Dieses menschliche Blut-Hirn-Schnittstellenmodell ist nützlich für die Untersuchung der Übertragung von Molekülen in das Neurosystem. Neben der Untersuchung von Mikroben erreichen einen infizierten Hirnschmerztumor. Die Zugabe des Mini-Gehirns zu dieser Blut-Hirn-Schranke oder BBB-Modell ermöglicht die Untersuchung unserer Krankheitserreger und Moleküle, die das BBB Verhalten im Gehirn verursachen.
Das Verfahren wird Florian Bakao, der Doktorand für mein Labor, demostrating. Um ein BBB Mini-Gehirn-Polyester-Membran-Membran-Insert-Gerät einzurichten, verdünnen Sie die Zellen auf eine fünfmal 10 bis die vierte Zelle pro Insert-Konzentration unvollständiges Endothelzellmedium und fügen Sie das entsprechende Volumen von Zellen zu jedem Polyester-Membrankultureinsatz in einer 12-Well-Platte hinzu. Platzieren Sie dann die Inserts und den Zellkultur-Inkubator, bis die Zellen eine 100%ige Konfluenz erreichen.
Halten Sie eine 12 WellPlatte mit einem Milliliter Poly-D-Lysin sie gut für vier Stunden bei Raumtemperatur. Gefolgt von einem Milliliter Laminin pro Brunnen über Nacht. Ersetzen Sie das Laminin durch einen Milliliter Endothelzellmedium, ergänzt durch 5% fetales Rinderserum oder FBS.
Platzieren Sie den Platz für eine Stunde in einem Inkubator. Um das Minikorn sanft zu versuchen, die menschlichen Neuronen Astrozyten in CHME klonen fünf Zellen vorzubereiten. Ordnen Sie die Zellpellets dem kompletten Endothelzellmedium zu.
Nach Zählung bei 3,6 mal 10 bis fünf Neuronen und Astrozyten auf 0,4 mal 10 bis zum fünften CHME-Klon haben fünf Zellen pro Brunnen eine 12-Well-Platte. Und säen Sie die 12 Brunnenplatte. Um das BBB Mini-Gehirn 24 Stunden nach der Aussaat zu konstruieren, ersetzen Sie das verwendete Medium durch frisches komplettes Endothelzellmedium und übertragen Sie die zerebralen mikrovaskulären endothelialen Zellbeschichteten Polyestermembrankultureinsätze über die Mini-Gehirnzellen.
Legen Sie dann das BBB-Gerät viele Gehirn in den Inkubator. Um die BBB Mini-Gehirn-Endothelperinabilität zu validieren, fügen Sie 1,5 Milliliter Transportpuffer pro Brunnen zu einer neuen 12 Well-Platte hinzu. Und kippen Sie jeden Filter auf den Kopf, um das Medium vorsichtig zu entfernen, ohne die Endothelzellbarriere zu beeinträchtigen.
Legen Sie jeden Filter in einen Brunnen der Transportpuffer gefülltplatte, und fügen Sie 0,5 Milliliter Luzifer gelb in jedem Brunnen. Legen Sie die Platte dann 10 Minuten lang in den Inkubator, bevor Sie die Filter in eine neue Transportpuffergefüllte 12 Wellplatte übertragen. Nach der Einrichtung eines BBB viele Gehirngerät wie gezeigt, fügen Sie 3500 Plattformeinheiten der französisch neurotrophen VirusStamm des Gelbfiebervirus verdünnt und 50 Mikroliter von 2%FPS Endothelzellmedium, sehr sorgfältig, auf der Oberseite der Luminal-Fach.
Impfen Sie die Kontrolle BBB Mini-Gehirn mit 50 Mikroliter von 2%FBS Endothelzellmedium ohne Virus. Dann legen Sie das Virus setzen BBB viele Gehirngerät in den Inkubator für 24 Stunden. Entfernen Sie am nächsten Tag die Einsätze, um die Endothelzellpermeabilität und einen Begleiter genau wie gezeigt zu bestimmen.
Speichern Sie einen Milliliter Probe aus jedem Brunnen, um den Virustiter im mittleren Fach zu bestimmen. Unter dem Einsatz sanft, um Leckagen des Luminalfachs in die abluminalen Fächer zu vermeiden. Um den Transport eines Neurons zu untersuchen, das auf Biomolekulare über die Bluthirnschranke abzielt, fügen Sie das Biomolekül von Interesse zu den Inserts hinzu und geben Sie die Platte an den Zellkultur-Inkubator zurück.
Nach 24 Stunden aus der Ferne einsätze und bestimmen Endothelpermeabilität. Dann färben Sie die vielen Gehirnzellen mit dem entsprechenden Antikörper, um das Vorhandensein des Biomoleküls von Interesse im Mini-Gehirn zu erkennen. Menschliche zerebrale mikrovaskuläre Endothelzellen drücken alle Teilmengen von Rececptoren, Efflux-Transportern oder Transportern aus, die für ihre biologischen Funktionen wichtige relevante Proteine sind.
Einige französische Neurotropic Virus Stamm von Gelbfieber-Virus kann die Blut-Hirn-Schranke nach 24 Stunden überqueren. Die Viren verstärken sich dann für die nächsten zwei Tage durch die Vermehrung des Virus in den Gehirnzellen. Darüber hinaus wird die Expression spezifischer viraler Biomarker stimuliert, wenn diese neuroinvasive virusische Population seriell auf den Mini-Gehirnzellen durchdrungen wird und streng mit der Viruslast korreliert.
Nach der Hinzukommen an die Grenze der Kompartiment Zelle durchdringendmolekül Neuro-Tag Neurovita kreuzt die Blut-Hirn-Schranke und ist in der Lage, menschliche Neuronen ziel. Zelldurchdringende Molekül Neurotag Delta neurovita überschreitet die Endothelzellbarriere, zielt aber weniger effizient auf die menschlichen Neuronen. Nach der Hinzukommen in das kleine mittlere Fach, Zelle durchdringende Molekül Neuro-Tag Neurovita kreuzt die Blut-Hirn-Schranke und ist in der Lage, die Axone der menschlichen Neuronen zu regenerieren, nach der Wundung.
Im Gegensatz zum zelldurchdringenden Molekül Neuro-Tag Neurovita Delta, der inaktiven Form von Neurovita. Bei Anwendung nach dem Axon Kratzen Zelle durchdringende Molekül Neuro-Tag Neurovita löst den Neuroschutz der verwundeten Neuronen und die x zonale Regeneration. Streng um der Praxis willen.
I-Zell-Passagen nicht überverwenden. Versuchen Sie, einen Anschein von Medium und Regionen zu erhalten und überprüfen Sie, ob Mykoplasmen fehlen. Wechselwirkungen zwischen dem Mini-Gehirn und den Medikamenten sind Mikroben von Interesse können weiter durch Transkript untersucht werden, die diese oder klassische Biologie genannt Techniken chemischisieren.
