Isolierung und Analyse von Aortenbogen- und Wurzelläsionen in einem atherosklerotischen Mausmodell

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine umfassende Methodik für die quantitative Analyse von atherosklerotischen Plaques, um eine tiefergehende Erforschung der Mechanismen und des Fortschreitens der Atherosklerose zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Atherosklerose, eine der Hauptursachen für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, erfordert eine detaillierte Untersuchung der Entwicklung und des Fortschreitens der Läsionen. In dieser Studie wird ein umfassendes Protokoll für die Isolierung und histologische Analyse von Aortenbogen- und Wurzelläsionen in einem weit verbreiteten atherosklerotischen Mausmodell, Low-Density-Lipoproteinrezeptor-Knock-out-Mäusen (Ldlr^-/-), vorgestellt. Der Aortenbogen und die Aortenwurzel sind Schlüsselstellen für atherosklerotische Läsionen, und ihre Untersuchung ist entscheidend für die Beurteilung des Beginns, des Fortschreitens oder der Rückbildung von Atherosklerose, die Vorhersage der Risiken kardiovaskulärer Ereignisse und die Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Quantifizierung der atherosklerotischen Belastung im Aortenbogen und in der Aortenwurzel, einschließlich Gewebeisolierung, Fixierung, Ölrot-O-Färbung, Aortenwurzelschnitt, Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung, Verhoeff-Van Gieson (VVG)-Färbung und Bildanalyse. Bei der Öl-Rot-O-Färbung wird der Plaquebereich im Aortenbogen gemessen, um den Schweregrad der Atherosklerose zu beurteilen, während bei der HE-Färbung der Aortenwurzel Plaquekomponenten wie der Lipidkern und die Faserkappe sichtbar werden, was die Beurteilung der Plaquestabilität und des Rupturrisikos erleichtert. Die VVG-Färbung kann Kollagenfasern im Gewebe färben und liefert weitere Einblicke in die Plaquezusammensetzung und die damit verbundenen Informationen. Diese gründliche Analyse bietet wertvolle Einblicke in die Mechanismen der Läsionsentwicklung und kann die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien zur Vorbeugung und Behandlung von Atherosklerose leiten.

Einleitung

Herz-Kreislauf-Erkrankungen, insbesondere Atherosklerose, haben sich weltweit zu einer erheblichen gesundheitlichen Belastung und zu einer der Haupttodesursachen entwickelt ^1,2. Atherosklerose ist eine chronisch fortschreitende Entzündungserkrankung, die durch die allmähliche Anhäufung von Lipiden und die Bildung von Plaques in der Arterienwand gekennzeichnet ist, was letztendlich zu einer Verengung des arteriellen Lumens und möglicherweise zum Platzen von Plaques führt, was akute kardiovaskuläre Ereignisse wie Myokardinfarkt und Schlaganfall auslöst ^1,2,3. Angesichts ihrer tiefgreifenden Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit besteht ein dringender Bedarf, die Mechanismen zu verstehen, die der Atherosklerose zugrunde liegen, und wirksame therapeutische Strategien zu entwickeln.

In den letzten Jahren haben Tiermodelle eine entscheidende Rolle bei der Verbesserung unseres Verständnisses von Atherosklerose gespielt. Unter den verschiedenen Spezies haben sich Mäuse aufgrund ihrer schnellen Fortpflanzung, ihrer geringen Wartungskosten und der Verfügbarkeit fortschrittlicher genetischer Manipulationstechniken als bevorzugtes Modell herauskristallisiert ^4,5. Insbesondere ^{LDL-Rezeptor-Knockout-Mäuse} (Ldlr-/-) und ApoE^-/--Mäuse wurden ausgiebig zur Nachahmung menschlicher Atherosklerose eingesetzt, da sie ähnliche pathophysiologische Eigenschaften aufweisen ^4,5,6,7,8,9.

