Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82130012 und 81830010) und den Nurture-Projekten für Grundlagenforschung des Shanghai Chest Hospital unterstützt (Fördernummer: 2022YNJCQ03).

Die Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am Shanghai Chest Hospital genehmigt, das der Shanghai Jiao Tong University School of Medicine angegliedert ist (Zulassungsnummer: KS23010) und entsprachen den einschlägigen ethischen Vorschriften. Männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 4-8 Wochen sind für dieses Experiment zu bevorzugen.
1. Vorbereitung von chirurgischen Instrumenten, Puffern und Nährmedien
<ol><li>Chirurgische Instrumente (z. B. chirurgische Scheren und Standardpinzetten) bei 121 °C für 30 Minuten autoklavieren. Mikrochirurgische Instrumente mit 75%igem Alkohol desinfizieren.</li>
	<li>Bereiten Sie sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu, die mit 1 % Penicillin-Streptomycin und weiteren 10 ml PBS mit 10 % Penicillin-Streptomycin ergänzt ist. HINWEIS: In den folgenden Abschnitten bezieht sich PBS, sofern nicht ausdrücklich erwähnt, auf reguläres steriles PBS.</li>
	<li>Bereiten Sie Krebs Ringer HEPES BSA-Puffer vor: 1% Rinderserumalbumin (BSA), 20 mM HEPES gelöst in Krebs Ringer-Lösung.</li>
	<li>Bereiten Sie eine frische Verdauungslösung vor: Kollagenase Typ 1 (1 mg/ml) und Dispase II (4 mg/ml) gelöst in Krebs Ringer HEPES BSA-Puffer. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,2-μm-Filter.</li>
	<li>Bereiten Sie eine kollagenbeschichtete 12-Well-Platte vor.<ol><li>Verdünnen Sie die Kollagenlösung (1 mg/ml) mit sterilem deionisiertem Wasser auf die Konzentration von 40 μg/ml. Geben Sie 1 ml der verdünnten Kollagenlösung auf die Oberfläche jeder Vertiefung, um eine Konzentration von 6-10 μg/cm2 zu erreichen. Inkubieren Sie die Beschichtung 1 h bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Entfernen Sie die restliche Lösung und spülen Sie jede Vertiefung 2x mit 1 ml PBS aus. Verwenden Sie die Platte sofort oder trocknen Sie die Platte an der Luft in einer Laminar-Flow-Haube der Klasse II und lagern Sie die beschichtete Platte bei 2-8 °C. Versiegeln Sie die beschichteten Platten bei der Lagerung mit Parafolie.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie das Kulturmedium vor: Dulbecco-Modified Eagles Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt, 10 % fötales Kälberserum (FBS), 1 % v/v Penicillin-Streptomycin. Bei 4 °C bis zu 2 Wochen aufbewahren.</li>
	<li>Bereiten Sie lipogenes Induktionsmedium vor: DMEM mit hohem Glukosegehalt, 10 % FBS, 1 % v/v Penicillin-Streptomycin, 1 nM Trijodthyronin, 1 μM Rosiglitazon, 1 μM Insulin, 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) und 1 μM Dexamethason. Bei 4 °C bis zu 2 Wochen aufbewahren.</li>
