Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft DFG unter Grantnummer FO 315/4-1 und DFG SFB 688 unterstützt.

Ein. Isolierung von Hirnkapillaren <ol><li> Für jedes Präparat verwenden, fünf Minuten vor zehn neugeborenen Mäusen beiderlei Geschlechts (3-5 Tage alt). </li><li> Euthanize eine Maus nach den örtlichen IACUC / Tierarzt Empfehlungen, entfernen Sie das Gehirn sofort, und der Transfer in eine Petrischale mit folgender Lösung: 15 mM Hepes (pH 7,4), 153 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,3 mM CaCl 2 x 2H 2 O, 2,6 mM MgCl 2 x 6 H 2 O, 1% (w / v) BSA (im folgenden bezeichnet als Puffer A). </li><li> Sofern nicht anders angegeben, sollten alle Isolierungsverfahren bei Raumtemperatur (RT) (22-24 ° C) unter der Sterilbank durchgeführt werden. Schneiden Sie die Gehirne (Großhirn, ohne Kleinhirn und Hirnstamm), nach dem Entfernen der Hirnhäute und Kapillar-Fragmente, in Puffer A mit einem sterilen Skalpell. Pipettieren Die Gewebestücke nach oben und unten mit einer 10 ml Pipette, bis keine Klumpen erscheinen. Man führt die Suspension in einen 50 ml-Falcon-Röhrchen und Zentrifuge bei 250 × g für 5 min bei RT. </li></ol> Anmerkung: Meninges können als dünne, transparente Membranen an der Oberfläche des Hirngewebes identifiziert werden. Sie können vorsichtig mit sterilen Pinzetten entfernt werden. <ol start="4"><li> Überstand verwerfen. </li><li> Das Pellet in 4,5 ml Puffer A mit 1,5 ml 0,75% (w / v) Collagenase / Dispase (Roche) und Inkubation für 45 min bei 37 ° C in einem Wasserbad (gelegentlich Schütteln). </li><li> Inzwischen bereitet die 12-Well-Platten durch Beschichten vier Vertiefungen mit Kollagen IV (0,1 mg / ml in 50 mM Essigsäure gelöst). Lassen Sie für 1 Stunde halten. </li><li> Stoppen Sie die Verdauung durch Zugabe von 15 ml eiskaltem Puffer A. das Pellet gründlich. </li><li> Die Suspension bei 250 x g für 10 min bei RT. </li><li> Überstand verwerfen. </li><li> An Myelin zu entfernen, 10 ml 25% (w / v) BSA (Sigma, Reinheit&gt; 98%) und Zentrifuge bei 1000 × g für 20 min bei 4 ° C. 25% BSA sollte in 1x PBS (PAA Laboratories) aufgelöst werden und durch 0,2 um filter). </li><li> Vorsichtig den Überstand verwerfen, das Pellet in 10 ml Puffer A und übertragen auf ein neues Falcon-Röhrchen. </li><li> Die Suspension bei 250 x g für 5 min bei RT. Das resultierende Pellet enthält die Endothelzellen. </li><li> Zweimal waschen das Kollagen IV-beschichteten 12-Well-Platte mit PBS. </li><li> Das Pellet in 4 ml Wachstumsmedium (DMEM mit 10% FCS, 50U/ml Penicillin / Streptomycin 1% L-Glutamin) und Platte die Zellsuspension in zwei Vertiefungen, 2 ml zu jeder Vertiefung. Hinzufügen des Puromycin zu einer Endkonzentration von 4 pg / ml und Inkubation für 45 min bei 37 ° C in einem Zellkulturbrutschrank. Dieser Schritt ermöglicht die Entfernung von schnell anhaftenden Zellen. Hinweis: Puromycin wird für 24 h zugegeben. Nur Gehirn ECs metabolisieren kann es für andere Zelltypen Puromycin toxischen 14 ist. </li><li> Übertragen Sie die 2 ml Medium mit nicht verklebten Zellen aus Schritt 1,14 in zwei frische Brunnen (diese Vertiefungen enthalten die EG-Fraktion). Füllen Sie die Vertiefungen mit anhaftenden Zellen aus step 1,14 mit 2 ml frischem Medium (diese Vertiefungen enthalten anderen Zelltypen, wie Fibroblasten, Astrocyten und können parallel gezüchtet werden und für Vergleiche der Morphologie). </li><li> Ändern Sie