Atherosklerotische Läsionen bei Mäusen können an verschiedenen Stellen der Aorta auftreten, sind aber besonders anfällig für die Entwicklung in Bereichen, die eng mit der Hämodynamik verbunden sind, wie z. B. der Aortenwurzel, dem Aortenbogen und dem brachiozephalen Stamm, während die absteigende Aorta relativ weniger betroffen ist¹⁰. Um die Belastung durch atherosklerotische Läsionen in Mausmodellen genau zu bewerten, das Vorhandensein, die Größe und das Stadium von Plaques zu beurteilen und damit den Einfluss verschiedener Medikamente oder Faktoren auf das Auftreten, das Fortschreiten und die Rückbildung der Atherosklerose zu untersuchen, ist eine Kombination aus histologischen Färbetechniken und bildgebender Analyse unerlässlich¹¹. Die Öl-Rot-O-Färbung, eine etablierte Methode, färbt speziell neutrale Lipide und Lipoproteine¹² und ermöglicht so eine direkte Visualisierung der Plaquebildung im Aortenbogen¹³. Die Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung der Aortenwurzel grenzt nicht nur den Plaquebereich ab, sondern liefert auch detaillierte strukturelle Merkmale wie die fibröse Kappe und den nekrotischen Lipidkern. Diese Details sind entscheidend für die Beurteilung der Plaquestabilität und die Vorhersage des Risikos einer Plaqueruptur¹¹. Zusammen ermöglichen diese Techniken eine umfassende Beurteilung des Schweregrads und des Fortschreitens der atherosklerotischen Läsion.

Dieses Protokoll nahm C57BL6/J Ldlr^-/- Mäuse, die mit Chow-Diät und westlicher Diät gefüttert wurden, als Beispiele, um eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Beurteilung der atherosklerotischen Läsionslast bei Mäusen unter Verwendung der Öl-Rot-O-Färbung des Aortenbogens und der HE-Färbung von paraffineingebetteten Aortenwurzelschnitten zu liefern, gefolgt von einer Bildanalyse. Das Protokoll deckt alle Aspekte der Aortenisolierung und -fixierung, der Paraffineinbettung und -schnitte, der Färbeverfahren und der Bildanalyse ab und berücksichtigt betriebliche Details und Überlegungen zu den wichtigsten Schritten, um die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Durch die Befolgung dieses Protokolls können Forscher die Wirksamkeit therapeutischer Interventionen genau und effizient bewerten und Einblicke in die Mechanismen gewinnen, die der Atherosklerose zugrunde liegen.

Protokoll

Alle in dieser Studie verwendeten Tierprotokolle wurden von der Ethikprüfungskommission für Tierversuche der Shanghai University of Sport genehmigt.

1. Vorbereitung der Reagenzien und Präparierwerkzeuge

1. Sterilisieren Sie Präparierwerkzeuge, einschließlich feiner Scheren, gerader Pinzetten, gebogener Pinzetten, Federscheren und Stifte, im Voraus im Autoklaven.
2. 75 % Ethanol: Mischen Sie 75 mL wasserfreies Ethanol mit 25 mL ddH₂O.
3. 1x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS): 0,01 M PBS-Pulver in 2 L ddH₂O auflösen.
4. 4%ige Paraformaldehyd (PFA)-Lösung: 800 mL 1x PBS auf einem Magnetrührer in einem Abzug auf ca. 60 °C erhitzen. Langsam 40 g Paraformaldehydpulver unter ständigem Rühren hinzufügen. Titrieren Sie mit 1N NaOH, bis es vollständig aufgelöst ist. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen, das Volumen auf 1 l mit 1x PBS einstellen, filtrieren und den pH-Wert auf 7,2-7,4 einstellen.
   VORSICHT: PFA ist eine gefährliche Chemikalie, die eine sorgfältige Handhabung und die strikte Einhaltung von Sicherheitsprotokollen erfordert.
5. Strumpflösung von Oil Red O: 2,5 g Oil Red O-Pulver in 500 ml 100 % Isopropanol auflösen, in einer braunen Flasche verschließen und zur Langzeitlagerung im Kühlschrank bei 4 °C lagern.
   ACHTUNG: Isopropanol ist eine giftige und schädliche Chemikalie; Um Gesundheit und Sicherheit zu gewährleisten, ist es daher unerlässlich, die notwendige persönliche Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Handschuhe, zu tragen.
6. Arbeitslösung von Oil Red O: Mischen Sie die Strumpflösung und steriles ddH₂O im Verhältnis 3:2. Bereiten Sie die Lösung für jeden Gebrauch frisch vor und filtrieren Sie die Lösung mit einem sterilen 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter oder großem Filterpapier.
7. Victoria Blue'B Färbelösung: 0,5 g Victoria Blue'B in 100 ml 70%igem Ethanol auflösen.

