgekühlten und markierten Röhrchen. Fügen Sie einen 4-fachen Verdünnungsfaktor aus extrazellulärem Matrixgel zu 25 ml kaltem DMEM/F12 hinzu, um vier 6-Well-Platten zu beschichten. Verschließen Sie die Deckel umgehend mit Labor-Siegelfolie und frieren Sie sie bei -80 °C ein. Vermeiden Sie eine längere Exposition gegenüber der Luft und die Bildung von Blasen in den Aliquoten.
    3. Tauen Sie 100 mL des hiPSC-Ergänzungsmediums über Nacht bei 4 °C auf. Geben Sie es zu 400 mL hiPSC-Basalmedium. Nach der Homogenisierung mit einer serologischen 50-ml-Pipette aliquotieren Sie das hiPSC-Medium in 40-ml-Röhrchen und frieren es bis zur Verwendung bei -20 °C ein.
  2. Plattenbeschichtung für die hiPSC-Kultur
    1. Nummerieren und beschriften Sie die 6-Well-Platte(n). Bewahren Sie ein extrazelluläres Matrix-Gel aliquot in der Nähe auf und tauchen Sie es in Trockeneis.
    2. Für die Beschichtung einer 6-Well-Platte verdünnen Sie ein aliquotiertes extrazelluläres Matrixgel (1x) in 6,25 mL kaltes DMEM/F12 (2x in 12,5 mL und 4x in 25 mL DMEM/F12).
    3. Pipettieren Sie ein kleines Volumen DMEM/F12 (~500 μL) in das extrazelluläre Matrix-Gelröhrchen. Schwenken Sie auf und ab, um das extrazelluläre Matrixgel mit kaltem DMEM/F12 aufzutauen und zu homogenisieren, um die Bildung von Blasen zu verhindern, und geben Sie es mit einer serologischen Pipette in den Rest des kalten DMEM/F12-haltigen Röhrchens zurück, um es vollständig zu mischen.
    4. Betten Sie 1 ml extrazelluläres Matrixgel in DMEM/F12 in eine Vertiefung ein, um die 6-Well-Platte zu beschichten (6 mL für die gesamte Platte). Verteilen Sie den 1 ml gleichmäßig auf der Oberfläche, indem Sie die Platte ohne Schütteln bewegen, bis sie vollständig bedeckt ist.
    5. Vor Gebrauch 1 h bei Raumtemperatur (RT) ziehen lassen. Wenn die 6-Well-Platte nicht vollständig verwendet wird, verschließen Sie sie mit Labor-Siegelfolie und lagern Sie sie im Kühlschrank bei 4 °C.
      HINWEIS: Eine beschichtete Platte kann 1 Woche im Kühlschrank bei 4 °C gelagert werden.
  3. Auftauen und Kultivierung von hiPSC
    1. Berechnen Sie im Voraus das Volumen von hiPSC medium und warm bei RT zusammen mit der 6-Well-beschichteten Platte 1 h vor der Verwendung (2 mL pro Well).
      HINWEIS: Bei kalten oder gefrorenen Aliquoten sollten diese 15 Minuten vor Gebrauch in einen 37 °C heißen Inkubator oder ein Wasserbad getaucht werden.
    2. 1 ml hiPS-Zellen in flüssigem N2 aus einem Kryofläschchen in 3 Vertiefungen einer 6-Well-Platte aufteilen (Verhältnis 1:3). Für eine ganze 6-Well-Platte verwenden Sie 2 Kryoröhrchen. Hier beschreibt das Protokoll das Auftauen und die Kultivierung von hiPS-Zellen aus einem Kryofläschchen. Wiederholen Sie den Vorgang für 2 Kryoröhrchen.
    3. Das Kryofläschchen mit ca. 1 ml gefrorenen hiPS-Zellen wird eingeführt, indem es durch die Kappe gehalten und durch das oberflächliche Wasser geschoben wird, wobei der Boden des Fläschchens bis zum Auftauen in ein Wasserbad bei 37 °C getaucht wird.