das Medium des folgenden Tages. </li></ol> 2. Immortalisierung der Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen <ol><li> Kultivieren die GP + E-86 Neo (GPENeo) 15 Fibroblasten, sekretieren ein replikationsdefizienter Virus mit Polyoma mittleren T-Onkogen in DMEM Medium mit 10% hitzeinaktiviertem FCS, 50U/ml Penicillin / Streptomycin und 2 mg / ml G418 ( . PAA Laboratories) in Gelatine beschichteten Kolben Anmerkung: Polyoma mittleren T-Onkogen Transfektion bewirkt Wachstumsvorteil ECs über nicht ECs, die zu einer homogenen Monoschicht von Zellen mit endothelialen Morphologie 4 bis 6 Wochen der Kultur. GPENeo sind nicht im Handel erhältlich und können als gemeinsame öffentliche Material erhalten werden (siehe Originalarbeiten 4,16). </li><li> Um das Virus enthaltende Medium für verwenden<html> Immortalisierung kultivieren die GPENeo Zellen in G418-freiem Medium für 24 h. </li><li> Entfernen 10 ml des Überstandes und GPEneo hinzuzufügen Polybrene (Hexadimethrinbromid) (Sigma) auf eine Endkonzentration von 8 ug / ml, durch 0,45 um Filter zu sterilisieren, um die zellulären Bruchstücke zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie das Wachstumsmedium von den EC-Kulturen in Teil 1 hergestellt und 2 ml GPEneo Überstand / Polybrene Mischung in die Vertiefungen. Wiederholen es am nächsten Tag mit einer frischen GPEneo Überstand / Polybrene Mischung Anmerkung:. Polybrene verwendet wird, um Poren in der Zellwand zu machen, um die Infektion mit den viralen Partikeln) zu erleichtern. </li><li> Entfernen Sie die GPEneo Überstand / Polybrene Mischung am folgenden Tag, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und pflegen die Zellen im Wachstumsmedium ändern Sie es alle 3 Tage. Bei Konfluenz spaltete die Zellen 1:2 auf Kollagen IV-beschichteten Platten. </li><li> Normalerweise sollten stabile zerebralen Endothelzellen (CEND) Zelllinien 4-5 Wochen später erhalten werden. </li></ol>e &quot;&gt; 3. kultivieren die Brain mikrovaskulären Endothelzellen <ol><li> Tauen Sie die Zellen aus cryoaliquot im Wasserbad und Übertragung in 15 ml-Falcon mit 10 ml vorgewärmten Medium. </li><li> Die Suspension bei 250 x g für 5 min bei RT. </li><li> Entfernen Medium, übertragen die Pellets in der Kollagen IV beschichteten T 25 cm 2 Zellkulturflasche mit vorgewärmten Wachstumsmedium (Zelldichte für die Beschichtung sollte mindestens 1x 10 4 Zellen / ml). </li><li> Ändern Medium am nächsten Tag und nachdem die Zellen erreicht Zusammenfluss (in der Regel nach 5 Tagen) spalten die Zellen. </li></ol> 4. Splitting der CEND-Zellen (Hinweis: Splitting nur einmal pro Woche getan werden sollte, vermeiden Splitting Höher als 1:4). <ol><li> Entfernen Medium, waschen Sie die Zellen mit PBS. </li><li> 3 ml warmem Trypsin-EDTA-Lösung (PAA Laboratories) (T 75 cm 2-Kolben), bei 37 ° C und warten Sie, bis die Zellen Schicht verteilt ist (in der Regel innerhalb von 5 bis 15 min). </li><li> 5 ml of Wachstumsmedium und Abpipettieren und Transfer zu einem neuen Kollagen IV-beschichteten Kolben. </li></ol> 5. Einfrieren von CEND-Zellen <ol><li> Besorgen Sie sich die Zellsuspension wie in Schritt 4 beschrieben </li><li> Die Suspension bei 250 x g für 5 min bei RT. </li><li> Zellpellet (aus 1 T 75 cm 2-Kolben) in 6 ml Einfriermedium (95% Wachstumsmedium, 5% DMSO). </li><li> Teilen Sie die Zellsuspension in vier 1,5 ml Kryo-Aliquots. Hinweis: Ein Kryo-Aliquot auf