Wir bedanken uns beim URMC Flow Cytometry Core. Diese Arbeit wurde durch den American Society of Hematology Scholar Award, den Preis der Leukemia Research Foundation und NIH-Stipendien R01DK133131 und R01CA266617 unterstützt, die an J.B.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit Protokollen durchgeführt, die vom University of Rochester University Committee on Animal Resources genehmigt wurden. Mäuse wurden in den Tierpflegeeinrichtungen der University of Rochester gezüchtet und gepflegt. Zur Modellierung des Hochrisiko-MDS wird das kommerziell erhältliche NHD13-Mausmodell19 verwendet. In diesem Modell werden Knochenmarkstromazellen in weiblichen NHD13-Mäusen im Alter von 8 Wochen vor dem Ausbruch der Krankheit analysiert. De novo AML wird wie zuvor beschrieben 6,11,20 erzeugt. Die Onkogene, die zur Induktion von AML verwendet werden, wie MLL-AF9 und NRas, sind mit GFP oder YFP markiert, was die Analyse der nicht-leukämischen GFP-Knochenmarkpopulationen mittels Durchflusszytometrie ermöglicht. Kurz gesagt, 10 Wochen alte weibliche C57BL/6J-Mäuse werden mit murinen GFP/YFP+ AML-Zellen transplantiert, und das Knochenmark wird 2 Wochen nach der Transplantation entnommen. Während in dieser Studie weibliche Mäuse zu Demonstrationszwecken verwendet werden, kann dieses Protokoll sowohl mit männlichen als auch mit weiblichen Mäusen durchgeführt werden. Sie kann auch entweder mit einem Oberschenkelknochen oder mit allen Röhrenknochen durchgeführt werden.
1. Entnahme des Knochenmarks
HINWEIS: Einzelheiten zum Präparationsprotokoll für Tiere finden Sie in Amend et al.26.
<ol><li>Reinigen Sie den Mörser und den Stößel mit 70%igem Ethanol, spülen Sie sie mit gekühltem FACS-Puffer ab (Tabelle 1) und legen Sie sie zum Abkühlen auf Eis, bevor Sie mit der Ernte beginnen. Platzieren Sie außerdem den MACs-Puffer (Tabelle 1) auf der Bank, damit er Raumtemperatur erreichen kann.</li>
	<li>Euthanasieren Sie das Tier gemäß den institutionellen Richtlinien und Protokollen für die Tierpflege und -verwendung.</li>
	<li>Besprühen Sie die Maus auf dem Arbeitstisch gründlich mit 70%igem Ethanol, bis ihr Fell nass ist. Heben Sie mit einer Pinzette und einer gebogenen Schere die Haut am Bauch an und machen Sie zwei etwa 0,5 mm lange Schnitte auf beiden Seiten der Maus, seitlich vom Bauch. Als nächstes machen Sie einen 0,5 mm langen Schnitt distal vom Bauch. Ziehe nach unten, um die Haut und das Fell von den Beinen der Maus zu entfernen.</li>
	<li>Setzen Sie die Schere senkrecht zum Becken auf, drücken Sie sie nach unten, während Sie den Oberschenkelknochen mit einer Pinzette nach oben ziehen. Der Hüftkopf sollte sich vom Becken lösen. Femur und Tibia am patellofemoralen Gelenk trennen. Legen Sie die Knochen in FACS-Puffer in eine 6-Well-Platte auf Eis.</li>
	<li>Entfernen Sie Gewebe aus den Knochen mit Gewebe in Laborqualität und legen Sie die gereinigten Knochen in eine neue 6-Well-Platte mit frischem FACS-Puffer auf Eis.</li>
	<li>Geben Sie alle Knochen mit 2-5 ml FACS-Puffer in den Mörser, so dass alle Knochen in den Puffer eingetaucht sind (passen Sie das Volumen des Puffers an, je nachdem, wie viele Knochen Sie verarbeiten). Zerkleinern und zerkleinern Sie die Knochen mit dem Stößel in kreisenden Bewegungen, bis das Knochenmarkgewebe freigesetzt wird.</li>