2. Isolierung der Aorta und des Herzens

1. Halten Sie alle Mäuse mit 3-5 Tieren pro Käfig mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus in einer temperaturkontrollierten Umgebung und füttern Sie entweder eine Standard-Chow-Diät (Chow) oder eine westliche Diät (WTD) mit 0,2 % Cholesterin und 21,2 % Fett. Select C57BL6/J LDLr-/- männliche Mäuse, die 12 Wochen alt sind und zwischen 25 und 30 g wiegen. Opfern Sie Mäuse in einer CO₂ -Kammer.
2. Legen Sie die Mäuse vor der Dissektion in Rückenlage (Bauchseite nach oben) auf eine mit 1-2 Lagen saugfähigem Papier belegte Schaumstoffplatte und fixieren Sie die Gliedmaßen mit Stecknadeln.
3. Sprühen Sie 75%iges Ethanol über den Bauch der Mäuse, um das Fell zu reinigen und zu befeuchten.
4. Fassen Sie mit einer Pinzette die Bauchhaut der Mäuse und schneiden Sie die Haut mit einer feinen Schere von der Basis des Bauches bis zum oberen Ende des Halses ab.
5. Öffnen Sie die Bauchdecke, heben Sie dann mit einer Pinzette das Brustbein an und schneiden Sie sowohl das Zwerchfell als auch die Rippen durch, um die Brusthöhle freizulegen.
6. Entfernen Sie die Speiseröhre und die Luftröhre, um die Reinigung der Halsschlagadern zu erleichtern. Entfernen Sie Organe wie Leber, Lunge, Milz, Magen-Darm-Trakt und Bauchspeicheldrüse, während Sie die Nieren hinter dem Bauchfell und die Bauchschlagader neben der Wirbelsäule erhalten. Achten Sie beim Präparieren der Mesenterialarterien darauf, den Darm anzuheben und Schnitte von der Aorta weg zu machen, um eine Beschädigung der Bauchschlagader zu vermeiden.
7. Um ein klares Beobachtungsfeld zu erhalten, legen Sie die Mäuse unter ein Stereomikroskop und richten Sie die Kaltlichtquelle auf den Präparierbereich aus.
8. Injizieren Sie langsam eine mit PBS gefüllte 10-ml-Spritze mit einer 0,45 x 15 (II) RWLB-Nadel in die linksventrikuläre Spitze und beobachten Sie die Erweiterung der Aorta.
9. Wischen Sie das Blut und die Flüssigkeit im Sezierbereich vorsichtig mit Seidenpapier ab, um das Sichtfeld vollständig freizulegen.
10. Die thorakale Aorta ist leicht freizulegen. Verwenden Sie es als Durchbruch, indem Sie mit einer Zange das Zwerchfellsegment greifen, das am Ende der thorakalen Aorta befestigt ist, und einer Federschere, um das Bindegewebe zwischen der Aorta und der Brustmuskelwand zu durchtrennen.
11. Ziehen Sie vorsichtig mit einer Pinzette am Herzen und heben Sie die thorakale Aorta an, beobachten Sie die Äste des Aortenbogens und präparieren Sie das Adventitialfett und das Bindegewebe um den Aortenbogen und seine Äste entlang der thorakalen Aorta nach oben.
    HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, halten Sie die Aorta intakt, vermeiden Sie Risse oder Verletzungen und entfernen Sie das umgebende Fett und Bindegewebe gründlich. Dieser Schritt erfordert wiederholtes Üben, um eine kompetente Manipulation zu erreichen.
12. Präparieren Sie die Bauchschlagader und die Arteria iliaca communis entlang der thorakalen Aorta nach unten.
13. Schneiden Sie die Arteria iliaca communis 1-2 mm unterhalb ihrer Bifurkation ab, schneiden Sie die kleinen Äste der Aorta entlang der Wirbelsäule ab, um sie zu befreien, lösen Sie die Nierenarterien in der Nähe der Nieren, schneiden Sie die drei Astgefäße im Hals von ihren distalen Enden ab und schneiden Sie schließlich die aufsteigende Aorta in der Nähe des Herzens durch.
14. Legen Sie vor dem Präparieren des Aortenbogens eine kleine, dunkel gefärbte Dichtung mit hohem Kontrast zu den darunter liegenden Blutgefäßen an und fotografieren Sie den Bereich des Aortenbogens.
15. Schneiden Sie das Herzgewebe ab und schneiden Sie die untere Hälfte des Herzens entlang einer Ebene parallel zu den Vorhöfen. Fixieren Sie das getrimmte Herz (Abbildung 1A).

