Isolamento e análise de lesões do arco aórtico e da raiz em um modelo de camundongo aterosclerótico

Resumo

Este protocolo fornece uma metodologia abrangente para a análise quantitativa de placas ateroscleróticas para facilitar pesquisas mais aprofundadas sobre os mecanismos e a progressão da aterosclerose.

Resumo

A aterosclerose, uma das principais causas de doenças cardiovasculares, requer um exame detalhado do desenvolvimento e progressão da lesão. Este estudo apresenta um protocolo abrangente para o isolamento e análise histológica do arco aórtico e lesões radiculares em um modelo de camundongo aterosclerótico amplamente utilizado, camundongos knock-out para receptor de lipoproteína de baixa densidade (Ldlr^-/-). O arco aórtico e a raiz são locais-chave para lesões ateroscleróticas, e seu exame é fundamental para avaliar o início, progressão ou regressão da aterosclerose, prever riscos de eventos cardiovasculares e identificar potenciais alvos terapêuticos. Este protocolo descreve métodos para quantificar a carga aterosclerótica no arco e na raiz da aorta, incluindo isolamento de tecido, fixação, coloração com óleo vermelho O, secção da raiz da aorta, coloração de hematoxilina e eosina (HE), coloração de Verhoeff-Van Gieson (VVG) e análise de imagem. A coloração Oil Red O mede a área da placa no arco aórtico, avaliando a gravidade da aterosclerose, enquanto a coloração HE da raiz da aorta revela componentes da placa, como o núcleo lipídico e a capa fibrosa, facilitando a avaliação da estabilidade da placa e do risco de ruptura. A coloração VVG pode corar as fibras de colágeno nos tecidos, fornecendo mais informações sobre a composição da placa e informações relacionadas. Essa análise completa oferece informações valiosas sobre os mecanismos de desenvolvimento da lesão e pode orientar a criação de novas estratégias terapêuticas para prevenir e tratar a aterosclerose.

Introdução

As doenças cardiovasculares, particularmente a aterosclerose, surgiram como um fardo significativo para a saúde e uma das principais causas de morte em todo o mundo ^1,2. A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica progressiva caracterizada pelo acúmulo gradual de lipídios e pela formação de placas na parede arterial, levando ao estreitamento da luz arterial e, potencialmente, à ruptura de placas, desencadeando eventos cardiovasculares agudos, como infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral ^1,2,3. Dado o seu profundo impacto na saúde humana, há uma necessidade premente de compreender os mecanismos subjacentes à aterosclerose e desenvolver estratégias terapêuticas eficazes.

Nos últimos anos, os modelos animais desempenharam um papel crucial no avanço de nossa compreensão da aterosclerose. Entre várias espécies, os camundongos surgiram como um modelo preferido devido à sua rápida reprodução, baixo custo de manutenção e disponibilidade de técnicas avançadas de manipulação genética ^4,5. Em particular, camundongos knockout para receptor de LDL (Ldlr^-/-) e camundongos ApoE^-/- têm sido amplamente utilizados para mimetizar a aterosclerose humana, pois exibem características fisiopatológicas semelhantes 4,5,6,7,8,9.

As lesões ateroscleróticas em camundongos podem ocorrer em vários locais da aorta, mas são particularmente propensas a se desenvolver em áreas intimamente associadas à hemodinâmica, como raiz da aorta, arco aórtico e tronco braquiocefálico, enquanto a aorta descendente é relativamente menos afetada¹⁰. Para avaliar com precisão a carga de lesões ateroscleróticas em modelos de camundongos, avaliar a presença, o tamanho e o estágio das placas e, assim, investigar o impacto de diferentes drogas ou fatores no início, progressão e regressão da aterosclerose, uma combinação de técnicas de coloração histológica e análise de imagem é essencial¹¹. A coloração Oil Red O, um método bem estabelecido, cora especificamente lipídios neutros e lipoproteínas¹², proporcionando uma visualização direta da formação de placas no arco aórtico¹³. Enquanto isso, a coloração com hematoxilina-eosina (HE) da raiz da aorta não apenas delineia a área da placa, mas também fornece características estruturais detalhadas, como a capa fibrosa e o núcleo necrótico lipídico. Esses detalhes são cruciais para avaliar a estabilidade da placa e predizer o risco de ruptura da placa¹¹. Juntas, essas técnicas facilitam uma avaliação abrangente da gravidade e progressão da lesão aterosclerótica.

