Wir danken Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce und Benjamin König für hilfreiche Diskussionen und die National Institutes of Health für die Unterstützung dieser Studien durch Zuschüsse T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB) und P20RR021905 (JB) .

Hinweis: Es ist wichtig, dass das beschriebene Protokoll streng Prä-PCR - Technik durchgeführt werden (siehe 28 für einen guten Überblick darüber , wie ein Prä-PCR - Labor einzurichten und wie Experimente durchzuführen gute Pre-PCR - Technik verwendet wird ). Es ist zwingend notwendig, dass alle Reagenzien und Ausrüstung von amplifizierte DNA-frei sind die qPCR Zielsequenz und entsprechende Kontrollen an Ort und Stelle, die solche Kontamination zu erkennen. Eine Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. 1. Bereiten Sie Medien und Seed-Zellen in 48-Well-Platten <ol><li> Bereiten 500 ml komplettem Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM), das 10% fötales Rinderserum, 1% Penicillin-Streptomycin und 1% HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure) Pufferlösung durch Zugabe von 50 ml Wärme inaktiviertes fötales Rinderserum und jeweils 5 ml eines 100x Penicillin-Streptomycin und 100x HEPES-Pufferlösung auf eine 500 ml Flasche DMEM. Dieses Reagenz kann bei 4 gelagert werden76; C für Monate. </li><li> Seed 2,5 x 10 4 Vero E6 - Zellen pro Well in einer 48-Well - Gewebekulturplatte in einem Endvolumen von 500 ul vollständigem DMEM. Inkubieren der Platte bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 10 bis 18 Stunden. <ol><li> Samen, die Platte am Ende des Arbeitstages. Testen Sie jede Virusprobe in entweder doppelte oder dreifache Brunnen. Anmerkung: Während einer 48-well-basierte Plattform für diesen Test beschrieben wird, sollte es möglich sein, den Test nach unten zur Verwendung in 96- oder 384-Well-Platten zu skalieren. </li></ol></li></ol> 2. Führen Sie die Virus-Zell-Anlage Hinweis: das Virus in diesem Protokoll verwendet, Candid JUNV Stamm # 1 (C # 1), wurde als lebende , abgeschwächte Impfstoff zur Prävention von Krankheits JUNV 29 erfolgreich eingesetzt. JUNV C # 1 wurde aus dem virulenten Stamm JUNV XJ durch serielle Passage abgeleitet sowohl in vivo und in vitro und unterscheidet sich von der Eltern XJ - Stamm von 12 Aminosäuren 30. because JUNV C 1 # a Biosicherheitsstufe (BSL) -2-rated Erreger ist, werden die Arbeiten für diesen Abschnitt beschrieben sind, müssen 31 geeignete BSL-2 Praktiken durchgeführt. Dies schließt die Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung (zB Augenschutz, Laborkittel, doppelte Handschuhe), eine Klasse II Biosicherheitswerkbank, und dafür zu sorgen , dass alle Mitarbeiter der institutionellen Ausbildung und Zulassungen erhalten haben , erforderlich , um sicher zu diesen Organismus behandeln. <ol><li> Verdünnen Sie die JUNV C # 1 Probe (n) auf die gewünschte PFU getestet werden oder konzentrieren sich bildende Einheiten in eiskaltem komplettem DMEM und lagern auf Eis, bis sie bereit zu jeder Vertiefung hinzuzufügen. Anmerkung: Als Alternative können die Bindungsstudien mit Virus Durchführung in komplettem DMEM verdünnt, ein Minimalmedium PBS mit einer reduzierten Serumkonzentration (2%) und einem geeigneten Puffer enthält, verwenden, um festzustellen, ob Serum Interferenz mit Virusanheftung verursachen. Ähnliche Befestigungs Protokolle für alternative Viren haben die Verwendung von RPMI 1640-Medium ohne bicarbo berichtetnate 0,2% Rinderserumalbumin, 10 mM (2- (Morpholino) ethansulfonsäure) enthält, und 10 mM HEPES, pH 6,8 , 32. Diese Bindung Medien kann überlegen sein pH - Änderungen zu verhindern , die auftreten könnten , wenn Medien aus dem CO 2 -Umgebung des