T 25 cm 2 ausgesät werden. </li><li> Bewahren Sie die Kryo-Aliquots in flüssigem Stickstoff Dampftemperatur. </li></ol> CEND Wachstumsmedium: 450 ml DMEM, 10% FCS, 10 ml L-Glutamin, 2% MEM-Kit, 2% NEAA, 10 ml Natrium-Pyruvat, 50 U / ml Penicillin / Streptomycin 6. Repräsentative Ergebnisse Die CEND und cerebEND Zellen wurden durch Immunfärbungen der endothelialen a gekennzeichnetnd BBB Markern sowie durch Messungen der transendotheliale elektrischen Widerstand (TEER) und Durchlässigkeit. Die CEND und cerebEND hatte eine ähnliche Morphologie der primären Kulturen des Gehirns ECs, mit Monoschichten aus dicht gepackten länglichen Zellen, die Wachstumshemmung bei Konfluenz ausgestellt. Die Zellen exprimiert gut nachweisbaren Konzentrationen von Claudin-5, Occludin und VE-Cadherin Proteine, die an den Zell-Zell-Verbindungen lokalisiert wurden, wie durch Immunfluoreszenz (Abbildung 3) 4,5 gezeigt. Kultivieren CEND Zellen in Serum-reduziertem Medium zu einer Erhöhung der TEER (ab 150 Qcm 2 in Gegenwart von 10% Serum und 500 Qcm 2 in Gegenwart von 2% Serum), die durch die Zugabe von Hydrocortison potenziert wurde (800 Qcm führten 2) oder Insulin (1.000 Qcm 2) 4. Monoschichten von CEND in Serum-reduziertem Medium für 21 Tage kultiviert hatten TEER von 900 Qcm 2 (Abbildung 4). TEER wurde gemessen unter Verwendung einer Anordnungenthaltenden Strom-und Spannungs-ziehende Meßelektroden (World Precision Instruments). Zum Vergleich wurde der primäre mikrovaskuläre Gehirn ECs wurde berichtet, TEER-Werte von 200-600 haben Qcm 2 und eine handelsübliche Maus-Zelllinie bEnd.3 hatten TEER-Werte von 100-140 Qcm 2 (für Übersichtsartikel siehe Abt 2005 und Toth et al., 2011 17,18). Darüber hinaus wurde der Durchgang von Makromolekülen, wie nicht geladene FITC-Dextrane Molekularmassen 4, 10, 70 und 500 kDa oder Fluorescein (300 Da) durch die Monoschicht von CEND in 2% FCS Differenzierungsmedium über 4 h verringerte verglichen mit Kontrollzellen in Wachstumsmedium mit 10% FCS gehalten: parazellulären Flussmittel wurde zu 30% der Kontrollzellen für Fluorescein verringert, auf 26% für FITC-Dextran 10 und 70 kDa, und Flussmittel wurde zu 4,5% der Kontroll-Zellen für FITC reduziert -dextrtan 500 kDa. TEER-Werte ähnlich war die Durchlässigkeit auf der untersten Ebene in den Zellen in Gegenwart von gluc kultiviertocorticoids (GC) 4. In weiteren Studien identifizierten wir die Glucocorticoid Zielgene, Occludin, Claudin-5 und VE-Cadherin in Gehirn Gefäßendothel 4,7,9. GC Behandlung führte zu einer Erhöhung der Expression dieser Proteine ​​und auf die Umlagerung von VE-Cadherin mit dem Zytoskelett. Die direkte GC-vermittelten Regulation von Tight junction-Proteine ​​und Claudin Occludin-5 erscheint durch GC Response-Elemente in ihren Promotorregionen 4,7,19. Zusätzlich Claudin-5 wurde als neuartiges Östrogen Ziel im Gefäßendothel 10 identifiziert. Endotheliale Dysfunktion liegt vielen verschiedenen Krankheiten. Wir kultiviert Die CEND unter Sauerstoff / Glukose Deprivation (OGD) Bedingungen. OGD führte zur Unterbrechung der BBB-Funktion, die nach der kombinierten Behandlung mit GC und Proteasom-Inhibitor Bortezomib 12 rekonstituiert werden konnte. OGD Bedingungen führten zu einem starken Anstieg der Glucose-Aufnahme und in der Expression von Glucose transporsitz in cerebEND, denen durch die Zugabe von MK801, ein nicht-kompetitiver Inhibitor der NMDA-Rezeptor-13 könnte. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" /> Abbildung 1. Morphologie Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen (CEND) eine Woche nach der Isolierung. Lichtmikroskopie Bilder wurden unter dem 6x (A) und 15x (B) Vergrößerung. Die inselartigen gebildeten Kolonien von Endothelzellen sind sichtbar. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" /> Abbildung 2. Morphologie des Gehirns mikrovaskulären Endothelzellen (CEND) 1 Monat nach der Isolierung und Immortalisierung. Lichtmikroskopie Bilder wurden unter 15x Vergrößerung. Ein konfluenten, homogene Endothelzelle Monoschicht beobachtet werden kann. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" /> Abbildung 3. Verewigt Gehirn microvascular endothelialen Zellen exprimieren Claudin-5, Occludin und VE-Cadherin. CEND Zellen wurden auf Kollagen IV-beschichteten Deckgläsern gezüchtet und angefärbt mit Antikörpern gegen Claudin-5 (A), Occludin (B) und VE-Cadherin (C). Die Aufnahmen wurden mit einem Zeiss-Mikroskop Axioscop2 unter 40-facher Vergrößerung. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" /> Abbildung 4. Messung transendotheliale elektrischen Widerstand (TEER) von CEND Monoschicht. CEND wurden auf Kollagen IV-beschichteten Transwell-Filter (Porengröße 0,4 um) gezüchtet. Nach Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen in Medium mit 2% FCS gehalten. TEER wurde nach 7, 14 und 21 Tagen unter Verwendung einer Anordnung, die Strom-und Spannungs-ziehende Messelektroden gemessen.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das beschriebene Verfahren kann zur Isolierung von mikrovaskulären ECs verwendet werden aus verschiedenen Mausstämmen sowie aus verschiedenen Knock-out-Maus-Stämme, die spezifischen Änderungen im vaskulären Endothel-Funktion zu studieren. Als ein Verfahren zur Immortalisierung verwendeten wir die Transformation mit Onkoproteins von murinem Polyomavirus, Polyoma mittleren T-Antigen. Es wandelt sich rasch unreifen Endothelzellen in vivo und in vitro 20,21,22. Andere Verfahren zur Immortalisierung von ECs in der Literatur beschrieben sind beispielsweise die Immortalisierung mit SV40 large T-Antigens von Simian Virus 40 vakuolisierenden 23, Adenovirus E1A Genprodukt 24 oder Überexpression der katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase 3. Die Immortalisierung mit PYMT ist spezifisch für den murinen unreifen ECs, die Gewinnung eines homogenen EG Kultur aus neugeborenen Mäusen in einer kurzen Zeit ermöglicht. Immortalisierung verändert die Eigenschaften der Zellen und the Ergebnisse mit immortalisierten Zelllinien erhalten sollten entweder mit primären Zellen oder mit Experimenten in vivo an Mäusen verglichen werden. PYMT immortalisierten EG beschrieben worden, um eine hohe fibrinolytische Aktivität, die aus einer erhöhten Produktion von Urokinase-Plasminogen-Aktivator exprimieren und eine verminderte Produktion von Plasminogenaktivator-Inhibitoren 25. Direkter Vergleich von PYMT verewigt bEND5 Zelllinie mit primären ECs ergab, dass sowohl in vitro als BBB Modelle sind bekannt für T-Zell-Adhäsion Studien 26 geeignet. Die Zelllinien etabliert nach dem beschriebenen Verfahren kann bei niedrigen Passage-Nummer verwendet werden, um Barriereeigenschaften durch hohe Expression von BBB und EC junctional Proteine ​​zu erhalten, da die Zellen diese Eigenschaften verlieren, während des Alterns. Somit nach Verlust