Este protocolo tomou como exemplos camundongos C57BL6 / J Ldlr^-/- alimentados com dieta Chow e dieta ocidental, com o objetivo de fornecer um guia passo a passo detalhado para avaliar a carga de lesão aterosclerótica em camundongos usando coloração Oil Red O do arco aórtico e coloração HE de seções radiculares aórticas embebidas em parafina, seguida de análise de imagem. O protocolo abrange todos os aspectos do isolamento e fixação da aorta, inclusão e seccionamento de parafina, procedimentos de coloração e análise de imagem, incorporando detalhes operacionais e considerações para as principais etapas, garantindo a reprodutibilidade e confiabilidade dos resultados. Ao seguir este protocolo, os pesquisadores podem avaliar com precisão e eficiência a eficácia das intervenções terapêuticas e obter informações sobre os mecanismos subjacentes à aterosclerose.

Protocolo

Todos os protocolos animais usados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Revisão de Ética para Experimentação Animal da Universidade de Esportes de Xangai.

1. Preparação de reagentes e ferramentas de dissecação

1. Esterilize as ferramentas de dissecação, incluindo tesouras finas, pinças retas, pinças curvas, tesouras de mola e alfinetes, em autoclave com antecedência.
2. Etanol 75%: Misture 75 mL de etanol anidro com 25 mL de ddH₂O.
3. 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS): Dissolva 0,01 M PBS em pó em 2 L de ddH₂O.
4. Solução de paraformaldeído a 4% (PFA): Aqueça 800 mL de 1x PBS a aproximadamente 60 ° C em um agitador magnético em uma capela de exaustão. Adicione lentamente 40 g de pó de paraformaldeído, mexendo continuamente. Titular com 1N NaOH até dissolver completamente. Resfrie à temperatura ambiente, ajuste o volume para 1 L com 1x PBS, filtre e ajuste o pH para 7,2-7,4.
   CUIDADO: O PFA é um produto químico perigoso que requer manuseio cuidadoso e adesão estrita aos protocolos de segurança.
5. Solução de estocagem de Oil Red O: Dissolva 2,5 g de pó de Oil Red O em 500 mL de isopropanol 100%, feche em um frasco marrom e guarde na geladeira a 4 ° C para armazenamento de longo prazo.
   CUIDADO: O isopropanol é um produto químico tóxico e nocivo; portanto, para garantir a saúde e a segurança, é essencial usar os equipamentos de proteção individual (EPI) necessários, incluindo luvas.
6. Solução de trabalho de óleo vermelho O: Misture a solução de meia e o ddH₂O estéril na proporção de 3:2. Preparar fresco para cada utilização e filtrar a solução com um filtro de seringa estéril de 0,22 μm ou papel de filtro grande.
7. Solução de coloração Victoria Blue'B: Dissolva 0,5 g de Victoria Blue'B em 100 mL de etanol a 70%.

2. Isolamento da aorta e do coração

1. Alojar todos os camundongos em 3-5 animais por gaiola, com um ciclo claro/escuro de 12 horas, em um ambiente com temperatura controlada e alimentar uma dieta padrão de ração (ração) ou uma dieta do tipo ocidental (WTD) contendo 0,2% de colesterol e 21,2% de gordura. Selecione camundongos machos C57BL6/J LDLr-/- com 12 semanas de idade e peso entre 25 e 30 g. Sacrifique ratos em uma câmara de CO₂ .
2. Antes da dissecação, coloque os camundongos em decúbito dorsal (lado ventral para cima) em uma placa de espuma coberta com 1-2 camadas de papel absorvente e fixe os membros com alfinetes.
3. Borrife etanol 75% sobre o abdômen dos camundongos para limpar e umedecer o pelo.
4. Use uma pinça para agarrar a pele ventral dos camundongos e use uma tesoura fina para cortar a pele da base do abdômen até o topo do pescoço.
5. Abra a parede abdominal e, em seguida, use uma pinça para levantar o esterno e corte o diafragma e as costelas para expor a cavidade torácica.
6. Remova o esôfago e a traqueia, o que facilitará a limpeza das artérias carótidas. Remova órgãos, incluindo fígado, pulmão, baço, trato gastrointestinal e pâncreas, preservando os rins localizados atrás do peritônio e a aorta abdominal ao lado da coluna. Ao dissecar as artérias mesentéricas, certifique-se de levantar os intestinos e fazer incisões longe da aorta para evitar danos à aorta abdominal.
7. Para fornecer um campo de observação claro, coloque os camundongos sob um estereomicroscópio e alinhe a fonte de luz fria com a área de dissecação.
8. Injete lentamente uma seringa de 10 mL cheia de PBS com uma agulha RWLB 0,45 x 15 (II) no ápice do ventrículo esquerdo e observe a dilatação da aorta.
9. Limpe suavemente o sangue e o fluido na área de dissecção com papel de seda para expor totalmente o campo de visão.
10. A aorta torácica é fácil de expor. Use-o como um avanço usando uma pinça para agarrar o segmento diafragmático preso à extremidade da aorta torácica e uma tesoura de mola para cortar o tecido conjuntivo entre a aorta e a parede do músculo torácico.
11. Puxe suavemente o coração com uma pinça e levante a aorta torácica, observando os ramos do arco aórtico, e disseque a gordura adventícia e o tecido conjuntivo ao redor do arco aórtico e seus ramos para cima ao longo da aorta torácica.
    NOTA: Tenha cuidado, mantenha a aorta intacta, evite rasgá-la ou machucá-la e remova completamente a gordura e o tecido conjuntivo circundantes. Esta etapa requer prática repetida para alcançar a manipulação proficiente.
12. Disseque a aorta abdominal e as artérias ilíacas comuns para baixo ao longo da aorta torácica.
13. Corte as artérias ilíacas comuns 1-2 mm abaixo de sua bifurcação, apare os pequenos ramos da aorta ao longo da coluna para liberá-la, descole as artérias renais perto dos rins, corte os três vasos ramificados no pescoço de suas extremidades distais e, finalmente, corte a aorta ascendente perto do coração.
14. Antes de dissecar o arco aórtico, coloque uma pequena junta de cor escura com alto contraste com os vasos sanguíneos abaixo dela e fotografe a área do arco aórtico.
15. Apare o tecido cardíaco e corte a metade inferior do coração ao longo de um plano paralelo aos átrios. Fixe o coração aparado (Figura 1A).