Inkubators entfernt wird. <ol><li> Impfen Brunnen mit PFU von 200 bis 2000 reichen unproduktiven Befestigungs Ereignisse zu begrenzen. Wie in 2 gezeigt, ist dieser Assay zum Nachweis von Befestigungs Lage , so wenig wie 20 PFU (oder so viele wie 2 x 10 &amp; sup6 ; PFU) verwendet wird . </li><li> Erstellen Sie einen Master-Mix von Virus zur Impfung auf Zellen. Jede Virusprobe wird auf zwei Vertiefungen in einem Volumen von 50 &amp; mgr; l pro Vertiefung beimpft werden. Deshalb, wenn die Zugabe von 2000 PFU des Virus pro Vertiefung gewünscht wird, verdünnen 4.800 PFU in einem Gesamtvolumen von 120 ul eiskaltem DMEM vervollständigen. <ol><li> Um zu steuern, für die Spezifität des Assays, verwenden Sie ein passendes Paar von Eizellen des chinesischen Hamsters Zelllinien, die entweder gar nicht ausdrücken TfR1 (TRVb) oder express hTfR1 (TRVb-1) als JUNV Bindung an diese Zellen entweder reduziert werden sollte oder nicht, bzw. 13,33. Alternativ behandeln Zellen mit einer Protease wie Proteinase K 35 Arenavirus Befestigung 34 oder Eintrag zu verhindern. Soluble hTfR1 oder monocolonal Antikörper ch128.1, die für hTfR1 spezifisch ist, auch in Betracht gezogen werden könnten , da sie bekannt sind 13,36 Eintritt von JUNV in Zellen zu blockieren. Zusätzlich Vorbehandlung von Zellen mit freiem Mannose 14 oder Inkubation von Partikeln mit JUNV spezifische neutralisierende Antikörper 37 kann das Eindringen von Viren hemmen. </li><li> Bitte beachten Sie jedoch, dass diese letzteren Reagenzien und Ansätze, trotz JUNV Eintrag zu blockieren, nicht zu blockieren Befestigung bestätigt worden, obwohl dies eine wahrscheinliche Erklärung ist. Das hier beschriebene Protokoll könnte formal verwendet werden, ob diese verschiedenen Ansätze Auswirkungen Virion Befestigung bestimmen. </li></ol></li></ol></li><li> Entfernen Platten aus dem 37 ° C Inkubator undentweder in einem 4 ° C Kühlschrank oder auf Eis für 15 min, um die Fähigkeit der plattierten Zellen zu hemmen Endocytose durchzuführen. </li><li> Als nächstes wird die komplette DMEM aus jeder Vertiefung absaugen und jeder schnell gut waschen zweimal mit 100 ul eiskaltem PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) pH-Wert 7,4. Anschließend werden 50 &amp; mgr; l der vorverdünnten Virusproben (hergestellt in Schritt 2.1) in die entsprechenden Vertiefungen. </li><li> Wickeln Sie die Platte in der Plastikverpackung und sofort entweder wieder auf Eis oder in einem 4 ° C Kühlschrank für 1 bis 1,5 Stunden zu ermöglichen Virusanheftung auftreten. Halten Sie die Platte, Waschpuffer und Virusproben kalt bei 4 ° C in diesem Schritt. </li><li> Nach dem Abschluss der C Inkubation 4 °, die Virusinokulum aspirieren und jede Vertiefung 3 mal mit 200 ul eiskaltem PBS waschen. </li></ol> 3. Viral RNA-Extraktion <ol><li> Reinige viraler RNA aus JUNV C # 1 - Partikeln zu den Monoschichten angebracht , indem der kommerziellen Kits (zB RNeasy Mini Kit) according dem Protokoll des Herstellers. Genauer gesagt, um die &quot;Reinigung von Gesamt - RNA aus tierischen Zellen unter Verwendung von Spin - Technologie - Protokoll&quot; auf den Seiten 23 bis 28 in der RNeasy Mini Handbuch (4. Auflage, April 2006) mit den Änderungen , die nachstehend aufgeführt sind . <ol><li> Lysieren die Zellen, wie in Schritt ausgerichtet 1B durch Zugabe von 350 &amp; mgr; l Lyse-Puffer RLT direkt in jede Vertiefung. Mischen Sie den Puffer mehrmals Zell-Lyse zu gewährleisten. Beachten Sie, dass Zellen leicht in diesem Puffer lysieren und vollständige Lyse kann durch Anzeigen Brunnen unter einem inversen Mikroskop überprüft werden. </li><li> Übertragen Sie die resultierende Zelllysat zu dem Kit-Säule (Schritt 3a) und folgen Sie den Rest