    4. Nach dem Auftauen besprühen Sie das Kryofläschchen mit Ethanol und pipettieren Sie die 1 ml hiPSCs. Langsam in ein leeres konisches 15-ml-Röhrchen geben. Geben Sie Tropfen für Tropfen 5 mL warmes hiPSC-Medium hinzu und schütteln Sie das Röhrchen leicht.
    5. Das Röhrchen wird bei 300 x g für 5 min bei RT zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig entfernt, indem man mit einer Glaspipette, die mit dem Vakuum verbunden ist, aspiriert, ohne das Pellet zu stören und etwas Restmedium zu hinterlassen. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 6 mL Medium und fügen Sie dann 2 mL pro Well in 3 Wells der 6-Well-Platte hinzu.
      HINWEIS: Lassen Sie kleine Aggregate von hiPSCs für ein korrektes Wachstum übrig.
    6. Biegen Sie die 6-Well-Platte um und aspirieren Sie das extrazelluläre Matrixgel aus der zuvor beschichteten Platte, ohne die Spitze mit dem Boden des Wells zu berühren.
    7. Übertragen Sie 2 mL des Mediums mit hiPSCs pro Well. Schütteln Sie die Platte vorsichtig nach vorne, hinten und von einer Seite zur anderen, um die hiPSC-Aggregate gleichmäßig auf der Platte zu verteilen.
    8. Stellen Sie die 6-Well-Platte bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit in einen Inkubator. Wechseln Sie das Medium täglich (2 ml pro Well) und überprüfen Sie das fortschreitende Wachstum.
    9. Passage hiPSCs, wenn 80% Wachstumskonfluenz erreicht wird (nach 4-5 Tagen; siehe Abbildung 1A). Zu den Merkmalen gesunder und proliferativer hiPSCs gehören klare Grenzen und eine enge Packung großer Zellkerne im Zentrum der wachsenden Zellaggregationen.
  4. Passage von hiPSC
    1. Sobald die hiPSCs eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, was etwa 1,2 x 106 Zellen pro Well anzeigt, wird in eine neue 6-Well-Platte überführt. Teilen Sie in einem Verhältnis von 1:3 (von 1 Vertiefung in 3) oder passen Sie das Verhältnis (1:4; 1:6) entsprechend den Anforderungen des Experiments an.
    2. Bereiten Sie vor dem Passaging die erforderliche extrazelluläre Matrix-Geleinbettung für die entsprechende Anzahl von 6-Well-Platten vor, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
    3. Entfernen Sie den Überstand aus jeder Vertiefung und fügen Sie 2 ml PBS pro Vertiefung hinzu. Aspirieren Sie das PBS, gefolgt von der Zugabe von 1 ml hiPSC-Ablösemedium pro Vertiefung für 1 Minute. Entfernen Sie dann das 1 mL hiPSC-Ablösemedium.
    4. Stellen Sie die 6-Well-Platte für 7 min in einen Inkubator bei 37 °C. Fügen Sie 1 ml hiPSC-Medium pro Vertiefung hinzu. Lösen Sie es ab und sammeln Sie es, indem Sie 1 ml des hiPSC-Mediums mit den Zellen in das 15-ml-Röhrchen pipettieren.
    5. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g für 5 min bei RT. Um die Zellen in eine 6-Well-Platte zu plättieren, wiederholen Sie die Schritte 1.3.5-1.3.7. Stellen Sie die 6-Well-Platte bei 37 °C, 5 % CO 2 und 95 % Luftfeuchtigkeit in einen Inkubator. Fahren Sie mit Schritt 1.5 fort. um hiPSC bei Bedarf einzufrieren.
  5. Einfrieren von hiPSC (optional)
    HINWEIS: Die Anzahl der hiPSCs, die für die Beförderung in HOs erforderlich sind, kann dazu führen, dass Vertiefungen übrig bleiben, die langfristig gelagert werden können. Sollte es notwendig sein, den Durchgang für die Kryoviallagerung zu erweitern, können die hiPSCs über längere Zeiträume aufbewahrt werden.
    1. Tauen Sie das erforderliche Volumen des Kryokonservierungsmediums (1 ml pro Mulde Zellen) bei 4 °C in Eis auf. Beschriften Sie Kryoröhrchen mit der Anzahl der Durchgänge, dem Datum und der Zelllinie. Die Zellen werden mit dem hiPSC-Ablösemedium wie in Schritt 1.4 abgelöst. in einem konischen 15-ml-Röhrchen.