	<li>Erhaltungsmedium vorbereiten: DMEM mit hohem Glukosegehalt, 10 % FBS, 1 % v/v Penicillin-Streptomycin, 1 nM Trijodthyronin, 1 μM Rosiglitazon und 1 μM Insulin. Bei 4 °C bis zu 2 Wochen aufbewahren.</li>
</ol>2. Dissektion und Isolierung von perivaskulärem Fettgewebe (PVAT)
<ol><li>Euthanasie der Maus durch Zervixluxation unter 2%iger Isofluran-Anästhesie oder mit Kohlendioxid-Überdosierung. Sprühen Sie mit 75% Alkohol zur Hautdesinfektion.</li>
	<li>Bringen Sie die Maus in Rückenlage (mit dem Gesicht nach oben).</li>
	<li>Heben Sie die Haut an, machen Sie einen kleinen Schnitt und trennen Sie die Haut und die Bauchmuskeln mit einer chirurgischen Schere stumpf entlang der ventralen Mittellinie vom Becken bis zum Hals. Lege das Herz und die Lunge frei, indem du das Zwerchfell und die Rippen auf beiden Seiten der Mittellinie durchschneidest.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig Leber, Milz, Darm und Niere. Vermeiden Sie es, die Darmwand zu durchtrennen.</li>
	<li>Entferne die Lunge und die Speiseröhre.</li>
	<li>Heben Sie das Herz vorsichtig mit einer Zange in der einen Hand an und trennen Sie die Aorta mit einer chirurgischen Schere in der anderen Hand von der Wirbelsäule. Dann werden das Herz und die Aorta in eine 60-mm-Petrischale mit PBS gelegt, die 1% v/v Penicillin-Streptomycin enthält.</li>
	<li>Entfernen Sie die mikrochirurgische Zange und die mikrochirurgische Schere vom Alkohol und spülen Sie 25 ml PBS ein, um den überschüssigen Alkohol zu entfernen. Entfernen Sie unter einem Stereomikroskop den Thymus und anderes Gewebe aus dem Herzen und der Aorta, entfernen Sie dann das Herz und belassen Sie die Aorta mit den PVATs.</li>
	<li>Die Aorta mit den PVATs in eine saubere 60 mm Petrischale mit PBS mit 1% v/v Penicillin-Streptomycin überführen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine mikrochirurgische Pinzette, um PVATs zu entfernen, wobei eine Pinzette die Aorta fixiert und die andere das Fettgewebe abzieht. Entfernen Sie das Gefäßgewebe so weit wie möglich und minimieren Sie gleichzeitig die Schädigung des perivaskulären Fettgewebes.</li>
	<li>Sammeln Sie das PVAT, das die thorakale Aorta umgibt, in das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das DMEM mit hohem Glukosegehalt enthält, ergänzt mit 1 % v/v Penicillin-Streptomycin, das auf Eis gelegt wird.</li>
</ol>3. Isolierung der stromalen Gefäßfraktion (SVF)
<ol><li>Spülen Sie das gesammelte Gewebe nacheinander mit PBS mit 10% v/v Penicillin-Streptomycin und PBS mit 1% v/v Penicillin-Streptomycin. HINWEIS: Ab diesem Schritt müssen alle Versuche unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube der Klasse II durchgeführt werden.</li>
	<li>Die Taschentücher in eine sterile 60-mm-Petrischale geben, 200 μl Aufschlusslösung hinzufügen und mit einer sterilen Schere in 1 mm3 Stücke zerkleinern.</li>