des Protokolls, wie beschrieben. An diesem Punkt hat sich das Virus durch den Lysepuffer neutralisiert worden, so dass die übrigen Schritte des Protokolls kann außerhalb der Klasse II Biosicherheit Schrank durchgeführt werden, sofern die kit Rohre nicht mit infektiösen Virus kontaminiert wurden. </li><li> Fügen Sie den optionalen Schritt 9 aus dem Protokoll des Herstellers, der ein addit istional Zentrifugation der Spin-Säule eine mögliche Verschleppung von Buffer RPE zu beseitigen. </li><li> Im letzten Schritt eluieren Protokoll des Herstellers (Schritt 10), um die gereinigte RNA von der Spin - Säule unter Verwendung von 30 &amp; mgr; l Nuklease-freies ddH 2 O. Shop-RNA bei -80 ° C an dieser Stelle oder direkt in der qRT-PCR-Assays verwendet werden. Um den Abbau von gereinigten viralen RNA-Proben durch Nukleasen zu verhindern, Nuklease-freies Reagenzien und Geräte verwenden und aufgetauten RNA-Proben auf Eis halten. Hinweis: Puffer RLT und RW1 Guanidinsalzlösung enthalten und nicht mit Bleichmittel gemischt werden sollte. Buffer RW1 Ethanol enthält. </li></ol></li></ol> 4. qRT-PCR-Messung des viralen Genoms <ol><li> JUNV C # 1 S-Segment RNA in cDNA für die nachfolgende qPCR, unterziehen die virale RNA (erzeugt in Schritt 3.1.4) bis RT in einem Gesamtvolumen von 50 ul zu konvertieren. <ol><li> So stellen Sie die RT-Reaktion auf, erstellen Sie zuerst einen Master-Mix für jede der folgenden Reagenzien pro Reaktion enthält: 6,75 ul Nuklease-freie ddH 2 O, 5 &amp; mgr; l einer 2 &amp; mgr; M Lager des RT - Primers S 2098- bis 2075- (5&#39;-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 &#39;), die mit dem NP - Region des S - Segment genomischer RNA komplementär ist, 5 ul 10X PCR - Puffer II, 11 ul einer 25 mM MgCl 2 -Lösung, 1,25 ul (62,5 Einheiten) RT - Enzym, 1 ul (0,4 Einheiten) RNase - Inhibitor und 10 ul einer 500 uM dNTPs Vorrat an. Hinweis: Im Verlauf der Arenavirus-Replikation, 4 viralen S Segment RNA-Spezies erzeugt werden: ein in voller Länge genomische RNA (vRNA), ein in voller Länge antigenomische RNA (vcRNA) (dh das reverse Komplement des vRNA) und zwei subgenomischen mRNAs kodieren der NP und GP-Gene, respectively. Der RT-Primer aufgelistet ist spezifisch nur für die S-Segment vRNA, aber nicht die vcRNA, NP mRNA oder mRNA GP. </li><li> Vorsichtig mischen die RT-Master-Mix und dann Aliquotierung 40 ul in einem 0,2 ml PCR-Röhrchen. Zugabe von 10 ul der viralen RNA zu jedem Röhrchen. Fügen i) eine keine Vorlage Steuerrohr (zB. 10 ul Nuklease-freiem ddH 2 O zu 40 ul des Master - Mix) und ii) eine ohne RT Enzymkontrolle (zB werden 10 &amp; mgr; l eines bekannten positiven viralen RNA - Probe auf 40 &amp; mgr; l , die Master hinzufügen Mix nicht erhalten haben jede RT-Enzym) für die Kontamination der RT-Reagenzien mit amplifizierten DNA enthält, die das virale Ziel-Sequenz zu screenen. Umfassen RNA aus nicht-infizierten Zellen mit dem vollständigen RT Mastermix extrahiert für den Assay Spezifitätskontrolle in Anwesenheit von zellulären RNA. </li><li> Darüber hinaus sind eine bekannte positive virale RNA-Probe auf den vollen Master-Mix, die Qualität der RT-Reagenzien zu überprüfen. Beachten Sie, dass das Volumen der RT-Reaktion kann auf 25 &amp; mgr; l reduziert werden, wenn notwendig. </li></ol></li><li> Gegenstand Die RT Rohre zu folgenden Zyklusbedingungen: 25 ° C für 10 min, 48 ° C für 30 min, und 95 ° C für 5 min. Beachten Sie, dass die Proben durch Zugabe einer 4 ° C Schritt an dieser Stelle oder über Nacht in den Thermocycler bei -20 ° C gelagert werden. </li><li> Perform qPCR in einem Gesamtvolumen von 25 ul. <ol><li> Machen Sie einen Master-Mix qPCR durch die Kombination der folgenden: 2,5 ul (einer 9 uM