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Method Article
Gli organoidi epatici 3D derivati da iPSC umane costituiscono un potenziale strumento per comprendere l'azione dell'ormone tiroideo sullo sviluppo del fegato.
Ottenere cellule epatiche stabili in coltura rappresenta una sfida significativa per gli studi sul fegato. Tenendo presente questo, viene illustrato un metodo ottimizzato che utilizza cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) per generare colture 3D di organoidi epatici umani (HHO). L'utilizzo degli HHO offre un approccio prezioso per comprendere lo sviluppo del fegato, svelare le malattie del fegato, condurre studi ad alto rendimento per lo sviluppo di farmaci ed esplorare il potenziale del trapianto di fegato. Nella prima indagine, attraverso tecniche di immunofluorescenza e RT-PCR quantitativa, è stata monitorata la progressione, identificando la presenza di varie popolazioni cellulari, come gli epatoblasti e i due tipi di cellule derivate dagli epatoblasti: colangiociti o cellule epatocitario-simili, in diversi stadi di sviluppo. Questo rapporto presenta un semplice protocollo 3D a partire da hiPSC per acquisire HHO che rispecchiano le fasi dello sviluppo dell'embrione umano. Il protocollo, che dura 46-50 giorni, comprende diverse fasi: (i) gestione meticolosa della coltura di hiPSC per generare HHO, (ii) inizio della differenziazione cellulare in 2D e successiva transizione al 3D e (iii) una strategia di dissociazione ottimizzata per scomporre gli HHO in singole cellule per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula. A dimostrazione delle ampie applicazioni di questo approccio, il presente protocollo è stato precedentemente applicato per svelare il ruolo della segnalazione dell'ormone tiroideo nello sviluppo delle cellule epatiche.
Il fegato svolge diverse funzioni metaboliche, come la regolazione della disponibilità di substrati energetici facilmente utilizzabili come il glucosio e i corpi chetonici, nonché la disintossicazione dei composti xenobiotici. Negli ultimi anni, c'è stato un aumento significativo della prevalenza di malattie del fegato, in gran parte attribuite alla steatoepatite non alcolica (NASH), che, se non trattata, può progredire verso la cirrosi o il cancro1. Pertanto, è imperativo comprendere le funzioni metaboliche del fegato e le malattie ad esso correlate per facilitare lo sviluppo di trattamenti efficaci 2,3.
L'emergere di colture tridimensionali (3D) ha portato alla creazione del modello dell'organoide, che rappresenta un approccio rivoluzionario e innovativo per affrontare la funzionalità e la complessità dello sviluppo degli organi4. Gli organoidi sono definiti come aggregati 3D auto-organizzati di cellule differenziate che imitano le funzioni e la citoarchitettura del rispettivo organo5.
Negli ultimi decenni, una miriade di protocolli di organoidi epatici umani (HHO) ha guadagnato un interesse diffuso, che vanno dall'utilizzo di diverse cellule umane derivate da iPSC6 o solo cellule simili agli epatociti7 all'incorporazione di una varietà di microambienti intricati di fattori di crescita o inibitori e alla differenziazione delle cellule progenitrici in monostrato7 o 3D8. Questi approcci si prestano a una moltitudine di potenziali obiettivi, dallo screening di farmaci ad alto rendimento9 all'acquisizione di ulteriori informazioni sui meccanismi alla base delle malattie epatiche10.
Qui, viene eseguito un protocollo passo-passo di differenziazione HHO basato sui segnali chimici menzionati11 , con variazioni metodologiche adattate. Questo protocollo inizia con l'appropriata manipolazione e coltivazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC), descrivendo in dettaglio le tecniche per la manipolazione del gel della matrice extracellulare, il passaggio cellulare e la differenziazione in HHO. Il processo inizia stimolando la differenziazione delle hiPSC nell'endoderma definitivo (DE)12 e successivamente imitando gli effetti in vivo di FGF e BMP per promuovere lo sviluppo di cellule monostrato dell'intestino anteriore posteriore (PFG)13. L'architettura 3D si ottiene il giorno 10 quando le cellule PFG vengono differenziate in una fase epatica immatura che diventerà l'epatoblasto, la cellula precursore fetale dei colangiociti e degli epatociti2. Infine, le strutture 3D vengono dissociate in singole cellule per studi di sequenziamento dell'RNA. Come esempio dell'applicabilità di questo protocollo, è stato dimostrato come questo modello HHO si presti allo studio dell'azione dell'ormone tiroideo e della deiodinasi di tipo 2 (D2) sullo sviluppo di epatociti e colangiociti14.