3. Fixação e pré-tratamento do arco aórtico

1. Prepare 1 mL de solução de PFA a 4% em um tubo de centrífuga de 1,5 mL com antecedência.
2. Coloque a aorta no tubo e fixe-a por pelo menos 24 h em temperatura ambiente.
   NOTA: A aorta pode ser preservada em 4% de PFA por até 1 mês sem afetar a qualidade da coloração Oil Red O. Para manter sua configuração normal, colocar o tecido em uma borracha antes da fixação pode ser uma opção adequada.
3. Transfira a aorta para uma placa de Petri contendo PBS para evitar que seque. Sob um estereomicroscópio, use uma pinça e uma tesoura de mola para remover cuidadosamente qualquer gordura adventícia remanescente que não tenha sido completamente removida durante a dissecção, a fim de reduzir a interferência na quantificação de placas dentro da aorta.
4. Use uma tesoura de mola para abrir cuidadosamente a aorta ao longo de seu eixo longitudinal interno e, em seguida, corte sequencialmente os três ramos do arco aórtico ao longo do lado lateral até o nível da curvatura do arco aórtico, permitindo que ele se espalhe completamente (Figura 1C).
5. Nesta fase, use para coloração de óleo vermelho O ou armazene em 4% de PFA.

4. Coloração de óleo vermelho O do arco aórtico

1. Coloque a aorta aberta em uma placa de 12 poços. Adicione 1 mL de ddH₂O estéril a cada poço e lave por 5 min em uma coqueteleira, repita 2x.
2. Coloque a placa de 12 poços com a solução removida em uma capela e seque ao ar por 20 minutos até que não haja marcas d'água visíveis.
3. Adicione 1 mL de solução de trabalho Oil Red O recém-preparada a cada poço e agite por 20 min no shaker, depois remova a solução de trabalho Oil Red O.
4. Adicione 2 mL de ddH₂O estéril a cada poço e lave por 5 min, repita esta etapa 3x. Depois disso, mantenha a aorta em ddH₂O.
5. Coloque a aorta em uma lâmina e espalhe-a sob um estereomicroscópio. Para aumentar o contraste, coloque uma almofada de borracha preta embaixo do slide.
6. Coloque o slide em um papel branco para aumentar ainda mais o contraste, com uma régua colocada ao lado dele, e tire uma foto usando uma câmera. Para manter a aorta úmida, armazene a aorta tratada em um tubo centrífugo de 1,5 mL contendo 1 mL de PBS.