Lager) von jedem der Vorwärts-PCR-Primer S1937 + bis 1958+ (5&#39;-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 &#39;) und Rückwärts-PCR-Primer S 2001- bis 1982- (5 &#39;-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3&#39;), 2,5 ul (eines 2 uM Lager) der qPCR Sonde S 1960+ bis 1975+ (5&#39;-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 &#39;) und 12,5 ul des 2X universal-qPCR Master mischen. Beachten Sie, dass die hier berichtet Vorwärts - Primer, die für JUNV C # 1 spezifisch ist, um 1 38 nt von der ursprünglich gemeldeten Primersequenz unterscheidet, die den virulenten Stamm JUNV Romero zum Ziel hat . </li><li> Sie vorsichtig die Lösung mischen und dann 20 &amp; mgr; l zu jeder Vertiefung qPCR hinzufügen. In 5 ul jeder RT-Reaktion auf die entsprechenden qPCR Brunnen. Führen Sie qPCR in dreifacher Ausfertigung für jede getestete Probe. Man beachte, dass das PCR-Reaktionsvolumen auf weniger als 12,5 &amp; mgr; l reduziert werden kann, wenn nötig. Hinweis: Die Software, die mitdie qPCR Maschine absolute Kopienzahl von # 1 S Segment genomischer RNA JUNV C erzeugen, indem sie den Wert jeder unbekannten Probe zu einer Reihe von Standardverdünnungen von Plasmid Vergleichen des JUNV C # 1 NP-Gen kodiert, welches das Ziel der qPCR Primer ist und Sonde eingestellt. Der qPCR-Assay kann nur Quantifizierung für Werte liefern, die im Bereich der Standardkurve fallen. Aus diesem Grund enthalten die folgenden Mengen an Plasmid (in dreifachen Vertiefungen): 5, 50, 5 x 10 3 5 x 10 5 und 5 x 10 7 Kopien pro Vertiefung. </li></ol></li><li> Laden Sie die qPCR Platte in den Thermocycler und führen Sie die folgenden Reaktionsbedingungen: 95 ° C für 10 min und 40 Zyklen von 95 ° C für 15 Sekunden und 60 ° C für 1 min. <ol><li> Sammeln und Analysieren der Daten der Menge der viralen RNA in jeder Probe zu bestimmen, gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li></ol></li><li> Um eine Standardkurve unter Verwendung einer neu gereinigt Probe von Plasmid herzustellen, die qPCR teerhaltigeerhalten Sequenz bestimmen zuerst die Plasmid-Kopienzahl in dieser Lösung. <ol><li> Berechnen, das Molekulargewicht des Plasmids. Wenn die Sequenz des gesamten Plasmid bekannt ist, berechnen diese nach der folgenden Formel: MW = ([A * 312,2] + [G * 328,2] + [C * 288,2] + [T * 303.2] - 61.13). Denken Sie daran, die Gesamtzahl von einem bestimmten Nukleotid an jeden Strang des doppelsträngigen Plasmids gefunden aufzunehmen. </li><li> Wenn die Größe des Plasmids bekannt ist, aber seine genaue Sequenz nicht, berechnen die MW unter der Annahme, dass jede dsDNA Basenpaar mit einem MW von 600 hat. Hinweis: Die pCAGGS-JUNV C # 1 NP - Plasmid verwendet , hier hat ein MW von 4,2 x 10 6. </li><li> Sobald das MW des Plasmid bestimmt worden ist, zu berechnen, wie viele Kopien pro ul vorhanden sind, in der Lager-Plasmid-Lösung. </li><li> Zuerst berechnen die Gesamt ug Plasmid in der Lösung, dann ist dieses Plasmid zu Molen wandeln (zB wenn 69 ug Plasmid werden in 300 &amp; mgr; l Wasser enthielt, dann 6,9 x 10 -5 g des Plasmids * 1 Mol / 4,2 x 10 &amp; sup6 ; g des Plasmids = 1,6 x 10 -11 mol Plasmid), die Anzahl zu kopierüberführt werden können (beispielsweise 1,6 x 10 -11 mol Plasmid * 6,022 x 10 23 Moleküle / Mol = 9,8 x 10 12 Moleküle (oder Kopien)). </li><li> Teilen Sie die Gesamt Kopien von Plasmid in der Plasmid - Lösung durch das Volumen dieser Lösung zu erhalten Kopien pro ul (zB 9,8 x 10 12 Kopien / 300 &amp; mgr; l = 3,28 x 10 10 Kopien). </li><li> Man verdünnt diese Lösung so ein, dass 5 ul-Volumina auf die PCR-Platte geladen werden kann, den Bereich der Kopienzahlen zu liefern, benötigt die Standardkurve zu etablieren. </li></ol></li></ol>