    2. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 5 min bei RT. Saugen Sie den Überstand vollständig an, wobei das Küvettenpellet vorsichtig ungestört bleibt. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 1 ml kaltem Kryokonservierungsmedium (pro Vertiefung), indem Sie hiPSC-Aggregate belassen.
      HINWEIS: Wenn die Vertiefungen eine niedrige Dichte von weniger als 50 % konfluent aufweisen, kann 1 ml Kryokonservierungsmedium pro 2 Vertiefungen verwendet werden.
    3. Übertragen Sie 1 ml Kryokonservierungsmedium mit den hiPSCs in das Kryoröhrchen. Bewegen Sie das Kryoröhrchen vorsichtig, um den Zellinhalt zu homogenisieren.
      HINWEIS: Wenn Sie weitere Röhrchen für die Kryokonservierung vorbereiten, lassen Sie die bereits vorbereiteten Röhrchen im Eis.
    4. Legen Sie die Röhrchen über Nacht bei -80 °C in den Gefrierbehälter mit kontrollierter Rate. Füllen Sie die Schläuche nach 24 h in den Flüssigstickstofftank.

2. Schrittweise Differenzierung von hiPSC in Leberorganoide

HINWEIS: Die Rekonstitution der Reagenzien wurde gemäß den Richtlinien des Herstellers durchgeführt und befolgt.

  1. 2D-Differenzierung von hiPSC in DE (Tag 0-Tag 4 (D-0 bis D-4); Abbildung 1B)
    1. Wenn die Zellen nach 3 Passagen gesund sind und gut und schnell wachsen, fahren Sie mit der Differenzierung des hiPSC fort. Beschichten Sie eine 6-Well-Platte wie in Schritt 1.2 beschrieben. Um hiPSC in DE zu unterscheiden, verwenden Sie das DE-Kit, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen.
    2. Vor Beginn der Differenzierung werden hiPS-Zellen in einem Passageverhältnis von 2:1 (von 6 Vertiefungen auf 3 zum Beginn der Differenzierung) für 24 Stunden kultiviert, um die in den DE-Anweisungen angegebene Zellkonzentration in der Vertiefung zu erreichen.
    3. Führen Sie die Unterscheidung gemäß dem Protokoll des Herstellers mit den folgenden Änderungen durch.
      1. Erhöhung der Konzentration von Y-27632, das zu hiPSC hinzugefügt wird, von 10 μM auf 50 μM (einen Tag vor Beginn der Differenzierung).
      2. Erhöhen Sie 1,5 mL pro Vertiefung des Dissoziationsreagenzes und auch das Volumen von DMEM/F12 auf die gleiche Menge pro Vertiefung wie das Dissoziationsreagenz. Geben Sie 1 ml DMEM/F12 (von 1,5) in jede Vertiefung und akkumulieren Sie weitere 0,5 ml in ein 15- oder 50-ml-Röhrchen.
  2. Differenzierung von DE-Zellen in PFG-Zellen (D-4 bis D-10; Abbildung 1C)
    1. PFG-Medium (Advanced DMEM/F12 als Basalmedium, 1x Glutamax-Supplement, 1x B27-Supplement, 20 ng/mL BMP4, 10 ng/mL FGF2) für die Differenzierung der DE-Zellen Tage vor der Induktion in PFG vorbereiten und bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: B27 enthält T3 als Teil seiner Zusammensetzung. Im Falle von Schilddrüsenhormon (TH)-Studien sollte B27 von hier an durch hausgemachtes B2615 ersetzt werden, das kein TH enthält.
    2. Erwärmen Sie das PFG-Medium (2 mL pro Well) und das erweiterte DMEM/F12 15 min lang auf 37 °C oder 1 h lang RT. Beugen Sie sich über die Platte und saugen Sie das DE-Medium mit einer Glaspipette, die mit einem Vakuum verbunden ist (oder manuell mit einer P1000-Pipette), aus den Vertiefungen ab, ohne die Zellen zu zerkratzen.