5. Análise de imagem do arco aórtico

1. Abra a imagem da aorta capturada em um computador equipado com o software Image J.
2. Selecione a área com uma caixa retangular, como 450 pixels x 900 pixels, que contém toda a aorta, e salve-a como uma nova imagem .tiff.
3. Abra a imagem .tiff recém-salva na Imagem J. Clique em Editar > Inverter, selecione Imagem e clique em Digitar > Pilha RGB.
4. Vá para Imagem, clique em Pilhas > Empilhar para Imagens e escolha a Verde com o melhor contraste.
5. Vá para Imagem, clique em Ajustar > Brilho/Contraste. Altere o valor mínimo para cerca de 200, minimize o plano de fundo mantendo planos de fundo semelhantes para cada imagem e clique em Aplicar.
6. Vá para Analisar e selecione Definir medição. Selecione Área, Fração de área, Limite ao limite e Rótulo de exibição e clique em OK.
7. Vá para Analisar, selecione Medição e copie o resultado para uma planilha.
8. Vá para Analisar, clique em Ferramenta > Gerenciador de ROI e escolha a parte do arco da aorta com uma caixa retangular. Vá para o ROI Manager e selecione Adicionar [t] e, em seguida, Medir. Copie os resultados medidos em uma planilha.
9. Analise a área medida nos grupos de camundongos com base no teste de normalidade. Um p < 0,05 indica que a diferença é estatisticamente significativa.
   NOTA: Selecione o método estatístico apropriado de acordo com o projeto do experimento.

6. Incorporação de parafina do coração

1. Remova o ápice do coração e certifique-se de que a incisão esteja reta e alinhada com a direção da raiz da válvula (Figura 1B).
2. Coloque cada amostra de coração individualmente em uma caixa de inclusão de parafina e marque a caixa com um lápis.
3. Na hotte, colocar a embebida em parafina com lenço de papel num recipiente vazio e lavar a caixa de embutir com água corrente durante 3 min.
4. Realize a desidratação tecidual com etanol com gradientes de concentração crescentes da seguinte forma: etanol a 50% por 2 h, etanol a 75% por 30 min, etanol a 85% por 30 min, etanol a 95% por 30 min e etanol a 100% por 10 min. Repita as etapas trocando o etanol em cada etapa.
5. Realize a transparência do tecido com xileno da seguinte forma: mistura 1:1 de xileno e etanol por 20 min, xileno por 15 min, repita isso 1x trocando o xileno.
6. Derreta a cera de parafina no forno a 60 °C com antecedência. Trate as amostras com uma mistura de xileno e parafina por 30 min, seguida de cera macia de parafina por 2 h e depois cera dura de parafina por 1 h.
   CUIDADO: O etanol é um solvente orgânico inflamável e volátil. O xileno é moderadamente tóxico e requer proteção quando usado.
7. Incorporação de parafina
   1. Selecione o molde de tamanho apropriado, ligue-o e aqueça a máquina de incorporação com antecedência.
   2. Depois de adicionar cera de parafina derretida ao molde, extraia o tecido do de incorporação e posicione-o, com a superfície de corte voltada para baixo, na parte inferior central do molde usando uma pinça previamente aquecida.
   3. Depois que o molde esfriar em uma mesa de freezer e a parafina solidificar, coloque a tampa do de embutir indicada em cima do molde e encha-a com a quantidade necessária de parafina.
   4. Uma vez que a cera de parafina tenha esfriado e endurecido, remova o bloco do molde e mantenha-o na geladeira a 4 ° C (Figura 1D).

7. Seções de parafina da raiz da aorta

1. Limpe qualquer excesso de parafina ao redor da tampa do de incorporação e, em seguida, fixe firmemente o bloco de parafina no clamp assento localizado na cabeça do cortador de parafina. Ajuste o bloco para uma posição ligeiramente deslocada de onde a fatia será cortada, certificando-se de que a seção de tecido dentro do bloco de parafina esteja paralela à aresta de corte da lâmina. Para a primeira secção, defina a espessura do corte para 10 μm para revelar a localização do tecido.
2. Quando a primeira incisão for encontrada ao microscópio, ajuste a espessura do corte para 6 μm e execute o corte em série. Corte, fatie e escolha seções no fatiador até que três válvulas aórticas intactas sejam visíveis ao microscópio, momento em que começa a preparação para o seccionamento. Deixe uma fatia em intervalos de 6 μm para cada mouse e coloque diferentes posições de fatia em diferentes suportes de vidro, por exemplo, seção 1-11-21-31, para obter uma visão geral adequada.
3. Flutue as seções em um espalhador contendo água morna a 37 °C para espalhar o tecido e, em seguida, pegue o tecido com uma lâmina. Depois de esperar que a água seque, coloque as fatias numa torradeira regulada para 42 °C durante a noite.
4. A área média da placa dessas 8 seções representa o valor da área da placa da raiz da aorta em cada camundongo. Depois de colorir essas seções, meça a área média da placa e a área da placa.

