Murine Bone Marrow Harvest and Isolation for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment

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02:37 min

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November 10th, 2023

DOI :

10.3791/200882-v

November 10th, 2023

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Christina M. Kaszuba¹^,², Benjamin J. Rodems¹^,³, Sonali Sharma¹^,³, Edgardo I. Franco¹^,², John M. Ashton¹^,³^,⁴, Laura M. Calvi¹^,⁵, Jeevisha Bajaj¹^,³

¹Wilmot Cancer Institute, University of Rochester Medical Center, ²Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, ³Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, ⁴Genomics Research Center, University of Rochester Medical Center, ⁵Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, University of Rochester Medical Center

Transkript

Entnehmen Sie zunächst das Gewebe aus den Knochen der euthanasierten sezierten Maus. Legen Sie die gereinigten Knochen in eine neue Sechs-Well-Platte mit FACS-Puffer, die auf Eis gelegt wird. Die Knochen in einen Mörser mit zwei bis fünf Millilitern FACS-Puffer geben.

Zermahlen Sie die Knochen in kreisenden Bewegungen, bis das Knochenmark freigegeben ist. Ziehen Sie das Knochenmark mit einer Drei-Milliliter-Spritze nach oben und spülen Sie es herunter, um es zu homogenisieren. Ziehen Sie das Homogenat in eine andere Spritze und filtrieren Sie es dann durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen.

Spülen Sie die Gewebestücke aus ihrem Filter mit FACS-Puffer zurück in den Mörtel, bevor Sie sie ein zweites Mal homogenisieren. Filtern Sie das gespülte Gewebe wie zuvor. Als nächstes spülen Sie die restlichen Knochennadeln mit FACS-Puffer zurück in den Mörtel.

Anschließend werden die Stücke in ein 15-Milliliter-Röhrchen gespült, um eine maximale Ausbeute zu erzielen. Um das Knochenmark zu verdauen, zentrifugiert man es zunächst bei 300 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie das Knochenmarkpellet in zwei Milliliter Verdauungsmischung.

Die Mischung in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen. Anschließend bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten auf einem Rotator inkubieren. Fügen Sie nun 10 Milliliter FACS-Puffer hinzu, um die enzymatische Verdauung zu stoppen.

Filtrieren Sie die Mischung durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 400 G für sieben Minuten bei vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Erythrozyten-Lysepuffer.

Als nächstes fügen Sie 10 Milliliter FACS-Puffer hinzu, um die Lyse zu stoppen. Anschließend filtrieren Sie die Mischung wie zuvor in ein 50 Milliliter Röhrchen. Zum Schluss zentrifugiert man die Mischung bei 300 g fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikroliter FACS-Puffer. Für die Verdauung von Knochenspikulen werden zunächst die Knochenspikulen vorgewirbelt. Dekantieren Sie den Überstand und behalten Sie die Knochen an der Unterseite.

Als nächstes resuspendieren Sie die Spikulen in einem Milliliter der Knochenspikulationsmischung. Das Röhrchen 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf einem Rotator inkubieren. Zum Schluss stoppen Sie den Aufschluss mit 10 Millilitern FACS-Puffer.

Die Mischung wird in das 50-Milliliter-Röhrchen mit lysiertem und verdautem Knochenmark filtriert.

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