	<li>Die Mischung wird mit einer Kunststoffpipettenspitze in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben, das Ende durch einen sterilen Scherenschnitt verbreitert und 6 ml Aufschlusslösung hinzugefügt, um die Aufschlussreaktion zu starten. HINWEIS: Eine Verdauungsreaktion (3 ml Aufschlusslösung) ist ausreichend für PVAT-Depots von sechs Mäusen.</li>
	<li>Das Gewebe wird bei 37 °C in einem Inkubator mit einem Orbitalschüttler (150 U/min Frequenz für effektives Mischen) für 30-45 Minuten inkubiert. Binden Sie die Röhrchen flach auf ein Gestell, damit die Röhrchen horizontal wackeln. Alle 5-10 min 10 s mit der Hand kräftig auf und ab schütteln. HINWEIS: Die Verdauung kann abgebrochen werden, wenn eine homogene, gelbliche Verdauungsflüssigkeit ohne Gewebefragmente zu sehen ist.</li>
	<li>Das verdaute Gewebe wird durch ein 70-μm-Zellsieb in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen abgeseiht. Spülen Sie das Zellsieb mit einer gleichen Menge Kulturmedium, um die Zellausbeute zu maximieren und die Verdauung zu stoppen.</li>
	<li>Das Filtrat in ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführen und bei 1.800 × g 10 min zentrifugieren. Drehen Sie das Röhrchen um, um den Überstand zu verwerfen, und resuspendieren Sie die Pellets in 5 ml PBS. Bei 1.800 × g 5 min zentrifugieren.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand, indem Sie das Röhrchen umdrehen und die Pellets in einem geeigneten Nährmedium resuspendieren. HINWEIS: Die Zellpellets, die von jeweils sechs Mäusen gesammelt werden, werden in 1 ml Kulturmedium resuspendiert und in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte gesät.</li>
	<li>Die Zellen werden in eine kollagenbeschichtete 12-Well-Platte gesät und bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 über Nacht inkubiert.</li>
	<li>Am nächsten Tag wird das Kulturmedium abgesaugt, die Zellen mit vorgewärmtem (37 °C) PBS gewaschen, das 1 % v/v Penicillin-Streptomycin enthält, um Zelltrümmer und rote Blutkörperchen zu entfernen, und 1 ml frisches Kulturmedium in jede Vertiefung zurückgeben.</li>
</ol>4. Adipogene Induktion von SVF-abgeleiteten Präadipozyten aus periaortalem Fettgewebe
<ol><li>Wechseln Sie das Kulturmedium jeden zweiten Tag, bis die Zellen ~60-70% Konfluenz erreicht haben. HINWEIS: Normalerweise dauert es 3-4 Tage, bis die Zellen eine Konfluenz von 60-70% erreicht haben.</li>
	<li>Wenn die Zellen eine Konfluenz von 60-70 % erreicht haben, saugen Sie das Kulturmedium ab und ersetzen Sie es durch braunes adipogenes Induktionsmedium. Betrachten Sie den Tag der Induktion der adipogenen Differenzierung als Tag 0 der Differenzierung.</li>
	<li>Nach 72 h (Tag 3 der Differenzierung) wird das Medium mit Erhaltungsmedium aufgefrischt. Wechseln Sie das Erhaltungsmedium alle 2 Tage, bis die Zellen für Experimente verwendet werden.</li>
	<li>Analysieren Sie die adipogenen Zellen in geeigneter Weise, z. B. durch Ölrot-O-Färbung14 und Western Blot15.</li>
</ol>

