Um Sojakeimblätter mit Agrobacterium rhizogenes zu infizieren, werden Primer entwickelt, um das TI-Plasmidgen virD2 unter Verwendung der Sequenz des Plasmids Agrobacterium rhizogenes PRI2659 Plasmids nachzuweisen. Nach der Transformation werden die Agrobacterium-Kolonien mittels PCR mit einem PCR-Kit auf die Retention von virD2 getestet. Nachdem Sie die Agrobacterium rhizogenes-Kolonien ausgewählt haben, die sowohl virD2 als auch das interessierende Gen enthalten, streifen Sie einige Kolonien auf die LB-Platten, die 100 Milligramm pro Liter Spectinomycin für das interessierende Plasmid enthalten.
Am nächsten Tag wird mit einer P200-Pipettenspitze ein 1,5 Zentimeter langes Agrobakterium von der LB-Platte abgekratzt und in einem Milliliter Phosphatpuffer resuspendiert. Die resuspendierte Zellsuspension und das sterilisierte Reinstwasser werden mit Acetosyringon verdünnt. Messen Sie die Absorption mit einem Küvettenröhrchen bei einer optischen Dichte von 600 Nanometern.
Tauchen Sie als Nächstes in einer Biosicherheitswerkbank ein sterilisiertes Skalpell in die Agrobacterium-Lösung und machen Sie einen einen Millimeter tiefen Schnitt entlang der Innenfläche des Keimblatts. Legen Sie sechs bis acht Keimblätter mit der Schnittseite nach unten auf eine Petrischale, die mit Keimpapier und Kultivierungsmedium mit Acetosyringon getränktes Filterpapier enthält. Inkubieren Sie die Platten drei Tage lang bei Raumtemperatur unter einer Fotoperiode von 16 Stunden.
Übertragen Sie die infizierten Keimblätter nach drei Tagen auf das behaarte Wurzelwachstum oder die HRG-Platten. Inkubieren Sie die Platten in den auf 22 Grad Celsius eingestellten Wachstumskammern mit einer Lichtintensität von 100 Mikromol in einer Fotoperiode von 16 Stunden, bis Primärwurzeln mit zwei bis drei Zentimeter langen Sekundärwurzeln beobachtet werden. Nach drei bis vier Wochen ernten Sie mit einem sterilen Skalpell und einer Pinzette Primärwurzeln, die aus der Hornhaut wachsen und Sekundärwurzeln enthalten.
Übertragen Sie die Wurzeln auf ausgewählte HRG-Platten, die geeignete Antibiotika enthalten, und lassen Sie sie weitere fünf Tage wachsen. Ernten Sie am fünften Tag transgene Haarwurzeln mit Sekundärwurzeln, die drei bis sechs Zentimeter lang sind. Bei der Beobachtung fluoreszierender Proteine ist darauf zu achten, dass die Sekundärwurzeln wenig Autofluoreszenz aufweisen.
Als nächstes schneiden Sie die Sekundärwurzeln in ein Zentimeter große Stücke und legen Sie etwa 100 Milligramm auf HRG-Agar auf einen Haufen. Tränken Sie dann den Haufen mit 80 Mikrolitern der entsprechenden Behandlungslösung und lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur inkubieren. Tupfen Sie die Wurzeln nach 24 Stunden für die RNA-Extraktion schnell auf einem sterilisierten Papiertuch trocken und ernten Sie sie direkt in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.
Verschließen Sie die Oberseite der Tube sofort mit Parafilm und bohren Sie zwei kleine Löcher mit einer spitzen Pinzette. Die Kolonie-PCR-Ergebnisse des transformierten Agrobakteriums werden gezeigt. Die positiven Kolonien in der PCR wiesen auf das interessierende Gen hin.
Ein Drittel bis die Hälfte der Kolonien waren jedoch negativ für das virD2-Genscreening. Fluoreszenzmikroskopie zeigt die subzelluläre Lokalisation von GFP-GmJAZ1-6. Die Genexpressionsanalyse bestätigte die Überexpression des Glyceollin-Transkriptionsfaktors GmHSF6-1 und das RNAi-Silencing von GmMYB2912 in Williams 82 Harrywurzeln.