1. Gestione dell'hiPSC
NOTA: le hiPSC (linea cellulare CS03iCTR-n3) sono state acquistate commercialmente. La gestione appropriata del rivestimento in gel della matrice extracellulare e del terreno hiPSC è fondamentale per attaccare le hiPSC alle piastre e alimentarle. Qui sono stati descritti i volumi necessari per una piastra a 6 pozzetti. Le hiPSC rimanenti dalla piastra a 6 pozzetti, che non si differenziano in organoidi, possono essere conservate in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
2. Differenziazione graduale da hiPSC in organoidi epatici
NOTA: La ricostituzione dei reagenti è stata eseguita e seguita secondo le linee guida del produttore.
3. Dissociazione unicellulare
NOTA: Questo passaggio è fondamentale per la tecnica di sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Il numero di organoidi può variare a seconda delle dimensioni, e più vecchio è il giorno della dissociazione, maggiore è la quantità di cellule negli organoidi. In passato, il numero di organoidi dissociati aumentava e i tempi di dissociazione si riducevano a parità di quantità. La dissociazione è stata eseguita con 10 organoidi a D-14 e D-17, 8 organoidi a D-23 e D-26 e 6 organoidi a D-30 e D-45. Le procedure per un cluster di organoidi sono dettagliate (Figura 1F).
Ogni fase di questo protocollo di differenziazione graduale da hiPSC in HHO è stata definita utilizzando misurazioni quantitative mediante qPCR e immunofluorescenza di marcatori noti stadio-specifici dalla bibliografia (Figura 2). In14 sono stati illustrati il passo dopo passo di entrambe le tecniche e i risultati ottenuti relativi alla corretta differenziazione in HO. Nell'indagine precedente, le hiPSC sono state definite attraverso...
L'attuale protocollo offre vari dettagli metodologici su come gestire le hiPSC e le successive colture di organoidi 3D. Ciò include le due principali fasi critiche: (i) il distacco delle colture 2D e quindi il loro sviluppo in organoidi epatici 3D dopo 10 giorni, nonché (ii) la delicata dissociazione di una struttura 3D in singole cellule. Sulla base delle informazioni disponibili, questo è il primo rapporto di un modello 3D HHO per studiare l'azione dell'ormone tiroideo, dimostrando ...
Antonio C. Bianco è consulente per Abbvie, Acella, Aligos, Synthonics. Gli altri autori non hanno divulgazioni rilevanti.
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto Nazionale del Diabete e delle Malattie Digestive e Renali (NIDDK -DK58538, DK65066, DK77148; ACB).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 µL Universal Pipette Tips Filtered, Low rentention, Pre-sterile | VWR | 613-6462 | All procedures |
1000 µL Universal Pipette Tips Filtered, Low rentention, Pre-sterile | VWR | 613-6470 | All procedures |
15 mL Polypropilene Conical Tube | Falcon (Corning) | 352097 | Dissociation Hepatic Organoids |
200 µL Universal Pipette Tips Filtered, Low rentention, Pre-sterile | VWR | 613-6465 | All procedures |
3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma | T2877-100 | Hepatic Organoid differentiation |
40 μm Cell Strainer | Corning | 431750 | Dissociation Hepatic Organoids |
50 mL tube | Falcon (Corning) | 352070 | All procedures |
6 well-plate Nunc Cell-Culture Treated Multidishes | Thermo fisher scientific | 140675 | hiPSC maintenance |
A83-01 | R&D Systems | 2939/10 | Hepatic Organoid differentiation |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | Hepatic Organoid differentiation |
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips | ART | 2069GPK | All procedures |
B27 supplement | Gibco | 17504044 | Hepatic Organoid differentiation |
BMP7 | R&D Systems | 354-BP-010/CF | Hepatic Organoid differentiation |
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Gibco | 15260037 | Dissociation Hepatic Organoids |