	<li>Homogenisieren Sie das Knochenmark mit einer 3-ml-Spritze, indem Sie die Flüssigkeit aus dem Mörser herausziehen und herunterspülen.</li>
	<li>Ziehen Sie die Flüssigkeit mit einer 3-ml-Spritze aus dem Mörser und filtern Sie sie durch ein 70-μm-Zellsieb in ein 50-ml-Röhrchen auf Eis. Spülen Sie die Knochen-/Gewebestücke aus dem Filter mit FACS-Puffer zurück in den Mörtel und kehren Sie zu Schritt 1.7 zurück, um sie ein zweites Mal zu homogenisieren und abzuseihen. Dies stellt die Knochenmarkfraktion dar.</li>
	<li>Spülen Sie die verbleibenden Knochenstücke (Spikulen) mit FACS-Puffer zurück in den Mörtel und spülen Sie sie mit FACS-Puffer in ein 15-ml-Röhrchen, um eine maximale Zellausbeute zu gewährleisten. Dies ist die Knochenspikulenfraktion.</li>
</ol>2. Verdauung des Knochenmarks
<ol><li>Das Knochenmark wird bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Umfüllen und den Überstand verwerfen.</li>
	<li>Das Knochenmark wird in 2 ml der Knochenmarkverdauungsmischung (Tabelle 1) resuspendiert und in ein 15-ml-Röhrchen überführt. Bei 37 °C für 45 min auf einem Rotator inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 10 ml FACS-Puffer hinzu, um die enzymatische Verdauung zu stoppen. Filtern Sie die Mischung durch ein 70-μm-Zellsieb in ein neues 50-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Die Mischung wird bei 400 x g für 7 min bei 4 °C pelletiert.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Knochenmarkpellet in 1 ml Erythrozyten-Lysepuffer (siehe Materialtabelle). 4 Minuten auf Eis inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 10 ml FACS-Puffer hinzu, um die Lyse zu stoppen. Filtern Sie die Mischung durch ein 70-μm-Zellsieb in ein neues 50-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Die Mischung wird bei 300 x g für 5 min bei 4 °C pelletiert. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl FACS-Puffer.</li>
</ol>3. Verdauung von Knochenspikulen
<ol><li>Die Knochenspikulen aus Schritt 1.9 vortexen und absetzen lassen. Dekantieren Sie den Überstand und belassen Sie den Knochen an der Unterseite.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Knochenspikulen in 1 ml der Knochenspikulationsaufschlussmischung (Tabelle 1).</li>
	<li>Die Röhrchen für 60 min bei 37 °C auf einen Röhrchenrotator legen.</li>
	<li>Fügen Sie 10 ml FACS-Puffer hinzu, um die enzymatische Verdauung zu stoppen. Die Mischung wird durch ein 70-μm-Zellsieb in das 50-ml-Röhrchen mit Erythrozyten-lysiertem und verdautem Knochenmark filtriert.</li>
</ol>4. Färbung
<ol><li>Die Knochenspikulen und die Knochenmarkzellsuspension vorsichtig mischen.</li>
	<li>Verwenden Sie 10 μl der Zellsuspension, um die Anzahl der lebenden Zellen auf einem Hämozytometer unter Verwendung einer 0,4%igen Färbung auf Trypanblaubasis zu zählen, wie in den veröffentlichten Protokollen27 beschrieben. Sammeln Sie 50.000 Zellen für eine ungefärbte Kontrolle aus der Zellsuspension.</li>
	<li>Die restlichen Zellen werden bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie ihn in 100 μl FACS-Puffer. HINWEIS: Antikörper können titriert werden, um die ideale Verdünnung zu bestimmen. Die Auswahl der Antikörper (Epitope und Fluorochrome) kann individuell angepasst werden.</li>