8. Coloração de hematoxilina eosina

1. Coloque as fatias em uma secadora a 60 °C por 30 min. Em uma hotte, usando uma prateleira de coloração, coloque seções sequencialmente em xileno por 10 min (repita esta etapa uma vez, trocando o xileno), etanol 100% por 5 min (repita esta etapa, trocando o etanol), etanol 95% por 5 min, etanol 85% por 5 min e etanol 75% por 5 min.
2. Enxágüe com água corrente por 5 min. Mergulhe as seções em coloração de hematoxilina por 8 min e enxágue em água corrente.
3. Diferencie as seções com álcool de ácido clorídrico a 1% por alguns segundos e enxágue com água corrente e observe que as seções ficam azul-púrpura ao microscópio.
4. Mergulhe as seções em uma solução de coloração de eosina por 5 min. Coloque as seções em etanol a 95% por 7 mergulhos e depois em etanol a 100% por 30 s.
5. Limpar em xileno durante pelo menos 30 s. Sele as lâminas com goma neutra, fotografe ao microscópio e salve imagens de alta resolução, de preferência em formato .tiff.

9. Coloração de Verhoeff-Van Gieson (VVG)

1. Realize desparafinação e reidratação de rotina nas seções de parafina, seguindo as mesmas etapas descritas nas seções 8.1 e 8.2.
2. Após enxaguar brevemente em etanol a 70%, mergulhe as seções na solução de coloração Victoria Blue'B por 15 min.
3. Diferencie as seções por alguns segundos em etanol a 95%. Lave as seções 2x com água destilada.
4. Manchar as secções com solução de coloração Ponceau durante 5 min por aplicação de gotículas. Diferencie e desidrate as seções usando 100% de etanol.
   NOTA: Após a coloração de Ponceau, evite qualquer contato com a água.
5. Limpar em xileno durante pelo menos 30 s. Monte as lâminas com goma neutra e fotografe-as ao microscópio.

10. Análise de imagem da placa radicular da aorta

1. Abra a imagem em um computador equipado com o software Image J. Selecione qualquer ferramenta de caixa para encaixotar a placa.
2. Vá para Imagem, clique em Sobreposição > Adicionar Seleção e, em seguida, em Medir para medir a área da placa. Copie os resultados medidos em uma planilha.
3. Analise a área medida nos grupos de camundongos com base no teste de normalidade. Um p < 0,05 indica que a diferença é estatisticamente significativa.

Resultados

Os resultados representativos demonstram a aplicação da técnica de isolamento e análise para lesões do arco aórtico e da raiz em um modelo de camundongo aterosclerótico. Esses resultados fornecem evidências claras da capacidade da técnica de identificar e caracterizar lesões ateroscleróticas. Por exemplo, imagens histológicas com colorações específicas (por exemplo, Oil Red O) destacam o acúmulo de lipídios, enquanto a coloração de hematoxilina e eosina (H&E) revela a ...

Discussão

Aqui, fornecemos informações detalhadas sobre os métodos de amostragem aórtica em camundongos knockout para Ldlr e análise quantitativa de placas.

A precisão do procedimento de dissecção é o maior desafio técnico para a remoção da aorta in vivo no modelo de aterosclerose de camundongos. Com base em nossa experiência, os pontos-chave são os seguintes: (1) use PBS para lavar todo o sangue na artéria para aumentar a comparação entre os r...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion microscope slides(25×75mm)	CITOTEST	Cat# 80312-3161
Embedding cassette	CITOTEST	Cat# 80106-1100-16
Eosin Staining Solution	Beyotime	Cat# C0109
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.	Cat# 10009218
Hematoxylin Staining Solution	Beyotime	Cat# C0107
Low-profile disposable blades	Leica	Cat# 14035838925
Microscope cover glass(24×50mm)	CITOTEST	Cat# 10212450C
Neutral Balsam Mounting Medium	Sango Biotech	Cat# E675007-0100
Oil red o powder	Sigma-Aldrich	Cat# 1320-06-5
paraffin with ceresin	Sinopharm Chemical Reagent Co.	Cat# 69019461
Paraformaldehyde	Servicebio	Cat# G1101
Phosphate Buffered Saline (PBS, Powder)	Servicebio	Cat# G0002-2L
Ponceau S Staining Solution	EveryLab	Cat# FM024
Victoria Blue’B	Aladdin	Cat# 2580-56-5
Xylene	Sigma-Aldrich	Cat# 104-81-4