der Barriereeigenschaften, sollte die Herstellung einer neuen Zellinie betrachtet werden. Zelle Plattierungsdichte sollte für ECs hoch, da diese entscheidend für die Zellproliferation. Dies muss bei der Isolierung als auch Wartung des verewigt ECs werden. Jede neue Zelllinie sollte ihre Sperreigenschaften und für eventuelle Verunreinigungen mit anderen Zelltypen getestet werden. EC Monoschichten kann mit anti-Galactocerebrosid, Anti-glial fibrillary acidic protein-und anti-glatte Muskulatur-Antigen als primäre Antikörper angefärbt werden, um die Kontamination mit Oligodendrozyten, Astrozyten und Perizyten 4,27 auszuschließen. Um eine Kontamination durch meningal Gefäßsystem kann die Expression von Thrombomodulin getestet werden, was sich in allen Gefäßbetten mit Ausnahme des Gehirns 28 exprimiert. Interessanterweise unterscheiden sich die immortalisierten mikrovaskulären Endothelzellen Zelllinien aus verschiedenen Hirnregionen isoliert in ihrer Barriere-Eigenschaften und die Anfälligkeit für proinflammatorische Stimuli. Als ein Beispiel können die zerebrale CEND und zerebelläre cerebEND Zelllinien genannten 4,5 sein. CerebEND zeigten im Vergleichum CEND, geringere Expression von großen tight junction Komponenten Claudin-1 und Occludin. Jedoch waren die Ebenen der Claudin-3 und -12 höher cerebEND. Die Barrierefunktion cerebEND Zellen erlitten wesentlich unter einer Behandlung mit dem Entzündungsmediator, TNFa als die Barriereeigenschaften CEND Zellen tat 5. Höhere Kleinhirn Anfälligkeit für entzündliche Stimuli können in vivo in Patienten mit Multipler Sklerose und in seiner Tiermodell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis 29 beobachtet werden. Diese interessanten Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit der Erzeugung und Charakterisierung von einzelnen in vitro Modelle für unterschiedliche Hirnregionen, um die Zukunft Drug Targeting in das Gehirn zu verbessern.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td> Reinheit&gt; 98% </td></tr><tr><td> Kollagen IV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5533 </td><td> 50 ug / ml in 50 mM Essigsäure </td></tr><tr><td> Collagenase / Dispase </td><td> Roche </td><td> 10269638001 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Fötalem Kälberserum (FCS) </td><td> PAA Laboratories </td><td> A15110-1333 </td><td> Endkonzentration 10%, hitzeinaktiviertes (30 min bei 56 ° C) </td></tr&gt; <tr><td> L-Glutamin </td><td> Biochrom AG </td><td> K0282 </td><td> Lagerung: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> MEM Vitamine </td><td> Biochrom AG </td><td> K0373 </td><td> Lagerung: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Na-Pyruvat </td><td> Biochrom AG </td><td> L0473 </td><td></td></tr><tr><td> Neomycin (G418) </td><td> PAA Laboratories </td><td> P11-012 </td><td></td></tr><tr><td> Nicht essentielle Aminosäuren (NEA) </td><td> Biochrom AG </td><td> K0293 </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Penicilin / Streptomycin </td><td> Biochrom AG </td><td> A2212 </td><td> Lagerung: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene (Hexadimethrinbromid) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 107689 </td><td> 0,8 mg / ml in PBS, Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin / EDTA </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td> 0,05%, 0,02% EDTA in PBS </td></tr></tbody></table>

generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model

Epithel-und Endothelzellen (EC) bauen parazellulären Barrieren, die das Gewebe aus der externen und internen Umwelt zu schützen. Die Blut-Hirn-Schranke (BHS), bestehend aus EG, Astrozyten end-Füße, Perizyten und die Basalmembran ist verantwortlich für den Schutz und die Homöostase des Hirnparenchym. In vitro BBB Modelle sind gemeinsame Instrumente, um die Struktur und Funktion des BBB studieren auf zellulärer Ebene. Eine beträchtliche Anzahl von verschiedenen in vitro BBB Modelle wurden für Forschung in verschiedenen Labors auf dem neuesten Stand eingerichtet. Normalerweise werden die Zellen von Rindern, Schweinen, Ratte oder Maus Hirngewebe (ausführlich im Aufsatz von Wilhelm et al. 1). Menschlichen Gewebeproben sind nur in einer begrenzten Anzahl von Labors oder Unternehmen 2,3. Während primäre Zellpräparationen zeitaufwendig sind und die EC-Kulturen können von Charge zu Charge unterschiedlich, verewigt die Gründung der EG-lines steht im Mittelpunkt des wissenschaftlichen Interesses. Hier präsentieren wir eine Methode zur Festlegung einer immortalisierten Gehirn mikrovaskulären EC Linie von neonatalen Maus Gehirn. Wir beschreiben das Verfahren Schritt für Schritt verwalten die Reagenzien und Lösungen verwendet. Die Methode, mit unserem Labor etablierten ermöglicht die Isolierung eines homogenen verewigt Endothelzelllinie innerhalb von vier bis fünf Wochen. Das Gehirn mikrovaskulären endothelialen Zelllinien bezeichnet CEND 4 (aus Großhirnrinde) und cerebEND 5 (aus Kleinhirnrinde), wurden nach diesem Verfahren in der Förster Labor isoliert und sind effektiv zur Erläuterung der verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen an der BHS verwendet. Verwendung CEND und cerebEND haben wir gezeigt, dass diese Zellen zu Glucocorticoid 4,6-9 reagieren und Östrogen-Behandlung 10 sowie pro-infammatory Mediatoren wie TNFalpha 5,8. Darüber hinaus haben wir die Pathologie Multiple sc studiertlerosis 11 und Hypoxie 12,13 auf der EG-Ebene. Die CEND und cerebEND Linien können als ein gutes Werkzeug zur Untersuchung der Struktur und Funktion der BBB, zellulärer Reaktionen von ECs auf verschiedene Reize oder die Interaktion der EG mit Lymphozyten oder Krebszellen in Betracht gezogen werden.

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Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Diese Methode beschreibt, wie zu isolieren und zu verewigen mikrovaskulären Endothelzellen von der Maus Gehirn. Wir beschreiben ein Schritt-für-Schritt-Protokoll ausgehend von der Homogenisierung von Hirngewebe, Verdauungsschritten, Aussaat und Immortalisierung der Zellen. Normalerweise dauert es etwa fünf Wochen, um eine homogene, verewigt mikrovaskuläre Endothelzellen Zelllinie zu erhalten.