	<li>Für die Färbung mit Antikörpern gegen magnetische Depletion fügen Sie FC Block (1 μl pro 25 x 106 Zellen), CD45-APC (10 μl pro 25 x 106 Zellen) und Ter119-APC (4 μl pro 25 x 106 Zellen) hinzu (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>20 Minuten auf Eis inkubieren. Mit FACS-Puffer waschen, 50.000 Zellen (~50 μl) für die APC-gefärbte Kontrolle entnehmen, 5 Minuten bei 4 °C bei 300 x g zentrifugieren und in 100 μl FACS-Puffer resuspendieren.</li>
	<li>Für die Färbung der Zellsuspension mit Mikrokügelchen für die magnetische Depletion fügen Sie mIgG (8 μl pro 25 x 106 Zellen) und Anti-APC-Mikrokügelchen (20 μl pro 25 x 106 Zellen) hinzu (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>20 Minuten auf Eis inkubieren. Mit 10 ml FACS-Puffer waschen, bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
</ol>5. Verarmung der Probe durch magnetische Sortierung
HINWEIS: Dieser Schritt wird mit einem handelsüblichen manuellen Magnetabscheider gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Dieser Schritt kann auch mit einem automatischen Separator durchgeführt werden (siehe Materialtabelle).
<ol><li>Bereiten Sie die LD-Säule vor, indem Sie sie mit 2 ml MACs-Puffer waschen (Tabelle 1). Entsorgen Sie das Abwasser und wechseln Sie das Auffangröhrchen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie bis zu 1 x 108 Zellen in MACs-Puffer und filtern Sie sie durch ein 5-ml-Reagenzglas mit einer 35-μm-Zellsiebkappe.</li>
	<li>Stellen Sie die LD-Säule auf den Magnetabscheiderständer. Positionieren Sie ein 5-ml-Reagenzglas unter der Säule, um das Eluat aufzufangen.</li>
	<li>Die Zellsuspension wird in die vorbereitete LD-Säule gegeben. Lassen Sie die negative Fraktion in das Sammelröhrchen durchfließen. Waschen Sie die Säule zweimal mit 1 ml MACs-Puffer und sammeln Sie das Eluat im selben Röhrchen. Dies ist der negative Bruch, der in Schritt 5.6 unten verwendet wird.</li>
	<li>Nehmen Sie die LD-Säule vom Magnetabscheiderständer und stellen Sie sie auf ein neues 5-ml-Reagenzglas. Verwenden Sie eine Pipette, um 3 ml Puffer in die Säule zu geben, um positiv markierte Zellen mit dem Säulenkolben auszuspülen.</li>
	<li>Die negativen und positiven Fraktionen werden bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Resuspendieren Sie sie in 100 μl FACS-Puffer.</li>
	<li>Zählen Sie 10 μl der negativen und positiven Fraktionen mit 0,4 % Trypanblau. Die Volumina für die Osteo-Analyse/Endothel-Panel-Färbung unten basieren auf dieser Zellzahl.</li>
	<li>Verwenden Sie 50.000 lebende Zellen aus der positiven Fraktion für Durchflusszytometrie-Gating-Kontrollen.</li>
</ol>6. Osteo-Analyse/Endothel-Panel-Färbung
HINWEIS: Die Kompensation sollte nach Standard-Durchflusszytometrieprotokollen durchgeführt werden, einschließlich aller geeigneten Färbe- und Gating-Kontrollen.
<ol><li>Für die Färbung der CD45/Ter119-negativen Fraktion (1 μl jedes Antikörpers pro 1 x 106 Zellen) fügen Sie CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE und CD140a-PE-Cy5 hinzu (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>20 Minuten auf Eis inkubieren. Mit 2 ml FACS-Puffer waschen, dann bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer und eine 1:1000-Verdünnung PI für die Lebend-/Totfärbung hinzu und filtrieren Sie die Probe dann durch ein 5-ml-Reagenzglas mit einer 35-μm-Zellsiebkappe.</li>
	<li>Analysieren Sie die Zellen auf einem mehrfarbigen Durchflusszytometer.</li>
</ol>