3. Fixierung und Vorbehandlung des Aortenbogens

1. Bereiten Sie im Voraus 1 ml 4%ige PFA-Lösung in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen vor.
2. Legen Sie die Aorta in den Schlauch und fixieren Sie sie für mindestens 24 h bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Die Aorta kann bis zu 1 Monat in 4%PFA konserviert werden, ohne die Qualität der Ölrot-O-Färbung zu beeinträchtigen. Um die normale Konfiguration beizubehalten, kann es eine geeignete Option sein, das Gewebe vor der Fixierung auf einen Gummi zu legen.
3. Übertragen Sie die Aorta in eine Petrischale, die PBS enthält, um ein Austrocknen zu verhindern. Verwenden Sie eine Zange und eine Federschere, um unter einem Stereomikroskop vorsichtig das verbleibende Adventitialfett zu entfernen, das während der Dissektion nicht vollständig entfernt wurde, um die Beeinträchtigung der Quantifizierung von Plaques in der Aorta zu reduzieren.
4. Schneiden Sie die Aorta vorsichtig entlang ihrer inneren Längsachse mit einer Federschere auf und schneiden Sie dann nacheinander die drei Äste des Aortenbogens entlang der lateralen Seite bis zur Höhe der Krümmung des Aortenbogens auf, so dass er sich vollständig ausbreiten kann (Abbildung 1C).
5. In diesem Stadium entweder für die Ölrotfärbung verwenden oder in 4% PFA lagern.

4. Ölrote O-Färbung des Aortenbogens

1. Legen Sie die aufgeschnittene Aorta in eine 12-Well-Platte. Geben Sie 1 ml steriles ddH₂O in jede Vertiefung und waschen Sie es 5 Minuten lang auf einem Shaker, wiederholen Sie dies 2x.
2. Legen Sie die 12-Well-Platte mit der entfernten Lösung in einen Abzug und trocknen Sie sie 20 Minuten lang an der Luft, bis keine sichtbaren Wasserflecken mehr vorhanden sind.
3. Geben Sie 1 ml frisch zubereitete Oil Red O-Arbeitslösung in jede Vertiefung und schütteln Sie sie 20 Minuten lang auf dem Shaker, dann entfernen Sie die Oil Red O-Arbeitslösung.
4. Geben Sie 2 ml steriles ddH₂O in jede Vertiefung und waschen Sie es 5 Minuten lang, wiederholen Sie diesen Schritt 3x. Danach halten Sie die Aorta in ddH₂O.
5. Legen Sie die Aorta auf einen Objektträger und breiten Sie ihn unter einem Stereomikroskop aus. Um den Kontrast zu erhöhen, platzieren Sie ein schwarzes Gummipolster unter der Folie.
6. Legen Sie die Folie auf ein weißes Papier, um den Kontrast weiter zu verbessern, und legen Sie ein Lineal daneben, und machen Sie ein Foto mit einer Kamera. Um die Aorta feucht zu halten, lagern Sie die behandelte Aorta in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, das 1 ml PBS enthält.