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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+efficacy+of+a+live+attenuated+vaccine+against+Argentine+hemorrhagic+fever.+AHF+Study+Group.">Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group.</a> J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).</li><li>Goni, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+features+of+attenuated+Junin+virus+vaccine+strain+candidate.">Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate.</a> Virus Genes. 32, 37-41 (2006).</li><li>Chosewood, L. C., Wilson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , (2009).</li><li>White, J., Matlin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fusion+by+Semliki+Forest,+influenza,+and+vesicular+stomatitis+viruses.">Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses.</a> J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).</li><li>McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. 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Virol. 86, 4024-4028 (2012).</li><li>Sanchez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junin+virus+monoclonal+antibodies:+characterization+and+cross-reactivity+with+other+arenaviruses.">Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses.</a> J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).</li><li>Trombley, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+panel+of+real-time+TaqMan+polymerase+chain+reaction+assays+for+detection+and+absolute+quantification+of+filoviruses,+arenaviruses,+and+New+World+hantaviruses.">Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).</li><li>Helenius, A., Marsh, M., White, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Semliki+forest+virus+penetration+by+lysosomotropic+weak+bases.">Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases.</a> J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).</li><li>Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+membrane+fusion+and+nucleocapsid+delivery+into+the+cytoplasm+are+distinct+events+in+some+flaviviruses.">Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses.</a> PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Das Protokoll, das wir beschreiben, ist einfach und robust, sofern die folgenden kritischen Überlegungen beachtet werden. Zunächst strenge pre-PCR - Technik muss (siehe 28 für eine ausgezeichnete Bewertung) eingesetzt werden. Es ist zwingend notwendig, dass alle Reagenzien und Ausrüstung von amplifizierte DNA-frei sind die qPCR Zielsequenz und entsprechende Kontrollen an Ort und Stelle, die solche Kontamination zu erkennen. Zweitens, für das Virus-Zell-Befestigungsabschnitt des Protokolls, dem Virus, Zel...