Isolierung und Charakterisierung der Mikroumgebung des Knochenmarks bei myeloischen Neoplasien

<ol>
	<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Boulais, P. E., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+of+hematopoietic+stem+cell+niches.">Making sense of hematopoietic stem cell niches.</a> Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).</li><li>Pinho, S., Frenette, P. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+progenitor+dysfunction+induces+myelodysplasia+and+secondary+leukaemia.">Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia.</a> Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).</li><li>Frisch, B. 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Es wurden keine Interessenkonflikte deklariert.

Maus-Leukämiemodelle wurden in großem Umfang verwendet, um zellintrinsische und nischengesteuerte Signale zu identifizieren, die das Fortschreiten der aggressiven myeloischen Leukämie fördern 6,19,21. In dieser Arbeit wird ein umfassendes auf Durchflusszytometrie basierendes Protokoll zur Bestimmung der zellulären Zusammensetzung der Knochenmarkmikroumgebung in murinen Modellen von MDS und AML vorgestellt.
<p class="jov...

Die Mikroumgebung des Knochenmarks besteht aus hämatopoetischen Zellen, nicht-hämatopoetischen Stromazellen und der extrazellulären Matrix 1,2. Diese Mikroumgebung kann die Selbsterneuerung hämatopoetischer Stammzellen fördern, die Differenzierung von Abstammungslinien regulieren und das Knochengewebe strukturell und mechanisch stützen 1,2,3,4,5. Die stromale Nische umfasst Osteolineage-Zellen, Fibroblasten, Nervenzellen und Endothelzellen6, während die hämatopoetische Nische aus den lymphatischen und myeloischen Populationen besteht 1,2,3. Neben der Unterstützung normaler HSCs kann die Mikroumgebung des Knochenmarks auch eine Rolle bei der Entwicklung von hämatopoetischen Stammzellerkrankungen wie MDS und AML spielen 7,8,9,10,11. Es wurde gezeigt, dass Mutationen in Osteolinienzellen die Entwicklung von MDS, AML und anderen myeloproliferativen Neoplasien fördern 10,12,13,14.
Myelodysplastische Syndrome sind eine Gruppe präleukämischer Erkrankungen, die durch Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen entstehen. MDS ist häufig mit einer Blockade der HSZ-Differenzierung und der Produktion von dysplastischen Zellen verbunden, was häufig zu Knochenmarkversagen führen kann. MDS ist die am häufigsten diagnostizierte myeloische Neoplasie in den Vereinigten Staaten und mit einer 3-Jahres-Überlebensrate von 35 % bis 45 % verbunden15. MDS ist oft mit einem hohen Risiko für die Transformation in eine akute myeloische Leukämie verbunden. Dies kann eine tödliche Komplikation sein, da die MDS-abgeleitete AML gegen die meisten Therapien resistent ist und wahrscheinlich einen Rückfall erleidet. AML, die de novo aufgrund von Translokationen oder Mutationen im hämatopoetischen Stamm und in den Vorläuferzellen entsteht, ist häufig auch resistent gegen die Standard-Chemotherapie16,17. Da es sich bei MDS und AML in erster Linie um Erkrankungen älterer Menschen handelt, wobei die meisten im Alter von über 60 Jahren diagnostiziert werden, kommen die meisten Patienten für eine kurative Knochenmarktransplantation nicht in Frage. Es besteht daher ein erheblicher Bedarf, neue Regulatoren des Krankheitsverlaufs zu identifizieren. Da die Mikroumgebung des Knochenmarks bösartige Zellen unterstützen kann14, kann die Definition von Veränderungen in der Knochenmarknische mit dem Fortschreiten der Krankheit zur Identifizierung neuer Therapeutika führen, die darauf abzielen, den Umbau von Tumornischen zu hemmen. Es besteht daher ein erheblicher Bedarf, neue Regulatoren des Krankheitsverlaufs zu identifizieren. Zu diesem Zweck ist es von entscheidender Bedeutung, Veränderungen in den Stromazellpopulationen des Knochenmarks zu identifizieren und zu charakterisieren, die die malignen Zellen unterstützen können.
Es wurden mehrere Mausmodelle für AML und MDS entwickelt, die zur Untersuchung von Veränderungen in der Mikroumgebung des Knochenmarks während des Krankheitsbeginns und -fortschreitens verwendet werdenkönnen 6,1,19,20,21,22. Hier werden Protokolle zur Identifizierung von Veränderungen in den Knochenmark-Stromazellpopulationen unter Verwendung von murinen Modellen der retroviral induzierten AML 6,20 sowie des kommerziell erhältlichen Nup98-HoxD13 (NHD13)-Modells der Hochrisiko-MDS-zu-AML-Transformation19 beschrieben. Mäuse, denen de novo AML-Zellen transplantiert wurden, erliegen der Krankheit innerhalb von 20-30 Tagen6. Die NHD13-Mäuse entwickeln in der 15. bis 20. Woche Zytopenien und Knochenmarkdysplasie, die sich schließlich in AML umwandeln, und fast 75 % der Mäuse erliegen der Krankheit nach etwa 32 Wochen. Um die mikroumgebungsspezifischen Populationen des murinen Modells des Knochenmarks zu analysieren, werden Knochen