Kultivierung von Präadipozyten, die aus perivaskulärem Fettgewebe der Maus isoliert wurden

<ol>
	<li>Akoumianakis, I., Antoniades, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interplay+between+adipose+tissue+and+the+cardiovascular+system:+is+fat+always+bad.">The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad.</a> Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).</li><li>Huang, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thoracic+perivascular+adipose+tissue+inhibits+VSMC+apoptosis+and+aortic+aneurysm+formation+in+mice+via+the+secretome+of+browning+adipocytes.">Thoracic perivascular adipose tissue inhibits VSMC apoptosis and aortic aneurysm formation in mice via the secretome of browning adipocytes.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 44 (2), 345-355 (2023).</li><li>Xia, N., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+perivascular+adipose+tissue+in+obesity-induced+vascular+dysfunction.">The role of perivascular adipose tissue in obesity-induced vascular dysfunction.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3425-3442 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Ferrero, R., Rainer, P., Deplancke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+consensus+view+of+mammalian+adipocyte+stem+and+progenitor+cell+heterogeneity.">Toward a consensus view of mammalian adipocyte stem and progenitor cell heterogeneity.</a> Trends in Cell Biology. 30 (12), 937-950 (2020).</li><li>Angueira, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+lineage+of+thermogenic+perivascular+adipose+tissue.">Defining the lineage of thermogenic perivascular adipose tissue.</a> Nature Metabolism. 3 (4), 469-484 (2021).</li><li>Boucher, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27a+regulates+human+perivascular+adipose+progenitor+cell+differentiation.">Rab27a regulates human perivascular adipose progenitor cell differentiation.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).</li><li>Saxton, S. N., Withers, S. B., Heagerty, A. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+adipocyte+differentiation+in+cell+culture.">Quantitative assessment of adipocyte differentiation in cell culture.</a> Adipocyte. 5 (4), 351-358 (2016).</li><li>Figueroa, A. M., Stolzenbach, F., Tapia, P., Cort&#233;s, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+imaging+of+brown+adipocytes+from+the+stromal+vascular+fraction+of+interscapular+adipose+tissue+from+newborn+mice.">Differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue-derived+complement+3+is+required+for+adventitial+fibroblast+functions+and+adventitial+remodeling+in+deoxycorticosterone+acetate-salt+hypertensive+rats.">Perivascular adipose tissue-derived complement 3 is required for adventitial fibroblast functions and adventitial remodeling in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (12), 2568-2574 (2010).</li><li>Adachi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beiging+of+perivascular+adipose+tissue+regulates+its+inflammation+and+vascular+remodeling.">Beiging of perivascular adipose tissue regulates its inflammation and vascular remodeling.</a> Nature Communications. 13 (1), 5117 (2022).</li><li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte.">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).</li><li>Stanek, A., Bro&#380;yna-Tkaczyk, K., My&#347;li&#324;ski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+obesity-induced+perivascular+adipose+tissue+(PVAT)+dysfunction+in+vascular+homeostasis.">The role of obesity-induced perivascular adipose tissue (PVAT) dysfunction in vascular homeostasis.</a> Nutrients. 13 (11), 3843 (2021).</li><li>Queiroz, M., Sena, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+age-related+vascular+disease.">Perivascular adipose tissue in age-related vascular disease.</a> Ageing Research Reviews. 59, 101040 (2020).</li><li>Fitzgibbons, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarity+of+mouse+perivascular+and+brown+adipose+tissues+and+their+resistance+to+diet-induced+inflammation.">Similarity of mouse perivascular and brown adipose tissues and their resistance to diet-induced inflammation.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), H1425-H1437 (2011).</li><li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+perivascular+adipose+tissue+on+peroxisome+proliferator-activated+receptor-&#947;+deletion+in+smooth+muscle+cells+impairs+intravascular+thermoregulation+and+enhances+atherosclerosis.">Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-&#947; deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis.</a> Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).</li><li>Piacentini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+profiling+unveils+autoimmune+response+signatures+in+the+perivascular+adipose+tissue+of+abdominal+aortic+aneurysm.">Genome-wide expression profiling unveils autoimmune response signatures in the perivascular adipose tissue of abdominal aortic aneurysm.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (2), 237-249 (2019).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+reveals+perivascular+adipose+tissue+plasticity+in+response+to+angiotensin+II.">RNA sequencing reveals perivascular adipose tissue plasticity in response to angiotensin II.</a> Pharmacological Research. 178, 106183 (2022).</li><li>Shi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascending+aortic+perivascular+adipose+tissue+inflammation+associates+with+aortic+valve+disease.">Ascending aortic perivascular adipose tissue inflammation associates with aortic valve disease.</a> Journal of Cardiology. 80 (3), 240-248 (2022).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+differentiate+into+brown+adipocytes+and+contribute+to+periaortic+arch+adipose+tissue+formation.">Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (8), 1629-1644 (2019).</li><li>Gil-Ortega, M., Somoza, B., Huang, Y., Gollasch, M., Fern&#225;ndez-Alfonso, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+differences+in+perivascular+adipose+tissue+impacting+vascular+homeostasis.">Regional differences in perivascular adipose tissue impacting vascular homeostasis.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 26 (7), 367-375 (2015).</li><li>Bar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+magnetic+resonance+imaging-based+detection+of+heterogeneous+endothelial+response+in+thoracic+and+abdominal+aorta+to+short-term+high-fat+diet+ascribed+to+differences+in+perivascular+adipose+tissue+in+mice.">In vivo magnetic resonance imaging-based detection of heterogeneous endothelial response in thoracic and abdominal aorta to short-term high-fat diet ascribed to differences in perivascular adipose tissue in mice.</a> Journal of the American Heart Association. 9 (21), e016929 (2020).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, weder finanzieller noch anderer Art, zu deklarieren.