Arenaviren sind eine Familie von umhüllten, einzelsträngige RNA - Viren , die in erster Linie bei Nagern in der Natur 1-3 gehalten werden. Während diese Viren normalerweise asymptomatisch, persistierende Infektion in Nagetierreservoirs 1,2 etablieren, können sie schwere Krankheiten verursachen beim Menschen 3. Wichtige pathogene Arten gehören die Neue Welt Junin - Virus (JUNV) 4 und die Alte Welt Lassa - Virus 5, die die Erreger der argentinischen hämorrhagisches Fieber in Südamerika und Lassa - Fieber in Afrika sind, beziehungsweise. Lymphatische choriomeningitis Virus (LCMV), das prototypische Virus der Familie 6, hat eine weltweite Verbreitung und ist verantwortlich für eine Vielzahl von Krankheitszuständen einschließlich aseptischer Meningitis bei immunkompetenten Personen 6, schwere Geburtsschäden in den sich entwickelnden Fötus 7 oder hohe Letalität bei immunsupprimierten Einzelpersonen folgende Festorgantransplantation 8,9. Der Mangel an USAFood and Drug Administration (FDA) -genehmigte Impfstoffe oder wirksame Virostatika diese Viren unterstreicht die kritische Notwendigkeit zur Bekämpfung neuer Strategien zur Entwicklung therapeutisch diese neuen / wieder auftretender Krankheitserreger zu zielen. Die Arenavirus - Genom besteht aus zwei einzelsträngigen RNA - Segmente, die große (L) (~ 7,2 kb) und klein (S) (~ 3,6 kb) Segmente 10. Das S-Segment codiert, das virale Nukleoprotein (NP) und Hüll-Glycoprotein (GP) während der L-Segment die virale Polymerase (L) und Matrixprotein (Z) kodiert. Die L- und S - genomischen RNA - Segmente (vRNAs) in Virionen verpackt 10-12. Der erste Schritt der Arenavirus - Infektion ist Anlagerung von viralen Partikeln Zellen durch eine Wechselwirkung zwischen dem viralen GP und der entsprechenden Wirtszellrezeptoren für JUNV, die Host, den menschlichen Transferrin - Rezeptor 1 (hTfR1) 13,14 enthält. Nach Befestigung werden JUNV Partikel in die Zelle über Endozytose 15 Clathrin-vermittelte genommen.Partikel dann Verkehr zu den späten Endosomen , wo der niedrige pH - Wert dieses Fach die Aktivierung von GP 16,17 auslöst. Einmal aktiviert, die GP-kodierte Fusionspeptid Einsätze in die endosomale Membran, die Einleitung Fusion zwischen den viralen und endosomalen Membranen. Erfolgreiche Fusion führt zur Freisetzung der Virionen verpackten vRNAs in das Zytoplasma, wo sie als Vorlagen für die genomischen Replikation und Transkription dienen. Wenn ausreichende Mengen an viralen Strukturproteine ​​und vRNAs erzeugt werden, neue Teilchen zusammenstellen und Knospe aus der infizierten Zelle 18 , um den Lebenszyklus zu vollenden . Um die Entdeckung neuer Strategien erleichtern, um therapeutisch die pathogenen Arenaviren Ziel hat sich unsere Gruppe auf die Identifizierung von Wirtsfaktoren konzentriert, die für die Virusvermehrung von entscheidender Bedeutung sind, aber entbehrlich für den Host. In diesem Zusammenhang die genaue Stadium der Definition (en) des Zyklus viralen Lebens durch solche Wirtsfaktoren gesteuert ist notwendig, die FührungEntwicklung von antivirale Strategien. Hier beschreiben wir eine quantitative (q) RT-PCR-basierten Assays , die verwendet werden können , Arenavirus-Zellanheftung zur Messung zur Identifizierung , ob ausgewählte Wirtsproteinen und / oder antivirale Moleküle beeinflussen diese Anfangsphase der Viruseintritt 19. Alternative Ansätze Arenavirus-Zell - Bindung zu messen , haben Virionen mit Biotin 20, fluoreszierende Farbstoffe 21, oder radioaktive Isotope 22 markiert gekennzeichnet. Nachteile dieser Verfahren kann das Erfordernis für große Mengen von Eingangs Virus (zB hohe Multiplizität der Infektion (MOI)) umfassen, die Verwendung von Radioaktivität, und / oder zusätzliche Handhabungsschritte Eingangs Virus (zB Konzentration und / oder die Kennzeichnung Virus) vorzubereiten . Insbesondere ermöglicht die Verwendung von hohen MOI es schwierig 15,23 produktiv im Vergleich zu unproduktiven Befestigung Ereignisse zu unterscheiden. Die qRT-PCR-basierte Test hier beschriebene Befestigungs Ereignisse mit so wenig wie 20 Plaque erkennen fürming Einheiten (PFU) des Virus, die für eine 48-Well-Platte in einer MOI von 0,0004 übersetzt. Daher überwindet die starke Empfindlichkeit des Tests die Forderung nach hoher MOI sowie alle Viren Kennzeichnung oder Konzentrationsschritte. Weiterhin kann die Assay sein i) Virion Endozytose sowie Freisetzung des Virusgenoms in das Cytoplasma nach Fusion und ii) angepasst für die Verwendung mit anderen Viren durch die Entwicklung von virusspezifischen qRT-PCR-Reagenzien (Beispiele zu messen angepasst, siehe 24-27).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="730">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DMEM</td>
			<td style="width:131px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">11965-118</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:131px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">15140-163</td>
			<td style="width:160px;">100x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">HEPES Buffer Solution</td>
			<td style="width:131px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">15630-130</td>
			<td style="width:160px;">100x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PBS pH 7.4</td>
			<td style="width:131px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">10010-023</td>
			<td style="width:160px;">1x</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Vero E6 cells</td>
			<td style="width:131px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:141px;">CRL-1586</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Costar 48-well plate</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:141px;">3548</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">RNeasy mini kit</td>
			<td style="width:131px;">Qiagen</td>
			<td style="width:141px;">74106</td>
			<td style="width:160px;">do not mix buffers RLT or&#160; RW1 with bleach</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">QIAshredder homogenizer</td>
			<td style="width:131px;">Qiagen</td>
			<td style="width:141px;">79654</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Taqman Universal PCR Master Mix</td>
			<td style="width:131px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">4326614</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/&#181;l)</td>
			<td style="width:131px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">4311235</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP)</td>
			<td style="width:131px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">N808-0260</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution</td>
			<td style="width:131px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">N808-0010</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">RNase Inhibitor (5000U/100 &#181;l)</td>
			<td style="width:131px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">N808-0119</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">RT primer 5&#8217;-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3&#8217;</td>
			<td style="width:131px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;">250 nmol DNA oligo</td>
			<td style="width:160px;">standard desalting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Forward qPCR primer&#160; 5&#8217;-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3&#8217;</td>
			<td style="width:131px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">4304971</td>
			<td style="width:160px;">standard desalting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Reverse qPCR primer 5&#8217;-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3&#8217;</td>
			<td style="width:131px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">4304971</td>
			<td style="width:160px;">standard desalting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">TaqMan Probe 5&#8217;-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3&#8217;</td>
			<td style="width:131px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">4316033</td>
			<td style="width:160px;">HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL)</td>
			<td style="width:131px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">4346906</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:131px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">4376598</td>
			<td style="width:160px;">or other qPCR instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive assay for measurement of arenavirus-cell attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