entnommen, Knochenmark und Knochenspikulen mittels enzymatischer Verdauung verdaut und die Zellen dann durch magnetische Sortierung für CD45-/Ter119-nicht-hämatopoetische Populationen angereichert. Obwohl ähnliche Analysen bereits beschrieben wurden 11,13,22,23,24,25, konzentrieren sie sich oft entweder auf das Knochenmark oder den Knochen und beziehen Zellen aus beiden Quellen nicht in ihre Analysen ein. Die kombinierte Charakterisierung dieser Populationen in Verbindung mit Genexpressionsanalysen kann ein umfassendes Verständnis dafür liefern, wie die zelluläre hämatopoetische Mikroumgebung die Initiierung und das Fortschreiten der Krankheit unterstützt (Abbildung 1). Während sich das unten beschriebene Protokoll auf ein retroviral induziertes AML-Modell und ein genetisches MDS-Modell konzentriert, können diese Strategien leicht angepasst werden, um Veränderungen in der Knochenmarknische jedes Mausmodells von Interesse zu untersuchen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL pipette Tips&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>AVANT</td>
			<td>L211511-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L pipette Tips</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-140RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>Globe scientific</td>
			<td>1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Vacuum Filtration Flask</td>
			<td>NEST</td>
			<td>344021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10026-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Aspirating Pipette</td>
			<td>NEST</td>
			<td>325011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette Tips</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-150-RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>Globe scientific</td>
			<td>1780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>Globe scientific</td>
			<td>1740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube&#160; 12 x 75 mm style</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi&#160;</td>
			<td>130-090-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>4425745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>0.5 mg/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>66.000 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>404-5981</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide Gas Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25-0311-82</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17-0451-82</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 70 &#181;m Nylon&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-63100-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>7415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Mini Centrifuge</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>6770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Stripettor Ultra Pipet Controller</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>117105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10x</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience 1x RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors - sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foundation B Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>900-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson&#160;PIPETMAN L Pipette Starter Kits</td>
			<td>FisherScientific&#160;</td>
			<td>F167370G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) 10x</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-671-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>BINDER</td>
			<td>C150-UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td>K222101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-425-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSE Vortex Mixer</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>6775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRII/Fortessa/Symphony A1</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>647800L6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MULTI STAND&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACsmix Tube Rotator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIgG</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>18765-10mg</td>
			<td>2 mg/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td>010505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>104106</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135920</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastipak 3 mL Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS&#160; Separator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>75009521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17-5921-82</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying bone marrow microenvironmental populations in myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia

Die Mikroumgebung des Knochenmarks besteht aus verschiedenen Zellpopulationen, wie mesenchymalen Stromazellen, Endothelzellen, Osteostammzellen und Fibroblasten, die hämatopoetische Stammzellen (HSCs) unterstützen. Neben der Unterstützung normaler HSCs spielt die Mikroumgebung des Knochenmarks auch eine Rolle bei der Entwicklung von hämatopoetischen Stammzellerkrankungen wie myelodysplastischen Syndromen (MDS) und akuter myeloischer Leukämie (AML). MDS-assoziierte Mutationen in HSCs führen zu einer Blockade der Differenzierung und zu einem fortschreitenden Knochenmarkversagen, insbesondere bei älteren Menschen. MDS kann oft zu einer therapieresistenten AML führen, einer Erkrankung, die durch eine schnelle Anhäufung unreifer myeloischer Blasten gekennzeichnet ist. Es ist bekannt, dass die Mikroumgebung des Knochenmarks bei Patienten mit diesen myeloischen Neoplasien verändert ist. In dieser Arbeit wird ein umfassendes Protokoll zur Isolierung und phänotypischen Charakterisierung von Mikroumgebungszellen des Knochenmarks aus murinen Modellen des myelodysplastischen Syndroms und der akuten myeloischen Leukämie beschrieben. Die Isolierung und Charakterisierung von Veränderungen in den Nischenpopulationen des Knochenmarks kann dazu beitragen, ihre Rolle bei der Initiierung und dem Fortschreiten der Krankheit zu bestimmen und kann zur Entwicklung neuartiger Therapeutika führen, die auf krebsfördernde Veränderungen in den Knochenmarkstromapopulationen abzielen.

The bone marrow microenvironment consists of hematopoietic cells, non-hematopoietic stromal cells, and the extracellular matrix1,2. This microenvironment can promote hematopoietic stem cell self-renewal, regulate lineage differentiation, and provide structural and mechanical support to the bone tissue1,2,3,4,5. The stromal niche includes osteolineage cells, fibroblasts, nerve cells, and endothelial cells6, while the hematopoietic niche consists of the lymphoid and myeloid populations1,2,3. In addition to supporting normal HSCs, the bone marrow microenvironment can also play a role in the development of hematopoietic stem cell disorders such as MDS and AML7,8,9,10,11. Mutations in osteolineage cells have been shown to promote the development of MDS, AML, and other myeloproliferative neoplasms10,12,13,14.
Myelodysplastic syndromes are a group of pre-leukemic disorders that arise from mutations in hematopoietic stem cells. MDS is frequently associated with a block in HSC differentiation and the production of dysplastic cells, which can often lead to bone marrow failure. MDS is the most commonly diagnosed myeloid neoplasm in the United States and is associated with a 3-year survival rate of 35%-45%15. MDS is often associated with a high risk of transformation to acute myeloid leukemia. This can be a fatal complication, as MDS-derived AML is resistant to most therapies and likely to relapse. AML that arises de novo due to translocations or mutations in hematopoietic stem and progenitors is also often resistant to standard chemotherapy16,17. Since MDS and AML are primarily diseases of the elderly, with the majority diagnosed over the age of 60 years, most patients are ineligible for curative bone marrow transplants. There is, thus, a significant need to identify novel regulators of disease progression. Since the bone marrow microenvironment can provide support for malignant cells14, defining changes in the bone marrow niche with disease progression may lead to the identification of novel therapeutics aimed at inhibiting tumor niche remodeling. There is, therefore, a significant need to identify novel regulators of disease progression. To this end, it is critical to identify and characterize changes in the bone marrow stromal cell populations that may provide support for the malignant cells.
Several murine models of AML and MDS have been generated and can be used to study changes in the bone marrow microenvironment during disease initiation and progression6,1,19,20,21,22. Here, protocols to identify changes in the bone marrow stromal cell populations using murine models of retrovirally induced AML6,20, as well as the commercially available Nup98-HoxD13 (NHD13) model of high-risk MDS to AML transformation19, are described. Mice transplanted with de novo AML cells succumb to the disease in 20-30 days6. The NHD13 mice develop cytopenias and bone marrow dysplasia around 15-20 weeks, which eventually transforms into AML, and nearly 75% of the mice succumb to the disease around 32 weeks. To analyze the murine model bone marrow microenvironment populations, bones are harvested, bone marrow and bone spicules are digested using enzymatic digestion, and the cells are then enriched for CD45-/Ter119- non-hematopoietic populations by magnetic sorting. While similar analyses have been previously described11,13,22,23,24,25, they often focus on either the bone marrow or the bone and do not incorporate cells from both sources in their analyses. The combined characterization of these populations, in conjunction with gene expression analyses, can provide a comprehensive understanding of how the cellular hematopoietic microenvironment provides support for disease initiation and progression (Figure 1). While the protocol described below focuses on retrovirally induced AML model and a genetic MDS model, these strategies can be easily adapted to study changes in the bone marrow niche of any murine model of interest.