5. Bildanalyse des Aortenbogens

1. Öffnen Sie das aufgenommene Aortenbild auf einem Computer, der mit der Image J-Software ausgestattet ist.
2. Wählen Sie den Bereich mit einem rechteckigen Feld aus, z. B. 450 x 900 Pixel, der die gesamte Aorta enthält, und speichern Sie ihn als neues .tiff Bild.
3. Öffnen Sie das neu gespeicherte .tiff Bild in Bild J. Klicken Sie auf Bearbeiten > Invertieren, wählen Sie Bild aus und klicken Sie auf Typ > RGB-Stapel.
4. Wechseln Sie zu Bild, klicken Sie auf Stapel > In Bilder stapeln, und wählen Sie dann das grüne Bild mit dem besten Kontrast aus.
5. Gehen Sie zu Bild und klicken Sie auf > Helligkeit/Kontrast anpassen. Ändern Sie den Mindestwert auf etwa 200, minimieren Sie den Hintergrund, während Sie für jedes Bild ähnliche Hintergründe beibehalten, und klicken Sie dann auf Übernehmen.
6. Gehen Sie zu Analysieren und wählen Sie Messung festlegen aus. Wählen Sie "Bereich", "Bereichsbruch", "Auf Schwellenwert begrenzen" und "Beschriftung anzeigen" aus und klicken Sie dann auf "OK".
7. Gehen Sie zu Analysieren, wählen Sie Messung aus und kopieren Sie das Ergebnis in eine Tabelle.
8. Gehen Sie zu Analysieren, klicken Sie auf Werkzeug > ROI-Manager und wählen Sie dann den Bogenteil der Aorta mit einem rechteckigen Quader aus. Wechseln Sie zu ROI-Manager und wählen Sie Hinzufügen [t] und dann Messen aus. Kopieren Sie die Messergebnisse in eine Tabelle.
9. Analysieren Sie die in den Mäusegruppen gemessene Fläche basierend auf Normalitätstests. Ein p < 0,05 bedeutet, dass die Differenz statistisch signifikant ist.
   HINWEIS: Wählen Sie die geeignete statistische Methode entsprechend dem Versuchsdesign aus.

6. Paraffineinbettung des Herzens

1. Entfernen Sie die Spitze des Herzens und stellen Sie sicher, dass der Schnitt gerade und ausgerichtet in Richtung der Klappenwurzel ist (Abbildung 1B).
2. Legen Sie jede Herzprobe einzeln in eine Paraffin-Einbettbox und markieren Sie die Schachtel mit einem Bleistift.
3. Legen Sie die in Paraffin eingebettete Kassette mit Taschentuch in einen leeren Behälter und spülen Sie die Einbettbox 3 Minuten lang mit fließendem Wasser aus.
4. Führen Sie die Gewebedehydrierung mit Ethanol mit ansteigenden Konzentrationsgradienten wie folgt durch: 50 % Ethanol für 2 Stunden, 75 % Ethanol für 30 Minuten, 85 % Ethanol für 30 Minuten, 95 % Ethanol für 30 Minuten und 100 % Ethanol für 10 Minuten. Wiederholen Sie die Schritte, indem Sie bei jedem Schritt das Ethanol wechseln.
5. Gewebetransparenz mit Xylol wie folgt durchführen: 1:1 Gemisch aus Xylol und Ethanol für 20 min, Xylol für 15 min, wiederholen Sie dies 1x durch Wechseln des Xylols.
6. Das Paraffinwachs vorher bei 60 °C im Backofen schmelzen. Die Proben werden 30 Minuten lang mit einer Mischung aus Xylol und Paraffin behandelt, gefolgt von Paraffin-Weichwachs für 2 Stunden und dann Paraffin-Hartwachs für 1 Stunde.
   ACHTUNG: Ethanol ist ein brennbares und flüchtiges organisches Lösungsmittel. Xylol ist mäßig giftig und muss bei der Verwendung geschützt werden.
7. Einbettung von Paraffin
   1. Wählen Sie die passende Größe aus, schalten Sie sie ein und erwärmen Sie die Einbettmaschine vorher.
   2. Nach der Zugabe von geschmolzenem Paraffinwachs in die Form wird das Gewebe aus der Einbettkassette entnommen und mit einer zuvor erhitzten Pinzette mit der Schnittfläche nach unten am mittleren Boden der Form positioniert.
   3. Nachdem die Form auf einem Gefriertisch abgekühlt ist und das Paraffin darin erstarrt ist, setzen Sie den angegebenen Einbettkassettendeckel auf die Form und füllen Sie sie mit der erforderlichen Menge Paraffin.
   4. Sobald das Paraffinwachs abgekühlt und fest geworden ist, nehmen Sie den Block aus der Form und bewahren Sie ihn bei 4 °C im Kühlschrank auf (Abbildung 1D).