Um die Empfindlichkeit und Dynamikbereich des qPCR - Assay bekannt Mengen eines Plasmid , das das NP - Gen von JUNV C # 1 (Bereich 5-5 x 10 7 Kopien) zeigen , wurden auf qPCR unterzogen , wie in Abschnitt 4 des Protokolls beschrieben. Der Test ist empfindlich und zuverlässig so wenige wie 5 Kopien der Zielnukleinsäure (Figur 2) zu erkennen. Ferner ist der dynamische Bereich des Assays groß und kann wie in 2 gezeigt ist , mindestens 7 logs d...

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Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Hochempfindliches Verfahren zur Messung von Arenavirus-Zell-Anlage

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.5K Aufrufe.  University of Vermont. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Serie: Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with causing food- and water-borne disease outbreaks. The definitive host is the feline species where sexual replication occurs resulting in the development of the highly infectious and environmentally resistant oocyst. Infection occurs via ingestion of tissue cysts from contaminated meat or oocysts from soil or water. Infection is typically asymptomatic in healthy individuals, but results in a life-long latent infection that can reactivate causing toxoplasmic encephalitis and death if the individual becomes immunocompromised. Meat contaminated with T. gondii cysts have been the primary source of infection in Europe and the United States, but recent changes in animal management and husbandry practices and improved food handling and processing procedures have significantly reduced the prevalence of T. gondii cysts in meat1, 2. Nonetheless, seroprevalence in humans remains relatively high suggesting that exposure from oocyst contaminated soil or water is likely. Indeed, waterborne outbreaks of toxoplasmosis have been reported worldwide supporting the theory exposure to the environmental oocyst form poses a significant health risk3-5. To date, research on understanding the prevalence of T. gondii oocysts in the water and environment are limited due to the lack of tools to detect oocysts in the environment 5, 6. This is primarily due to the lack of efficient purification protocols for obtaining large numbers of highly purified T gondii oocysts from infected cats for research purposes. This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation7.

