Zusammenbau der aus humanen pluripotenten Stammzellen gewonnenen Blut-Hirn-Schranke (iBBB) unter Verwendung der dissoziierten Endothelzellen, Parasiten und Astrozyten. Kombinieren Sie die drei Zelltypen in einem konischen Röhrchen und fügen Sie dabei 10 % mehr als die berechnete Anzahl von Zellen hinzu, um Pipettierfehler zu berücksichtigen. Schleudern Sie die Zellmischung bei 300 g für drei Minuten herunter. Saugen Sie den Überstand an und lassen Sie das Zellpellet mit ca. 50 Mikrolitern des Mediums zurück.
Mit einer P200-Pipette wird das Zellpellet vorsichtig in das Restmedium resuspendiert, um eine Einzelzellaufschlämmung zu erzeugen. Legen Sie das Röhrchen mit der resultierenden Zellaufschlämmung auf Eis und geben Sie eine ausreichende Menge reduzierter GF Basement Membrane Matrix entsprechend der gewünschten Anzahl von iBBBs hinzu. Mischen Sie die Zellen homogen und führen Sie keine Luftblasen ein.
Pipettieren Sie 50 Mikroliter der resultierenden Zellmatrixmischung in eine Vertiefung einer 48-Well- oder 96-Well-Glasboden-Kulturschale und verteilen Sie sie gleichmäßig auf dem Boden der Schale. Inkubieren Sie die Schale bei 37 Grad Celsius für 30 bis 40 Minuten, um die Matrix zu polymerisieren und gleichzeitig die Zellen einzukapseln. Zum Schluss geben Sie 500 Mikroliter ergänztes Astrozytenmedium in die Vertiefung und halten die iBBBs in Kultur.
Für eine 96-Well-Platte werden 100 bis 150 Mikroliter Medium in die Bohrung gegeben, bis sie für nachgelagerte Assays ausreichend entwickelt sind, was in der Regel zwei Wochen dauert. Die richtig geformte iBBB erschien unter einem Hellfeldmikroskop als erstarrte, einzelne durchscheinende Scheibe. Nach 24 Stunden wurden gleichmäßig verteilte Einzelzellen identifiziert.
Nach zwei Wochen waren deutlichere Strukturen sichtbar, wenn auch schwer zu definieren.