Wir schlagen einen praktischen und praktikablen Ansatz für die Isolierung und adipogene Induktion von SVF-abgeleiteten Präadipozyten aus periaortalem Fettgewebe der Maus vor. Die Vorteile dieses Protokolls sind, dass es einfach und kostengünstig ist. Eine ausreichende Anzahl von Mäusen ist entscheidend für eine erfolgreiche Isolierung, da unzureichendes Gewebe zu einer niedrigen SVF-Dichte und einem schlechten Wachstumszustand führen kann, was letztendlich die lipogene Effizienz beeinträchtigt. Darüber hinaus ist...

Es wird angenommen, dass perivaskuläres Fettgewebe (PVAT), eine perivaskuläre Struktur, die aus einer Mischung aus reifen Adipozyten und einer stromalen vaskulären Fraktion (SVF) besteht, über sein Sekretom parakrin mit der angrenzenden Gefäßwand interagiert1. Als kritischer Regulator der vaskulären Homöostase ist die PVAT-Dysfunktion an der Pathogenese kardiovaskulärer Erkrankungen beteiligt 2,3,4. Die SVF des Adipozytengewebes besteht aus mehreren erwarteten Zellpopulationen, darunter Endothelzellen, Immunzellen, Mesothelzellen, neuronale Zellen sowie Fettstamm- und Vorläuferzellen (ASPCs)5,6. Es ist bekannt, dass ASPCs, die sich in der SVF des Fettgewebes befinden, reife Adipozyten hervorbringen können5. Es wird angenommen, dass SVF eine kritische Quelle für reife Adipozyten in PVAT ist. Mehrere Studien haben gezeigt, dass PVAT-SVF unter bestimmten Induktionsbedingungen in reife Adipozyten differenzieren kann 6,7,8.
Derzeit gibt es zwei Isolationssysteme zur Isolierung von SVF aus Fettgewebe, eines ist die enzymatische Verdauung und das andere ist nicht-enzymatisch9. Enzymatische Methoden führen typischerweise zu einer höheren Ausbeute an kernhaltigen Vorläuferzellen10. Bis heute wurden die Vorteile von SVF bei der Förderung der Gefäßregeneration und Neovaskularisation bei Wundheilungs-, Urogenital- und Herz-Kreislauf-Erkrankungen umfassend nachgewiesen11, insbesondere in der Dermatologie und plastischen Chirurgie12,13. Die klinischen Anwendungsaussichten von PVAT-abgeleitetem SVF sind jedoch noch nicht gut erforscht, was auf das Fehlen einer standardisierten Methode zur Isolierung von SVF aus PVAT zurückzuführen ist. Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen standardisierten Ansatz für die Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von SVF-abgeleiteten Präadipozyten aus Maus-PVAT, das die thorakale Aorta umgibt, zu etablieren und so eine weitere Untersuchung der PVAT-Funktion zu ermöglichen. Dieses Protokoll optimiert die Gewebeverarbeitung und Zelldifferenzierungstechniken für die Kultivierung von periaortalen Adipozyten, die aus jungen Mäusen gewonnen wurden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m syringe filters</td>
			<td>PALL</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate&#160;</td>
			<td>Labselect</td>
			<td>11210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>310109003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-triiodo-L-thyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-2877</td>
			<td>1 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Labselect</td>
			<td>CT-002-50A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-adiponectin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22554</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-COX IV</td>
			<td>CST</td>
			<td>4850</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FABP4</td>
			<td>CST</td>
			<td>2120</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PGC1&#945;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab191838</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PPAR&#947;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-14889</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-UCP1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10983</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;-Actinin</td>
			<td>CST</td>
			<td>6487</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023-200g</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes</td>
			<td>Shanghai Model Organisms Center, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 70 &#181;m, nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1756</td>
			<td>1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4693-1G</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-25G</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with orbital shaker</td>
			<td>Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.</td>
			<td>LYZ-103B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (cattle)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11070-73-8</td>
			<td>1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs-Ringer&#39;s Solution</td>
			<td>Pricella&#160;</td>
			<td>PB180347</td>
			<td>protect from light&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissor</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O&#160;</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>A600395-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>B548117-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td>1:5,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td>1:5,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue

