Um die Fluoreszenzintensität der transfizierten HeLa-Zellen in der ImageJ-Software zu messen, klicken Sie auf Datei und wählen Sie Öffnen. Wählen Sie im Dialogfeld die Imaging-Dateien für das Experiment aus, und klicken Sie auf OK. Sobald das Fenster mit den Importoptionen für Bioformate angezeigt wird, wählen Sie geteilte Kanäle aus und klicken Sie auf OK.
In Tetramethylrhodamin-, Ethylester-, Perchlorat- oder TMRE-Experimenten ist YFP der erste Kanal, MitoTracker der zweite Kanal und TMRE der dritte Kanal. Passen Sie die Helligkeit an, indem Sie Bild auswählen, dann anpassen und dann die Helligkeit. Laden Sie als Nächstes den gespeicherten Interessenbereich oder ROI, indem Sie auf "Analysieren", dann auf "Werkzeuge" und dann auf "ROI-Manager" klicken.
Klicken Sie im ROI-Manager auf Mehr, öffnen Sie dann die Liste und wählen Sie den gespeicherten ROI aus. Messen Sie dann die Fluoreszenzintensität von fünf zufälligen Regionen in einer einzelnen Zelle, indem Sie den gespeicherten ROI aus dem ROI-Manager auswählen und den ROI an eine zufällige Stelle innerhalb einer Zelle verschieben. Um die Fluoreszenzintensität zu messen, drücken Sie M auf der Tastatur und wiederholen Sie dies mit vier zusätzlichen, nicht überlappenden Bereichen.
Wenn ein Dialogfeld mit den Flächen- und mittleren Grauwerten angezeigt wird, kopieren Sie die Werte und fügen Sie sie zur Analyse in eine Tabelle ein. Die Ergebnisse für die TMRE- und MitoSOX-Fluoreszenzintensitäten zeigten, dass die Behandlung mit dem bekannten Entkopplungsmittel CCCP die TMRE-Fluoreszenzintensität im Vergleich zu den Kontrollbedingungen verringerte. Darüber hinaus induzierte die Behandlung mit 20 Mikromolaren CCCP die Superoxidproduktion und erhöhte die MitoSOX-Fluoreszenzintensität.
Unter milden oder fünf mikromolaren CCCP-Stressbedingungen führte die Expression von Parkin-Wildtyp und Parkin T240R zu einer höheren TMRE-Intensität im Vergleich zum leeren YFP-Kontrollvektor. Die MitoSOX-Intensität war in Zellen, die Parkin-Wildtyp und Parkin T240R exprimierten, geringer als in Zellen, die den YFP-Kontrollvektor exprimierten, was darauf hindeutet, dass die Parking-Expression dazu beiträgt, die Gesundheit des mitochondrialen Netzwerks zu erhalten, indem höhere mitochondriale Membranpotentiale und niedrige Superoxidspiegel erhalten bleiben.