7. Paraffinabschnitte der Aortenwurzel

1. Entfernen Sie überschüssiges Paraffin, das den Deckel der Einbettkassette umgibt, und befestigen Sie den Paraffinblock dann sicher am Klemmsitz am Kopf des Paraffinschneiders. Stellen Sie den Block in eine leicht versetzte Position ein, von der aus die Scheibe geschnitten werden soll, und stellen Sie sicher, dass der Gewebeschnitt innerhalb des Paraffinblocks parallel zur Schneide der Klinge verläuft. Für den ersten Schnitt stellen Sie die Scheibendicke auf 10 μm ein, um die Gewebeposition sichtbar zu machen.
2. Wenn der erste Schnitt unter dem Mikroskop gefunden wird, stellen Sie die Schnittdicke auf 6 μm ein und führen Sie eine serielle Schnittaufnahme durch. Schneiden, schneiden und entnehmen Sie Schnitte im Slicer, bis drei intakte Aortenklappen unter dem Mikroskop sichtbar sind, woraufhin die Vorbereitung für das Schneiden beginnt. Lassen Sie für jede Maus eine Scheibe im Abstand von 6 μm und platzieren Sie unterschiedliche Scheibenpositionen auf verschiedenen Glasträgern, z. B. Abschnitt 1-11-21-31, um einen guten Überblick zu erhalten.
3. Lassen Sie die Schnitte auf einem Spreizer mit 37 °C warmem Wasser schwimmen, um das Gewebe flach zu verteilen, und nehmen Sie das Gewebe dann mit einem Objektträger auf. Nachdem Sie gewartet haben, bis das Wasser getrocknet ist, legen Sie die Scheiben über Nacht auf einen auf 42 °C eingestellten Toaster.
4. Die mittlere Plaquefläche dieser 8 Schnitte stellt den Wert der Aortenwurzelplaquefläche bei jeder Maus dar. Messen Sie nach dem Färben dieser Abschnitte die mittlere Plaquefläche und die Plaquefläche.

8. Hämatoxylin-Eosin-Färbung

1. Die Scheiben für 30 min bei 60 °C in den Trockner geben. In einem Abzugshaube mit einem Färbegestell die Abschnitte nacheinander 10 Minuten lang in Xylol legen (diesen Schritt einmal wiederholen, um das Xylol zu wechseln), 100 % Ethanol für 5 Minuten (diesen Schritt wiederholen, um das Ethanol zu wechseln), 95 % Ethanol für 5 Minuten, 85 % Ethanol für 5 Minuten und 75 % Ethanol für 5 Minuten.
2. 5 Min. mit fließendem Wasser abspülen. Tauchen Sie die Abschnitte 8 Minuten lang in Hämatoxylin-Flecken und spülen Sie sie unter fließendem Wasser ab.
3. Differenzieren Sie die Schnitte einige Sekunden lang mit 1%igem Salzsäurealkohol und spülen Sie sie mit fließendem Wasser ab und beobachten Sie, dass sich die Schnitte unter dem Mikroskop blau-violett verfärben.
4. Tauchen Sie die Schnitte 5 Minuten lang in eine Eosin-Färbelösung. Legen Sie die Abschnitte für 7 Dips in 95 % Ethanol und dann 30 s lang in 100 % Ethanol.
5. Mindestens 30 s lang in Xylol klar. Versiegeln Sie die Objektträger mit neutralem Gummi, fotografieren Sie unter einem Mikroskop und speichern Sie hochauflösende Bilder, vorzugsweise in .tiff Format.