BSA, Fraction V, Fatty Acid Free for Tissue Culture | GoldBio | A-421-100 | Dissociation Hepatic Organoids |
CHIR99021 | R&D Systems | 4423/10 | Hepatic Organoid differentiation |
Corning 96-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment | Corning | 3474 | Hepatic Organoid differentiation |
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment | Corning | 3471 | Hepatic Organoid differentiation |
CS03iCTR-n3 human induced Pluripotent Stem Cell line | Cedar-sinai | hiPSC maintenance | |
DAPT | R&D Systems | 2634/10 | Hepatic Organoid differentiation |
dbCAMP | Millipore Sigma | D0627-100MG | Hepatic Organoid differentiation |
Dexamethasone | R&D Systems | 1126/100 | Hepatic Organoid differentiation |
DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | hiPSC maintenance |
DNAse I, RNase-free, HC | Thermo Fisher scientific | EN0523 | Dissociation Hepatic Organoids |
Falcon 10 mL Serological Pipet, Polystyrene, 0.1 Increments, Individually Packed, Sterile | Corning | 357551 | All procedures |
Falcon 5 mL Serological Pipet, Polystyrene, 0.1 Increments, Individually Packed, Sterile | Corning | 357543 | All procedures |
Falcon 50 mL Serological pipet, Polystyrene, 1.0 Increments, Individually Packed, Sterile | Corning | 357550 | All procedures |
Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) | Stemcell Technologies | 100-0485 | Hepatic Organoid differentiation |
Glutamax supplement | Gibco | 35050061 | Hepatic Organoid differentiation |
L-Thyroxine | Sigma | T1775-1G | Hepatic Organoid differentiation |
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free, 5 mL | Corning | 354277 | Extracellular matrix gel |
mFreSR | Stemcell Technologies | 5855 | hiPSC cryopreservation medium |
mTeSR 5x Supplement | Stemcell Technologies | 100-0276 | hiPSC medium |
mTeSR Plus | Stemcell Technologies | 100-0276 | hiPSC medium |
Multi Platform Shaker | Fisherbrand (Thermo Fisher technologies) | 88861021 | Hepatic Organoid differentiation |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | Hepatic Organoid differentiation |
Nicotinamide | R&D Systems | 4106/50 | Hepatic Organoid differentiation |
PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | hiPSC maintenance |
Recombinant human BMP4 | R&D Systems | 314-BP-010/CF | Hepatic Organoid differentiation |
Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG-200 | Hepatic Organoid differentiation |
Recombinant human FGF basic/FGF2/bFGF | R&D Systems | 233-FB-010/CF | Hepatic Organoid differentiation |
Recombinant human FGF19 | R&D Systems | 959-FG-025/CF | Hepatic Organoid differentiation |
Recombinant human HGF | R&D Systems | 294-HG-005/CF | Hepatic Organoid differentiation |
Recombinant Human Jagged-1 Fc Chimera | R&D Systems | 1277-JG-050 | Hepatic Organoid differentiation |
Recombinant human KGF/FGF7 | R&D Systems | 251-KG-010/CF | Hepatic Organoid differentiation |
ReLeSR | Stemcell Technologies | 100-0483 | hiPSC detaching medium |
RNAse Inhibitor Ambion, cloned, 40 U/μL | Invitrogen | AM2682 | Dissociation Hepatic Organoids |
RNase Zap | Invitrogen | AM9780 | Dissociation Hepatic Organoids |
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75004539 | All procedures |
STEMdiff Definitive Endoderm Kit | Stemcell Technologies | 5110 | Hepatic Organoid differentiation |
Trypan Blue solution (0.4%) | Gibco | 15250061 | Dye solution |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | Cell Dissociation enzyme |
Trypsin 0.5% - EDTA (10X) | Gibco | 15400054 | Dissociation Hepatic Organoids |
Valproic acid, sodium salt | R&D Systems | 2815/100 | Hepatic Organoid differentiation |
Vari-Mix Platform Rocker | Thermo Fisher scientific | M79735Q | Dissociation Hepatic Organoids |
Y-27632 dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Hepatic Organoid differentiation |
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