Wenn Sie unter einer Laminar-Flow-Haube der Klasse zwei arbeiten, waschen Sie zunächst das perivaskuläre Fettgewebe oder PVATs, das von Mäusen gesammelt wurde, zweimal nacheinander. Zuerst mit PBS, das 10% Penicillin-Streptomycin enthält, und dann mit PBS, das mit 1% Penicillin-Streptomycin ergänzt wird. Die gespülten Taschentücher in eine sterile 60-Millimeter-Petrischale geben und 200 Mikroliter Aufschlusslösung hinzufügen.
Zerkleinern Sie das Gewebe mit einer sterilen Schere in Stücke mit einer Größe von einem Kubikmillimeter. Schneiden Sie mit Hilfe einer sterilen Schere eine Pipettenspitze aus Kunststoff ab, um ihr Ende zu verbreitern. Anschließend wird die Hackfleischmischung mit der Pipettenspitze in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt.
Geben Sie sechs Milliliter der Verdauungslösung in das Gewebe, um die Verdauung einzuleiten. Nachdem Sie das Röhrchen horizontal auf einem Gestell gebunden haben, inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius in einem Orbitalschüttler für 30 bis 45 Minuten. Nehmen Sie alle 5 bis 10 Minuten das Röhrchen aus dem Shaker im Inkubator und schütteln Sie es manuell kräftig auf und ab.
Die verdaute Gewebemischung wird durch ein 70-Mikron-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geleitet. Spülen Sie das Sieb mit einem gleichen Volumen Kulturmedium, um die Zellausbeute zu maximieren und die Verdauung zu unterdrücken. Das Filtrat wird in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt.
Zentrifugieren Sie das Röhrchen, um die stromale vaskuläre Fraktion oder SVF zu isolieren. Drehen Sie das Röhrchen um, um den Überstand zu entsorgen, und suspendieren Sie das Pellet erneut in fünf Milliliter PBS. Das Röhrchen wird erneut fünf Minuten lang bei 1.800 g zentrifugiert, bevor der Überstand verworfen wird.
Resuspendieren Sie das Pellet in einem geeigneten Nährmedium. Säen Sie die Zellen in eine kollagenbeschichtete 12-Well-Platte und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Atmosphäre mit 5% Kohlendioxid. Entfernen Sie am nächsten Tag Zelltrümmer und rote Blutkörperchen, indem Sie das Kulturmedium absaugen und die Zellen mit antibiotikahaltigem PBS waschen, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt ist.
Geben Sie schließlich einen Milliliter frisches Kulturmedium in jede Vertiefung und fahren Sie mit der Kultivierung der Zellen fort, bis sie das gewünschte Stadium der Konfluenz erreicht haben.