    3. Geben Sie 2 mL warmes Advanced DMEM/F12 pro Vertiefung hinzu und aspirieren Sie es. Geben Sie 2 ml warmes PFG-Medium pro Vertiefung in die 6-Well-Platte. Wechseln Sie das Medium täglich für die nächsten 6 Tage.
  3. Induktion von 2D-PFG-Zellen zu 3D-unreifen Leberorganoiden (IHOs; D-10 bis D-18)
    HINWEIS: Es werden fast 30.000 bis 35.000 Zellen in 30 μl benötigt, die in jede Vertiefung der 96-Well-ULA-Platte gegeben werden. Das Durchgangsverhältnis beträgt 2:1 aus 2 Vertiefungen (6-Well-Platte) mit einer Monoschicht aus differenzierten PFG-Zellen; Es bietet eine vollständige 96-Well-ULA-Platte (Ultra-Low Attachment) (Abbildung 1D).
    1. Vor Beginn der 3D-Organoide oder in früheren Tagen, bereiten Sie zuvor das IHO-Medium vor (Advanced DMEM/F12 als Basalmedium, 1x N2 Supplement, 1x B27, 50 nM A83-01, 30 μM Dexamethason, 5 μM CHIR99021, 500 nM Valproinsäure, 50 ng/mL humaner epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 20 ng/mL humaner Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), 40 ng/mL Jagged-1, 300 ng/mL N-6,20-O-Dibutyryladenosin, 30,50-cyclisches 35-Monophosphat-Natriumsalz (dbCAMP), 10 μM Nicotinamid) und lagern Sie es bei 4 °C.
    2. Beschriften Sie eine 96-Well-ULA-Platte (Ultra-Low Attachment). Zum Ablösen der PFG-Zellen verwenden Sie das Zelldissoziationsenzym gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    3. Erwärmen Sie das Dissoziationsenzym, das fortschrittliche DMEM/F12 und PBS vor der Verwendung auf 37 °C. Aspirieren und entsorgen Sie das PFG-Medium aus den Vertiefungen. Fügen Sie 2 ml PBS pro Vertiefung hinzu und aspirieren Sie es.
    4. Fügen Sie 1,5 ml Zelldissoziationsenzym pro Vertiefung bei 37 °C für 7 Minuten hinzu, um die Zellen aus der Vertiefung zu lösen. Ohne das Zelldissoziationsenzym zu entfernen, fügen Sie 1 ml fortgeschrittenes DMEM hinzu. Sammeln Sie alle Zellen und geben Sie sie in ein 50-ml-Röhrchen.
    5. Zählen Sie die Anzahl der Zellen pro ml mit einem Zellzähler oder einem Hämozytometer. Bei 150 x g 8 min zentrifugieren.
    6. Geben Sie das entsprechende Volumen (3 ml IHO-Medium für eine gesamte 96-Well-ULA-Platte) und 1x extrazelluläres Matrixgel in das Pellet, um es auf die endgültige Anzahl der benötigten Zellen (30.000-35.000 Zellen) einzustellen.
    7. Stellen Sie die 96-Well-Platte in einen Inkubator, der auf 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit eingestellt ist. Nach 24 Stunden (D-11) gruppieren sich die Zellen in einer kreisförmigen Form neu; Fügen Sie 50 μl des IHO-Mediums pro Vertiefung hinzu.
    8. Am nächsten Tag (D-12) auf 100 μl IHO-Medium pro Vertiefung erhöhen. Bei D14 werden ~100-120 μl aus jeder Vertiefung entnommen, entweder mit der Glaspipette, die an ein Vakuum angeschlossen ist, oder mit einer Pipette nacheinander. Achten Sie darauf, die Organoide nicht abzugasen. 100 μl IHO-Medium an D-14 und D-16 zugeben.
      HINWEIS: Nach D-16 tritt aufgrund der Nicht-Bewegung ein übermäßiges Wachstum auf, das nach D18 verschwindet.
  4. Hepatoblast-Organoide (HBOs, D-18 bis D-26)
    HINWEIS: In diesem Schritt werden IHOs von der 96-Well-ULA-Platte in eine 6-Well-ULA-Platte umgelagert. Für 96 IHOs aus der vorherigen Phase wurden 10 Organoide pro Vertiefung platziert, was insgesamt 1 1/2 6-Well-ULA-Platten entspricht, um mit der Reifung fortzufahren (Abbildung 1E).