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation

Gewinnung von hochgradig gereinigter Toxoplasma gondii Oocysten durch eine diskontinuierliche Cäsiumchloridgradienten

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin which forms an insoluble clot that stops hemorrhage. Factor V (FV) in its activated form, FVa, is a critical cofactor for the protease FXa and accelerator of thrombin generation during fibrin clot formation as part of prothrombinase 1, 2. Manual FV assays have been described 3, 4, but they are time consuming and subjective. Automated FV assays have been reported 5-7, but the analyzer and reagents are expensive and generally provide only the clot time, not the rate and extent of fibrin formation. The microplate platform is preferred for measuring enzyme-catalyzed events because of convenience, time, cost, small volume, continuous monitoring, and high-throughput 8, 9. Microplate assays have been reported for clot lysis 10, platelet aggregation 11, and coagulation Factors 12, but not for FV activity in human plasma. The goal of the method was to develop a microplate assay that measures FV activity during fibrin formation in human plasma.
This novel microplate method outlines a simple, inexpensive, and rapid assay of FV activity in human plasma. The assay utilizes a kinetic microplate reader to monitor the absorbance change at 405nm during fibrin formation in human plasma (Figure 1) 13. The assay accurately measures the time, initial rate, and extent of fibrin clot formation. It requires only &mu;l quantities of plasma, is complete in 6 min, has high-throughput, is sensitive to 24-80pM FV, and measures the amount of unintentionally activated (1-stage activity) and thrombin-activated FV (2-stage activity) to obtain a complete assessment of its total functional activity (2-stage activity - 1-stage activity).
Disseminated intravascular coagulation (DIC) is an acquired coagulopathy that most often develops from pre-existing infections 14. DIC is associated with a poor prognosis and increases mortality above the pre-existing pathology 15. The assay was used to show that in 9 patients with DIC, the FV 1-stage, 2-stage, and total activities were decreased, on average, by 54%, 44%, and 42%, respectively, compared with normal pooled human reference plasma (NHP).
The FV microplate assay is easily adaptable to measure the activity of any coagulation factor. This assay will increase our understanding of FV biochemistry through a more accurate and complete measurement of its activity in research and clinical settings. This information will positively impact healthcare environments through earlier diagnosis and development of more effective treatments for coagulation disorders, such as DIC.

This study describes a novel microplate assay that measures FV coagulation activity during fibrin clot formation in human plasma which has not been reported previously. The method uses a kinetic microplate reader to continuously measure the change in absorbance at 405nm during fibrin clot formation in human plasma.

Messung der Faktor V-Aktivität in humanem Plasma unter Verwendung eines Mikroplatten Koagulationsanalyse

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

Plaque-Assay für Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

Quantitative Messung der Immunantwort und Sleep in<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

Hocheffiziente Transfektion von humanen THP-1 Makrophagen durch Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

Mess Bindung und Internalisierung von Influenza A-Virus in A549-Zellen mittels Durchflusszytometrie

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the majority of Vibrio-associated infections. Thus, accurate differentiation among Vibrio spp. and detection of V. parahaemolyticus is critically important to ensure the safety of our food supply. Although molecular techniques are increasingly common, culture-depending methods are still routinely done and they are considered standard methods in certain circumstances. Hence, a novel chromogenic agar medium was tested with the goal of providing a better method for isolation and differentiation of clinically relevant Vibrio spp. The protocol compared the sensitivity, specificity and detection limit for the detection of V. parahaemolyticus between the new chromogenic medium and a conventional medium. Various V. parahaemolyticus strains (n=22) representing diverse serotypes and source of origins were used. They were previously identified by Food and Drug Administration (FDA) and Centers for Disease Control and Prevention (CDC), and further verified in our laboratory by tlh-PCR. In at least four separate trials, these strains were inoculated on the chromogenic agar and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) agar, which is the recommended medium for culturing this species, followed by incubation at 35-37 &#176;C for 24-96 hr. Three V. parahaemolyticus strains (13.6%) did not grow optimally on TCBS, nonetheless exhibited green colonies if there was growth. Two strains (9.1%) did not yield the expected cyan colonies on the chromogenic agar. Non-V. parahaemolyticus strains (n=32) were also tested to determine the specificity of the chromogenic agar. Among these strains, 31 did not grow or exhibited other colony morphologies. The mean recovery of V. parahaemolyticus on the chromogenic agar was ~96.4% relative to tryptic soy agar supplemented with 2% NaCl. In conclusion, the new chromogenic agar is an effective medium to detect V. parahaemolyticus and to differentiate it from other vibrios.

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

Entwicklung eines sensitiven und spezifischen chromogenen Agar Medium zum Nachweis von<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Und andere<em&gt; Vibrio</em&gt; Arten

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Messung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Integration Aktivität von HIV-1 Preintegration Komplexe

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.