9. Verhoeff-Van Gieson (VVG) Färbung

1. Führen Sie eine routinemäßige Entparaffinierung und Rehydrierung an den Paraffinabschnitten durch, indem Sie die gleichen Schritte wie in den Abschnitten 8.1 und 8.2 beschrieben befolgen.
2. Nach kurzem Spülen in 70%igem Ethanol die Abschnitte 15 Minuten lang in Victoria Blue'B Färbelösung tauchen.
3. Differenzieren Sie die Abschnitte für einige Sekunden in 95% Ethanol. Waschen Sie die Abschnitte 2x mit destilliertem Wasser.
4. Die Abschnitte mit Ponceau Färbelösung 5 min lang durch Tröpfchenauftrag einfärben. Differenzieren und dehydrieren Sie die Abschnitte mit 100 % Ethanol.
   HINWEIS: Vermeiden Sie nach der Ponceau-Färbung jeglichen Kontakt mit Wasser.
5. Mindestens 30 s lang in Xylol klar. Montieren Sie die Dias mit neutralem Gummi und fotografieren Sie sie unter dem Mikroskop.

10. Bildanalyse der Aortenwurzelplaque

1. Öffnen Sie das Image auf einem Computer, der mit der Image J-Software ausgestattet ist. Wählen Sie ein beliebiges Box-Tool aus, um die Plakette zu boxen.
2. Gehen Sie zu Bild, klicken Sie auf Überlagerung > Auswahl hinzufügen und dann auf Messen , um die Fläche der Plaque zu messen. Kopieren Sie die Messergebnisse in eine Tabelle.
3. Analysieren Sie die in den Mäusegruppen gemessene Fläche basierend auf Normalitätstests. Ein p < 0,05 bedeutet, dass die Differenz statistisch signifikant ist.

Ergebnisse

Die repräsentativen Ergebnisse zeigen die Anwendung der Isolations- und Analysetechnik für Aortenbogen- und Wurzelläsionen in einem atherosklerotischen Mausmodell. Diese Ergebnisse liefern einen klaren Beweis für die Fähigkeit der Technik, atherosklerotische Läsionen zu identifizieren und zu charakterisieren. Zum Beispiel zeigen histologische Bilder mit spezifischen Färbungen (z. B. Oil Red O) die Lipidakkumulation, während die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) die Gesamtmor...

Diskussion

Hier geben wir detaillierte Informationen zu den Methoden der Aortenprobenahme bei Ldlr-Knockout-Mäusen und der quantitativen Analyse von Plaques.

Die Präzision des Dissektionsverfahrens ist die größte technische Herausforderung für das in vivo Aortenstripping im Mausmodell der Atherosklerose. Basierend auf unseren Erfahrungen sind die wichtigsten Punkte wie folgt: (1) Verwenden Sie PBS, um das gesamte Blut in der Arterie auszuwaschen, um den Ver...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion microscope slides(25×75mm)	CITOTEST	Cat# 80312-3161
Embedding cassette	CITOTEST	Cat# 80106-1100-16
Eosin Staining Solution	Beyotime	Cat# C0109
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.	Cat# 10009218
Hematoxylin Staining Solution	Beyotime	Cat# C0107
Low-profile disposable blades	Leica	Cat# 14035838925
Microscope cover glass(24×50mm)	CITOTEST	Cat# 10212450C
Neutral Balsam Mounting Medium	Sango Biotech	Cat# E675007-0100
Oil red o powder	Sigma-Aldrich	Cat# 1320-06-5
paraffin with ceresin	Sinopharm Chemical Reagent Co.	Cat# 69019461
Paraformaldehyde	Servicebio	Cat# G1101
Phosphate Buffered Saline (PBS, Powder)	Servicebio	Cat# G0002-2L
Ponceau S Staining Solution	EveryLab	Cat# FM024
Victoria Blue’B	Aladdin	Cat# 2580-56-5
Xylene	Sigma-Aldrich	Cat# 104-81-4