Perivaskuläres Fettgewebe (PVAT) ist ein Fettgewebsdepot, das Blutgefäße umgibt und die Phänotypen weißer, beigefarbener und brauner Adipozyten aufweist. Neuere Entdeckungen haben die zentrale Rolle von PVAT bei der Regulierung der vaskulären Homöostase und der Beteiligung an der Pathogenese von Herz-Kreislauf-Erkrankungen beleuchtet. Ein umfassendes Verständnis der Eigenschaften und Regulation von PVAT ist von großer Bedeutung für die Entwicklung zukünftiger Therapien. Primärkulturen von periaortalen Adipozyten sind wertvoll für die Untersuchung der PVAT-Funktion und der Interaktion zwischen periaortalen Adipozyten und Gefäßzellen. In dieser Arbeit wird ein wirtschaftliches und praktikables Protokoll für die Isolierung, Kultivierung und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortalem Fettgewebe der Maus vorgestellt, das für die Modellierung der Adipogenese oder Lipogenese in vitro nützlich sein kann. Das Protokoll beschreibt die Gewebeverarbeitung und Zelldifferenzierung für die Kultivierung von periaortalen Adipozyten aus jungen Mäusen. Dieses Protokoll wird den technologischen Grundstein für die Untersuchung der PVAT-Funktion auf der Laborseite bilden.

Perivascular adipose tissue (PVAT), a perivascular structure composed of a mixture of mature adipocytes and a stromal vascular fraction (SVF), is believed to interact with the adjacent vessel wall via its secretome paracrineally1. As a critical regulator of vascular homeostasis, PVAT dysfunction is implicated in the pathogenesis of cardiovascular diseases2,3,4. The SVF of adipocyte tissue consists of several expected cell populations, including endothelial cells, immune cells, mesothelium cells, neuronal cells, and adipose stem and progenitor cells (ASPCs)5,6. It is well known that ASPCs residing in the SVF of adipose tissue can give rise to mature adipocytes5. SVF is inferred to be a critical source of mature adipocytes in PVAT. Several studies have shown that PVAT-SVF can differentiate into mature adipocytes under specific induction conditions6,7,8.
Currently, there are two isolation systems for isolating SVF from adipose tissue, one is enzymatic digestion and the other is non-enzymatic9. Enzymatic methods typically result in a higher yield of nucleated progenitor cells10. To date, the benefits of SVF in promoting vascular regeneration and neovascularization in wound healing, urogenital, and cardiovascular diseases have been widely demonstrated11, especially in dermatology and plastic surgery12,13. However, the clinical application prospects of PVAT-derived SVF have not been well explored, which may be attributed to the lack of a standardized method for the isolation of SVF from PVAT. The objective of this protocol is to establish a standardized approach for the isolation, culture, and adipogenic induction of SVF-derived preadipocytes from mouse PVAT surrounding the thoracic aorta, enabling further investigation of PVAT function. This protocol optimizes tissue processing and cell differentiation techniques for culturing periaortic adipocytes obtained from young mice.