Erzeugung eines Immortalisierte Murine Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen Zelllinie als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blut-Hirn-Barriere Modell

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

generation-an-immortalized-murine-brain-microvascular-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

18.8K Aufrufe.  University of Wurzburg. Diese Methode beschreibt, wie zu isolieren und zu verewigen mikrovaskulären Endothelzellen von der Maus Gehirn. Wir beschreiben ein Schritt-für-Schritt-Protokoll ausgehend von der Homogenisierung von Hirngewebe, Verdauungsschritten, Aussaat und Immortalisierung der Zellen. Normalerweise dauert es etwa fünf Wochen, um eine homogene, verewigt mikrovaskuläre Endothelzellen Zelllinie zu erhalten.

Serie: Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Forschung

Neurowissenschaften

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of neural circuits underlying a variety of natural behaviors, including navigation1 , decision making 2,3, and the generation of complex motor sequences4,5,6. Advances in precision machining has allowed for the fabrication of light-weight devices suitable for chronic recordings in small animals, such as mice and songbirds. The ability to adjust the electrode position with small remotely controlled motors has further increased the recording yield in various behavioral contexts by reducing animal handling.6,7
 Here we describe a protocol to build an ultra-light motorized microdrive for long-term chronic recordings in small animals. Our design evolved from an earlier published version7, and has been adapted for ease-of use and cost-effectiveness to be more practical and accessible to a wide array of researchers. This proven design 8,9,10,11 allows for fine, remote positioning of electrodes over a range of ~ 5 mm and weighs less than 750 mg when fully assembled. We present the complete protocol for how to build and assemble these drives, including 3D CAD drawings for all custom microdrive components.

The design, fabrication and assembly of an ultra-light motorized microdrive is described. The device provides a cost-effective and easy-to-use solution for chronic recordings of single units in small behaving animals.

Konstruktion und Montage eines Ultra-light Motorisierte Microdrive für chronische Neural Recordings in Kleintiere

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Isolierung von primären murinen Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Schnittstellen 3D Engineered neuronalen Kulturen auf Mikroelektrodenarrays: ein innovatives<em&gt; In-vitro-</em&gt; Experimental Modell

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Eine In-Vivo -Bewertung der Störung der Blut - Hirn-Schranke in einem Rattenmodell des ischämischen Schlaganfalls

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Isolierung der primären murinen Skelettmuskulatur mikrovaskuläre Endothelzellen

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

Ein präklinisches Modell zur Beurteilung der Gehirnerholung nach akutem Schlaganfall bei Ratten

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a combination of focused ultrasound (FUS) induced blood-brain barrier opening (FUS-BBBO), gene delivery with adeno-associated viral (AAV) vectors, and activation of cellular signaling with engineered, chemogenetic, protein receptors and their cognate ligands. With ATAC, it is possible to transduce both large and small brain regions with millimeter precision using a single noninvasive ultrasound application. This transduction can later allow for a long-term, noninvasive, device-free neuromodulation in freely moving animals using a drug. Since FUS-BBBO, AAVs, and chemogenetics have been used in multiple animals, ATAC should also be scalable for the use in other animal species. This paper expands upon a previously published protocol and outlines how to optimize the gene delivery with FUS-BBBO to small brain regions with MRI-guidance but without a need for a complicated MRI-compatible FUS device. The protocol, also, describes the design of mouse targeting and restraint components that can be 3D-printed by any lab and can be easily modified for different species or custom equipment. To aid reproducibility, the protocol describes in detail how the microbubbles, AAVs, and venipuncture were used in ATAC development. Finally, an example data is shown to guide the preliminary investigations of studies utilizing ATAC.

This protocol delineates steps necessary for the gene delivery through focused ultrasound blood brain barrier (BBB) opening, evaluation of the resulting gene expression, and measurement of neuromodulation activity of chemogenetic receptors through histological tests.

Fokussierte ultraschallinduzierte Öffnung der Blut-Hirn-Schranke zur gezielten Behandlung von Hirnstrukturen und zur Beurteilung der chemogenetischen Neuromodulation

Erzeugung eines Immortalisierte Murine Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen Zelllinie als

Zusammenfassung

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