    1. Wie in den vorherigen Schritten der Differenzierung vorbereitet, bereiten Sie das HBO-Differenzierungsmedium in den vorangegangenen Tagen vor.
      1. Der Cocktail von Reagenzien, der zur Unterscheidung in HBOs verwendet wird, wird in Schritt 2.3 beschrieben. Entfernen Sie die Valproinsäure und fügen Sie dem Cocktail die folgenden Biochemikalien hinzu: BMP7, BMP4 und FGF7. Die endgültige Zusammensetzung besteht aus Advanced DMEM/F12 als Basalmedium, 1x N2-Supplement, 1x B27, 50 nM A83-01, 30 μM Dexamethason, 5 μM CHIR99021, 500 nM Valproinsäure, 50 ng/ml humaner epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 20 ng/ml humaner Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), 40 ng/mL Jagged-1, 300 ng/mL N-6,20-O-Dibutyryladenosin 30,50-cyclisches 35-Monophosphat-Natriumsalz (dbCAMP), 10 μM Nicotinamid, 25 ng/ml FGF7, 50 ng/mL BMP4, 20 ng/ml BMP7.
    2. Erwärmen Sie zuvor HBO-Medium (3 mL pro Well) und Advanced DMEM/F12 (3 mL pro Well) bei 37 °C. Geben Sie 3 mL warmes Advanced DMEM/F12 in jede Vertiefung.
    3. Verteilen Sie 10 IHO-Organoide pro Vertiefung aus der 96-Well-Platte mit einer 200 ml breiten Bohrungsspitze. Entfernen Sie das fortschrittliche DMEM/F12, indem Sie sich über die Platte beugen und es mit der Glaspipette, die an das Vakuum angeschlossen ist, (oder manuell mit einer P1000) absaugen.
    4. Fügen Sie 3 ml warmes HBO-Medium pro Vertiefung hinzu. Schalten Sie die 6-Well-ULA-Platten ein und platzieren Sie sie auf einem Multiplattform-Shaker bei 65 U/min im Inkubator, der auf 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit eingestellt ist. Ersetzen Sie nach 4 Tagen (D-22) und 6 Tagen (D-24) das HBO-Medium (3 mL pro Well).
  5. Reifung zu Leberorganoiden (HO) durch 2 verschiedene Phasen (D-26 bis D-46)
    HINWEIS: Dies ist der letzte Reifungsprozess, der in zwei Differenzierungsperioden aufgrund des Inhalts und der Art der Reagenzien im Medium stattfindet.
    1. Bereiten Sie im Voraus das erste HO (HO1)-Medium vor und lagern Sie es bei 4 °C. Entfernen Sie Jagged1 und verringern Sie die Konzentration von CHIR99021 im Vergleich zum HBO-Medium. Die endgültige Zusammensetzung ist: Advanced DMEM/F12 als Basalmedium, 1x N2 Supplement, 1x B27, 500 nM A83-01, 30 μM Dexamethason, 2 μM CHIR99021, 50 ng/mL humaner epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 20 ng/ml humaner Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), 300 ng/mL N-6,20-O-Dibutyryladenosin 30,50-cyclisches 35-Monophosphat-Natriumsalz (dbCAMP), 10 μM Nicotinamid, 25 ng/ml FGF7, 20 ng/ml BMP4, 20 ng/ml BMP7.
    2. Advanced DMEM/F12 und HO1 medium vor Gebrauch bei 37 °C erwärmen. Aspirieren Sie in derselben 6-Well-ULA-Platte vorsichtig das vorherige HBO-Medium, indem Sie sich über die Platte beugen und die Spitze der Glaspipette, die mit einem Vakuum verbunden ist, an die Wand legen (oder manuell mit einer P1000-Pipette).
    3. Geben Sie 3 mL warmes Advanced DMEM/F12 pro Vertiefung hinzu und aspirieren Sie es. Fügen Sie 3 ml warmes HO1-Medium pro Vertiefung hinzu. Wechseln Sie das HO1-Medium alle 3 Tage (D-29, D-32, D-35, D-38) zusammen mit der Probenentnahme.