Autor im Rampenlicht: Die Bedeutung von Isolierung, Kultur und adipogener Induktion von SVF-abgeleiteten Präadipozyten aus perivaskulärem Fettgewebe der Maus 

Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortischem Fettgewebe der Maus

We aim to establish a standardized approach for the isolation culture and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mass PVAT. This protocol enables us to conduct further investigations into PVAT function and into the communication between periaortic adipocytes and vascular cells in vitro. The main challenges we currently face in our experiments include the restricted of availability of PVAT and the requirements for additional human and the material resources when compared to using immortalized preadipocytes.Our protocol allows for the study of perivascular adipose tissue function and it's relationship with vascular cells. We also offers a basis for studying PVAT ring and genes, and heterogeneity, and provides a platform for exploring the important regulator of PVAT differentiation and the adipogenesis in vitro.

Mit diesem oben beschriebenen Protokoll haben wir sorgfältig PVATs isoliert, die die thorakalen Aorten der Maus umgeben (Abbildung 1A-D). Nach dem Waschen und Zerkleinern der PVATs in kleine Stücke mit einer sterilen Schere (Abbildung 1E,F) wurden die Gewebefragmente in einer Aufschlusslösung, die Kollagenase Typ 1 (1 mg/ml) und Dispase II (4 mg/ml) enthielt, aufgeschlossen und bei 37 °C auf einem Schüttler für 30-45 Minuten inkubiert ...

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In dieser Arbeit beschreiben wir die Isolierung, Kultivierung und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortalem Fettgewebe der Maus, was die Untersuchung der perivaskulären Fettgewebsfunktion und ihrer Beziehung zu Gefäßzellen ermöglicht.

Perivascular adipose tissue (PVAT) is an adipose tissue depot that surrounds blood vessels and exhibits the phenotypes of white, beige, and brown ...

Unser Ziel ist es, einen standardisierten Ansatz für die Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der Stroma-Gefäßfraktion aus Massen-PVAT zu etablieren. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, weitere Untersuchungen zur PVAT-Funktion und zur Kommunikation zwischen periaortalen Adipozyten und Gefäßzellen in vitro durchzuführen. Zu den größten Herausforderungen, mit denen wir derzeit in unseren Experimenten konfrontiert sind, gehören die eingeschränkte Verfügbarkeit von PVAT und der Bedarf an zusätzlichen personellen und materiellen Ressourcen im Vergleich zur Verwendung von immortalisierten Präadipozyten.Unser Protokoll ermöglicht die Untersuchung der Funktion des perivaskulären Fettgewebes und seiner Beziehung zu Gefäßzellen. Wir bieten auch eine Grundlage für die Untersuchung von PVAT-Ringen und -Genen sowie der Heterogenität und bieten eine Plattform für die Erforschung des wichtigen Regulators der PVAT-Differenzierung und der Adipogenese in vitro.

isolation-culture-adipogenic-induction-stromal-vascular-fraction

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue

1.2K Aufrufe.  Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Unser Ziel ist es, einen standardisierten Ansatz für die Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der Stroma-Gefäßfraktion aus Massen-PVAT zu etablieren. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, weitere Untersuchungen zur PVAT-Funktion und zur Kommunikation zwischen periaortalen Adipozyten und Gefäßzellen in vitro durchzuführen. Zu den größten Herausforderungen, mit denen wir derzeit in unseren Experimenten konfrontiert sind, gehören die eingeschränkte Verfügba...

Serie: Autor im Rampenlicht: Die Bedeutung von Isolierung, Kultur und adipogener Induktion von SVF-abgeleiteten Präadipozyten aus perivaskulärem Fettgewebe der Maus 

Perivascular adipose tissue (PVAT) is an adipose tissue depot that surrounds blood vessels and exhibits the phenotypes of white, beige, and brown adipocytes. Recent discoveries have shed light on the central role of PVAT in regulating vascular homeostasis and participating in the pathogenesis of cardiovascular diseases. A comprehensive understanding of PVAT properties and regulation is of great importance for the development of future therapies. Primary cultures of periaortic adipocytes are valuable for studying PVAT function and the crosstalk between periaortic adipocytes and vascular cells. This paper presents an economical and feasible protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, which can be useful for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro. The protocol outlines tissue processing and cell differentiation for culturing periaortic adipocytes from young mice. This protocol will provide the technological cornerstone at the bench side for the investigation of PVAT function.

