Murine Bone Marrow Staining for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment

Mischen Sie zunächst die isolierte murine Knochenmarksuspension mit der Knochenspikulensuspension. Pipettieren Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension auf ein Hämozytometer zur Zählung. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Anschließend wird das Pellet in 100 Mikroliter FACS-Puffer resuspendiert. Um die Zellen mit Antikörpern gegen magnetische Depletion zu färben, fügen Sie FC-Block, CD45 APC und TER-119 APC hinzu. Anschließend wird die Zellsuspension mit FACS-Puffer gewaschen.

Nach dem Zentrifugieren der restlichen Mischung wird das Pellet in 100 Mikroliter FACS-Puffer resuspendiert. Um die Zellsuspension mit Mikrokügelchen für den magnetischen Abbau zu färben, fügen Sie Maus-IgG und Anti-APC-Mikrokügelchen hinzu. Die Mischung 20 Minuten auf Eis inkubieren.

Waschen Sie die LD-Säule mit zwei Millilitern MACS-Puffer. Resuspendieren Sie die Zellen im Puffer und filtern Sie ihn dann durch ein Fünf-Milliliter-Reagenzglas mit einer 35-Mikrometer-Zellsiebkappe. Stellen Sie als Nächstes die LD-Säule auf den Magnetabscheiderständer und stellen Sie ein Fünf-Milliliter-Reagenzglas unter die Säule, um das eluierte Material aufzufangen.

Pipettieren Sie die Zellsuspension in die LD-Säule und sammeln Sie den negativen Fraktionsdurchfluss im Reagenzglas. Waschen Sie die Säule zweimal mit einem Milliliter MACS-Puffer und sammeln Sie das Eluentenmaterial im selben Röhrchen. Platzieren Sie die LD-Säule über einem neuen Fünf-Milliliter-Reagenzglas.

Geben Sie mit einer Pipette drei Milliliter Puffer in die Säule und spülen Sie dann die positiv markierten Zellen in ein Fünf-Milliliter-Reagenzglas. Zentrifugieren Sie sowohl die positive als auch die negative Fraktion und resuspendieren Sie das Pellet dann in 100 Mikroliter FACS-Puffer. Um die CD45 TER-119 negative Fraktion zu färben, fügen Sie einen Mikroliter jedes Antikörpers für jeweils 10 bis zu den sechsten Zellen hinzu.

Stellen Sie die Suspension für 20 Minuten auf Eis. Anschließend wird die Suspension vor dem Zentrifugieren mit zwei Millilitern FACS-Puffer gewaschen. Geben Sie einen Milliliter des Puffers in das Pellet und pipettieren Sie Propidiumiodid für die Färbung lebender Zellen.

Schließlich filtrieren Sie die Probe durch ein 35-Mikrometer-Zellsieb in ein Fünf-Milliliter-Reagenzglas, bevor Sie die Zellen auf einem mehrfarbigen Durchflusszytometer analysieren. Arterioläre Endothelzellen expandierten signifikant in der Mikroumgebung der akuten myeloischen Leukämie mit einem gleichzeitigen Verlust in den sinusoidalen Endothelpopulationen. Eine kleine Ausdehnung der mesenchymalen Stromazellen wurde im Alter von acht Wochen beobachtet.