    4. Bei D 38 wird der Reagenziencocktail für die zweite Periode von HO (HO2) modifiziert, indem CHIR99021, BMP4, dbcAMP und FGF7 entfernt und durch FGF19 und DAPT ersetzt werden. Die endgültige Zusammensetzung des Mediums besteht aus Advanced DMEM/F12 als Basalmedium, 1x N2-Supplement, 1x B27, 500 nM A83-01, 30 μM Dexamethason, 50 ng/ml humanem epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), 20 ng/ml humanem Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), 10 μM Nicotinamid, 20 ng/mL BMP7, 25 ng/mL FGF19, 5 μM DAPT.
    5. Advanced DMEM/F12 und HO2 medium vor Gebrauch bei 37 °C erwärmen. Fahren Sie mit der gleichen 6-Well-ULA-Platte fort und saugen Sie vorsichtig das vorherige HO1-Medium an. Fügen Sie 3 mL Advanced DMEM/F12 pro Vertiefung hinzu und entfernen Sie es.
    6. Fügen Sie 3 ml warmes HO2-Medium pro Vertiefung hinzu. Wechseln Sie das HO2-Medium alle 4 Tage (D-42, D-46, D-50, ...) und entnehmen Sie Proben an den gleichen Tagen, an denen das Medium gewechselt wird.

3. Einzelzell-Dissoziation

HINWEIS: Dieser Schritt ist für die Einzelzell-RNA-Sequenzierungstechnik von entscheidender Bedeutung. Die Anzahl der Organoide kann je nach Größe variieren, und je älter der Tag der Dissoziation ist, desto größer ist die Anzahl der Zellen in den Organoiden. In früheren Zeiten nahm die Anzahl der dissoziierten Organoide zu, und die Dissoziationszeiten verkürzten sich bei gleichen Mengen. Die Dissoziation wurde mit 10 Organoiden an D-14 und D-17, 8 Organoiden an D-23 und D-26 und 6 Organoiden an D-30 und D-45 durchgeführt. Die Verfahren für einen Cluster von Organoiden sind detailliert beschrieben (Abbildung 1F).

  1. Vorbereitung der Reagenzien
    1. Advanced-DMEM mit einer Endkonzentration von 7,5 % Rinderalbuminfraktion V (BSA) herstellen und nach dem Homogenisieren filtrieren.
    2. Bereiten Sie 1 ml des Dissoziationsenzymmediums mit 1 ml Trypsin 0,5 % - EDTA (10x) als Basalmedium, 50 μM Y-27632, 40 U/μl RNase-Inhibitor und 1 U/μl DNase I vor.
    3. Bereiten Sie das Trypsin-Inaktivierungsmedium mit 2 ml Advanced DMEM/F12 + 7,5 % BSA als Basalmedium, 50 μM Y-27632, 40 U/μl RNase-Inhibitor und 1 U/μl DNase I vor.
    4. Erwärmen Sie sowohl das Medium als auch PBS auf 37 °C, bevor Sie beginnen.
  2. Dissoziation von HHOs
    1. Reinigen Sie den Arbeitsplatz und die Werkzeuge mit RNase Cleaner. Sammeln Sie die Anzahl der Organoide entsprechend dem Tag der Differenzierung in einem 15-ml-Polypropylen-Röhrchen mit weit geöffneter Spitze.
    2. Mit PBS 2x-3x waschen. Geben Sie 1 ml Dissoziationsenzymmedium in das 15-ml-Röhrchen mit den gesammelten Organoiden und halten Sie es 5 Minuten lang bei 37 °C in einer Wippe bei 30 U/min.
      ACHTUNG: Achten Sie darauf, den Schlauch nicht von der Wippe fallen zu lassen.
    3. Überprüfen Sie nach 5 Minuten zuerst die Kappe auf verbleibende Organoide und brechen Sie die Organoide dann mechanisch mit einem P1000 auf, indem Sie 10x pro Organoid auf und ab wirbeln (insgesamt 60 Mal). Wiederholen Sie die gleiche Unterbrechung mit einem P200. Überprüfen Sie den Röhrchendeckel, falls die Organoide daran hängen bleiben.