Here, we describe the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, allowing for the study of perivascular adipose tissue function and its relationship with vascular cells.

Forschung

Biologie

Dissection and Isolation of Murine Perivascular Adipose Tissue (PVAT)

Begin by spraying the properly euthanized mouse with 75%alcohol to disinfect the skin. Then place the mouse in a supine position. Lift the skin of the animal's abdominal region, and using surgical scissors, make a small incision in it.Then using the scissors, bluntly separate the skin and abdominal muscles from the pelvis to the neck, along the ventral midline. Expose the heart and lungs by cutting the diaphragm and ribs along both sides of the midline. Next, carefully remove the liver, spleen, bowels, and kidney, avoiding damage to the intestinal wall.Following that, remove the lungs and esophagus. Now gently lift the heart using forceps held in one hand and separate the aorta from the spine with surgical scissors held in the other hand. Then place the heart and aorta in a 60 millimeter petri dish, containing antibiotic supplemented PBS.Retrieve the microsurgical forceps and microsurgical scissors from the alcohol, and rinse them in 25 milliliters of PBS to remove excess alcohol. Working under a stereo microscope, remove the thymus and other tissues from the heart and aorta. Then remove the heart, leaving the aorta with the perivascular adipose tissues or PVATs.Transfer the aorta along with the PVATs to a clean 60 millimeter petri dish containing antibiotic supplemented PBS. Using one pair of microsurgical forceps, hold the aorta, and using another pair, pull off the attached adipose tissues to separate the PVATs from the aorta. Remove as much vascular tissue as possible while causing minimal harm to the PVATs.Finally, transfer the collected PVATs into a two milliliter microcentrifuge tube, containing antibiotic supplemented, high glucose, DMEM, placed on ice.

Dissektion und Isolierung von murinem perivaskulärem Fettgewebe (PVAT)

Isolation of Stromal Vascular Fraction (SVF) from Perivascular Adipose Tissue (PVAT)

While working under a class two laminar flow hood, begin by sequentially washing the perivascular adipose tissues or PVATs collected from mice two times. First, using PBS containing 10%penicillin-streptomycin, and, next, using PBS supplemented with 1%penicillin-streptomycin. Transfer the rinsed tissues into a sterile 60-millimeter Petri dish and add 200 microliters of digestion solution to it.Using sterile scissors, mince the tissues into pieces having a dimension of one cubic millimeter. With the help of sterile scissors, cut a plastic pipette tip to broaden its end. Then transfer the minced tissue mix to a 15-milliliter centrifuge tube using the broad-ended pipette tip.Add six milliliters of the digestion solution to the tissues to initiate digestion. After tying the tube horizontally on a rack, incubate it at 37 degrees Celsius in an orbital shaker for 30 to 45 minutes. Every 5 to 10 minutes, remove the tube from the shaker in the incubator and manually shake it up and down vigorously.Pass the digested tissue mix through a 70-micron cell strainer into a 50-milliliter centrifuge tube. Rinse the strainer with an equal volume of culture medium to maximize cell yield and quench digestion. Transfer the filtrate to a new 15-milliliter centrifuge tube.Centrifuge the tube to isolate the stromal vascular fraction or SVF. Invert the tube to discard the supernatant and re-suspend the pellet in five milliliters of PBS. Centrifuge the tube again at 1, 800 G for five minutes before discarding the supernatant.Re-suspend the pellet in an appropriate volume of culture medium. Seed the cells into a collagen-coated 12-well plate and incubate overnight at 37 degrees Celsius in a humid atmosphere with 5%carbon dioxide. On the next day, remove cell debris and red blood cells by aspirating the culture medium and washing the cells with antibiotic-supplemented PBS pre-warmed to 37 degrees Celsius.Finally, add one milliliter of fresh culture medium to each well, and continue culturing the cells until they reach the desired stage of confluency.