Enukleieren Sie die Augen einer euthanasierten Maus und markieren Sie die Schläfenseite zu Orientierungszwecken. Entfernen Sie die vordere Kammer. Entfernen Sie dann die Linse und den Glaskörper und legen Sie die Augenmuscheln für 30 Minuten in Paraformaldehyd.
Spülen Sie die Augenmuscheln 30 Minuten lang mit PBS. Ersetzen Sie die Lösung dreimal. Anschließend 30 Minuten lang mit 0,5 % Triton X-100 waschen.
Inkubieren Sie die Augenmuscheln zwei Stunden lang bei Raumtemperatur im Blockierungspuffer. Nach der Immunfärbung isolieren Sie die Netzhaut mit einem Mikroskop von den Augenmuscheln. Teilen Sie die Netzhaut in vier Blätter und montieren Sie sie flach mit der retinalen Ganglienzellschicht nach oben.
Stellen Sie sicher, dass die Markierung auf der Schläfenseite zur Orientierung angebracht bleibt. Decken Sie die Netzhaut mit Montagemedium ab. Legen Sie Deckgläser auf.
Und versiegeln Sie die Objektträger mit Nagellack. Schalten Sie das konfokale Mikroskop ein und suchen Sie im Lokalisierungsmodus mit dem Okular den gewünschten Bereich. Wechseln Sie in den Erfassungsmodus und richten Sie Kacheln ein, die die gesamte Netzhaut abdecken, zusammen mit Z-Stack-Schichten für alle Informationsebenen.
Bilden Sie mindestens 25 Kacheln über die gesamte Netzhaut ab, um ein Gesamtvolumen zu erreichen. Projizieren Sie die Z-Stack-Schichten, um zweidimensionale konfokale Mikroskopiebilder auf der Oberfläche zu erzeugen. Das zusammengesetzte Vis-OCT-Fasergramm wird mit dem entsprechenden konfokalen Bild einer flach montierten Netzhaut verglichen, die mit TuJ1 für RGC-Axone immungefärbt wurde.
Blutgefäße weisen unterscheidbare Verzweigungsstrukturen auf, die mit den ICAM-2-markierten Blutgefäßen auf dem konfokalen Bild abgeglichen werden können. Ein direkter Vergleich zwischen konfokaler Ex-vivo-Mikroskopie und In-vivo-Vis-OCT ergab identische RGC-Axonbündelnetzwerke und das umgebende retinale Gefäßsystem.