    4. Legen Sie das 15 mL Röhrchen wieder auf die Wippe und stellen Sie es für weitere 5 min in den Inkubator. Wiederholen Sie den Vorgang von Punkt 4, indem Sie zunächst einen P200 auf und ab schwenken und mit einer serologischen 1-ml-Pipette fortfahren, die mit einer P10-Spitze verbunden ist.
    5. Legen Sie das 15 mL Röhrchen wieder auf die Wippe in den Inkubator für die letzten 5 min. Falls keine Dissoziation besteht, lassen Sie es weitere 5 Minuten und wiederholen Sie die manuelle Unterbrechung.
    6. Fügen Sie 1 ml Trypsin-Inaktivierungsmedium hinzu und homogenisieren Sie es. Setzen Sie ein neues 15-ml-Polypropylen-Röhrchen mit einem 40-μm-Zellsieb darauf auf. Die 2 mL (Zellen mit dem Dissoziationsenzymmedium und dem Trypsin-Inaktivierungsmedium) werden durch ein 40 μm Zellsieb in das 15 mL Röhrchen filtriert.
    7. Fügen Sie weitere 1 ml Trypsin-Inaktivierungsmedium hinzu, um alle verbleibenden Zellen aus dem 40-μm-Zellsieb zu gewinnen.
    8. Nehmen Sie 5 μl einzelliges Medium, gemischt mit 5 μl einer Farbstofflösung, um die Anzahl der dissoziierten Zellen zu zählen, um mit ihrer Fixierung fortzufahren. Zählen Sie die Zellen nach der Zentrifugation und Resuspension mit dem ersten Reagenz des Fixierkits und führen Sie die Zellfiltration mit einem 40-μm-Zellsieb durch.

Ergebnisse

Jede Stufe dieses Protokolls der schrittweisen Differenzierung von hiPSC in HHOs wurde unter Verwendung quantitativer Messungen mittels qPCR und Immunfluoreszenz von stadienspezifischen bekannten Markern aus der Bibliographie definiert (Abbildung 2). Die Schritt-für-Schritt-Vorgehensweise beider Techniken und die erzielten Ergebnisse in Bezug auf die korrekte Differenzierung in HOs wurden in14 dargestellt. In der vorangegangenen Unte...

Diskussion

Das aktuelle Protokoll bietet verschiedene methodische Details zum Umgang mit hiPS-Zellen und den anschließenden 3D-Organoidkulturen. Dazu gehören die beiden wichtigsten kritischen Schritte: (i) das Ablösen der 2D-Kulturen und ihre Entwicklung zu 3D-Leberorganoiden nach 10 Tagen sowie (ii) die zarte Dissoziation einer 3D-Struktur in einzelne Zellen. Basierend auf den verfügbaren Informationen ist dies der erste Bericht über ein 3D-HHO-Modell zur Untersuchung der Wirkung von Schilddr...

