Beginnen Sie mit dem Mischen von 200 Mikrolitern reduziertem Serummedium mit zwei Mikrogramm einer beliebigen Plasmid-DNA separat in einem sterilen Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie dies für zwei weitere Plasmide in separaten Röhrchen. Mischen Sie dann in der neuen zweiten Tube 200 Mikroliter reduziertes Serummedium mit sechs Mikrolitern Transfektionsreagenz und mischen Sie den Inhalt durch Pipettieren.
Inkubieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie den Inhalt von Röhrchen zwei mit Röhrchen eins mischen. Wiederholen Sie in separaten Röhrchen das Mischen der beiden anderen Plasmide mit einem Transfektionsreagenz. Inkubieren Sie die Mischung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Als nächstes werden die Transfektionskomplexe tropfenweise in die mit HeLa-Zellkulturen gesäten Bildgebungsschalen gegeben, um eine gleichmäßige Verteilung über die gesamte Schale zu gewährleisten. Öffnen Sie eine Stunde vor der Bildgebung das Ventil des Kohlendioxidtanks und schalten Sie den Umgebungsregler für das Mikroskop ein. Stellen Sie mit den Aufwärts- und Abwärtspfeilen auf dem Touchpad die Temperatur auf 37 Grad Celsius und das Kohlendioxid auf 5 % einDrücken Sie Set, wenn Sie fertig sind.
Um die Lasereinstellungen anzupassen, schalten Sie den Weißlichtlaser ein, indem Sie auf die Registerkarte "Erfassen" klicken und "Laserübersicht öffnen" auswählen. Schalten Sie im Dialogfeld den Weißlichtlaser ein. Geben Sie die Laserleistung als 85 % einKlicken Sie auf die Schaltfläche Anregungssteuerung und wählen Sie die maximale Leistung aus dem Dropdown-Menü aus.
Beginnen Sie mit dem Tetraethylrhodaminethylesterperkolat oder TMRE, experimentieren Sie, indem Sie den Anregungslaser auf 514 Nanometer und das Emissionsspektrenfenster auf 524 bis 545 Nanometer für YFP einstellen. Stellen Sie als Nächstes für MitoTracker Deep Red den Anregungslaser auf 641 und das Emissionsspektrenfenster auf 650 bis 750 Nanometer ein. Stellen Sie für TMRE den Anregungslaser auf 555 Nanometer und das Emissionsspektrenfenster auf 557 bis 643 Nanometer ein.
Beginnen Sie mit der Einstellung für die Bildaufnahme, indem Sie die Registerkarte Aufnahme auswählen und das Format auf 1024 x 1024 anpassen. Stellen Sie die Geschwindigkeit im Dropdown-Menü auf 600 ein. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Liniendurchschnitt und wählen Sie aus dem Dropdown-Menü drei aus.
Schalten Sie das bidirektionale Scannen ein und stellen Sie den Phasen- und Zoomfaktor auf 22,61 bzw. 1,50 ein. Wenn Sie fertig sind, wählen Sie die Zellen basierend auf dem YFP-Fluoreszenzsignal aus, indem Sie auf die YFP-Einstellung klicken und Fast Live drücken. Passen Sie dann die Verstärkung und Intensität von YFP an und wählen Sie dann Zellen basierend auf dem YFP-Fluoreszenzsignal aus.
Um die DMSO-Kontrollplatte im TMRE-Experiment abzubilden, stellen Sie die Verstärkung und Intensität des TMRE-Signals auf Stufe zwei so ein, dass die Intensität des mitochondrialen Netzwerks knapp unter der Sättigung liegt. Halten Sie die Verstärkung und Intensität für TMRE konstant. Stellen Sie dann die Verstärkung und Intensität der MitoTracker-Einstellung so ein, dass das mitochondriale Netzwerk sichtbar, aber schwach ist.
Sobald die Einstellungen für Verstärkung und Intensität abgeschlossen sind, klicken Sie auf Start, um ein Bild aufzunehmen. Erfassen Sie Bilder von 20 Zellen pro Versuchsbedingung.