Offenlegungen

Antonio C. Bianco ist Berater für Abbvie, Acella, Aligos und Synthonics. Die anderen Autoren haben keine relevanten Angaben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt vom National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK -DK58538, DK65066, DK77148; ACB).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
10 µL Universal Pipette Tips Filtered, Low rentention, Pre-sterileVWR613-6462All procedures
1000 µL Universal Pipette Tips Filtered, Low rentention, Pre-sterileVWR613-6470All procedures
15 mL Polypropilene Conical TubeFalcon (Corning)352097Dissociation Hepatic Organoids
200 µL Universal Pipette Tips Filtered, Low rentention, Pre-sterileVWR613-6465All procedures
3,3',5-Triiodo-L-thyronineSigmaT2877-100Hepatic Organoid differentiation
40 μm Cell Strainer Corning431750Dissociation Hepatic Organoids
50 mL tube Falcon (Corning)352070All procedures
6 well-plate Nunc Cell-Culture Treated MultidishesThermo fisher scientific140675hiPSC maintenance
A83-01 R&D Systems2939/10Hepatic Organoid differentiation
Advanced DMEM/F12Gibco12634010Hepatic Organoid differentiation
ART Wide Bore Filtered Pipette TipsART2069GPKAll procedures
B27 supplement Gibco17504044Hepatic Organoid differentiation
BMP7 R&D Systems354-BP-010/CFHepatic Organoid differentiation
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) Gibco15260037Dissociation Hepatic Organoids
BSA, Fraction V, Fatty Acid Free for Tissue CultureGoldBioA-421-100Dissociation Hepatic Organoids
CHIR99021R&D Systems4423/10Hepatic Organoid differentiation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Ultra-Low AttachmentCorning3474Hepatic Organoid differentiation
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Corning3471Hepatic Organoid differentiation
CS03iCTR-n3 human induced Pluripotent Stem Cell lineCedar-sinaihiPSC maintenance
DAPTR&D Systems2634/10Hepatic Organoid differentiation
dbCAMPMillipore SigmaD0627-100MGHepatic Organoid differentiation
DexamethasoneR&D Systems1126/100Hepatic Organoid differentiation
DMEM/F12Gibco11320033hiPSC maintenance
DNAse I, RNase-free, HCThermo Fisher scientificEN0523Dissociation Hepatic Organoids
Falcon 10 mL Serological Pipet, Polystyrene, 0.1 Increments, Individually Packed, SterileCorning357551All procedures
Falcon 5 mL Serological Pipet, Polystyrene, 0.1 Increments, Individually Packed, SterileCorning357543All procedures
Falcon 50 mL Serological pipet, Polystyrene, 1.0 Increments, Individually Packed, SterileCorning357550All procedures
Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR)Stemcell Technologies100-0485Hepatic Organoid differentiation
Glutamax supplementGibco35050061Hepatic Organoid differentiation
L-ThyroxineSigmaT1775-1GHepatic Organoid differentiation
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free, 5 mLCorning354277Extracellular matrix gel
mFreSRStemcell Technologies5855hiPSC cryopreservation medium
mTeSR 5x Supplement Stemcell Technologies100-0276hiPSC medium
mTeSR Plus Stemcell Technologies100-0276hiPSC medium
Multi Platform Shaker Fisherbrand (Thermo Fisher technologies)88861021Hepatic Organoid differentiation
N2 supplement Gibco17502048Hepatic Organoid differentiation
Nicotinamide R&D Systems4106/50Hepatic Organoid differentiation
PBS, pH 7.4Gibco10010023hiPSC maintenance
Recombinant human BMP4  R&D Systems314-BP-010/CFHepatic Organoid differentiation
Recombinant human EGFR&D Systems236-EG-200Hepatic Organoid differentiation
Recombinant human FGF basic/FGF2/bFGFR&D Systems233-FB-010/CFHepatic Organoid differentiation
Recombinant human FGF19R&D Systems959-FG-025/CFHepatic Organoid differentiation
Recombinant human HGFR&D Systems294-HG-005/CFHepatic Organoid differentiation
Recombinant Human Jagged-1 Fc Chimera R&D Systems1277-JG-050Hepatic Organoid differentiation
Recombinant human KGF/FGF7R&D Systems251-KG-010/CFHepatic Organoid differentiation
ReLeSRStemcell Technologies100-0483hiPSC detaching medium
RNAse Inhibitor Ambion, cloned, 40 U/μLInvitrogenAM2682Dissociation Hepatic Organoids
RNase ZapInvitrogenAM9780Dissociation Hepatic Organoids
Sorvall  Legend XT/XF Centrifuge SeriesThermo Fisher Scientific75004539All procedures
STEMdiff Definitive Endoderm KitStemcell Technologies5110Hepatic Organoid differentiation
Trypan Blue solution (0.4%) Gibco15250061Dye solution
TrypLE Express EnzymeGibco12604013Cell Dissociation enzyme
Trypsin 0.5% - EDTA (10X) Gibco15400054Dissociation Hepatic Organoids
Valproic acid, sodium saltR&D Systems2815/100Hepatic Organoid differentiation
Vari-Mix Platform Rocker Thermo Fisher scientificM79735QDissociation Hepatic Organoids
Y-27632 dihydrochlorideR&D Systems1254Hepatic Organoid differentiation

Referenzen

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