Autor im Rampenlicht: Analyse der Mikroumgebung des Knochenmarks bei hämatologischen Malignomen von Mäusen 

Identifizierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen beim myelodysplastischen Syndrom und der akuten myeloischen Leukämie

Our research aims to explore how the bone marrow's changing environment influences tumor growth. We developed a flow cytometry protocol to analyze the non-immune cells in bone marrow and bone tissues, focusing on murine hematological malignancies. This method is adaptable for studying bone marrow in various murine models.Our study focuses on isolating and identifying alterations in bone marrow stromal populations during cancer progression. Understanding their impact on disease onset and advancement could pave the way for new treatments that target these cancer-facilitating changes in the bone marrow stromal cells. Our protocol uniquely combines mechanical and enzymatic digestions, magnetic depletions, and flow cytometry to delineate the bone marrow microenvironment cellular makeup.It stands out by employing magnetic separation and incorporating cells from both bone and marrow, offering a more comprehensive representation of this microenvironment.

Dieser Artikel beschreibt eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Analyse von Mikroumgebungspopulationen des Knochenmarks, wie z. B. der endothelialen und mesenchymalen Stromazellen, aus MDS- und Leukämie-Mausmodellen (Abbildung 1). Abbildung 2 zeigt die Gating-Strategie zur Detektion von Populationen von Interesse, beginnend mit der Selektion der Zellen (P1) in der verdauten und CD45/Ter119-abgereicherten Fraktion durch Vorwärts- und Seitenstreup...

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Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen aus murinen Modellen myelodysplastischer Syndrome und akuter myeloischer Leukämie vorgestellt. Mit dieser Technik werden Veränderungen in der nicht-hämatopoetischen Knochenmarknische, einschließlich der endothelialen und mesenchymalen Stromazellen, mit Fortschreiten der Erkrankung identifiziert.

The bone marrow microenvironment consists of distinct cell populations, such as mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteolineage cells, and ...

Unsere Forschung zielt darauf ab, zu erforschen, wie die sich verändernde Umgebung des Knochenmarks das Tumorwachstum beeinflusst. Wir haben ein Durchflusszytometrie-Protokoll entwickelt, um die nicht-immunen Zellen im Knochenmark und im Knochengewebe zu analysieren, wobei wir uns auf hämatologische Malignome der Maus konzentrieren. Diese Methode ist für die Untersuchung des Knochenmarks in verschiedenen Mausmodellen geeignet.Unsere Studie konzentriert sich auf die Isolierung und Identifizierung von Veränderungen in den Stromapopulationen des Knochenmarks während des Fortschreitens der Krebserkrankung. Das Verständnis ihrer Auswirkungen auf den Ausbruch und das Fortschreiten der Krankheit könnte den Weg für neue Behandlungen ebnen, die auf diese krebsfördernden Veränderungen in den Stromazellen des Knochenmarks abzielen. Unser Protokoll kombiniert auf einzigartige Weise mechanische und enzymatische Verdauungen, magnetische Depletion und Durchflusszytometrie, um die zelluläre Zusammensetzung der Mikroumgebung des Knochenmarks zu beschreiben.Es zeichnet sich durch die magnetische Trennung und die Einbeziehung von Zellen aus Knochen und Knochenmark aus und bietet eine umfassendere Darstellung dieser Mikroumgebung.

identifying-bone-marrow-microenvironmental-populations

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Identifying Bone Marrow Microenvironmental Populations in Myelodysplastic Syndrome and Acute Myeloid Leukemia

797 Aufrufe.  University of Rochester Medical Center. Unsere Forschung zielt darauf ab, zu erforschen, wie die sich verändernde Umgebung des Knochenmarks das Tumorwachstum beeinflusst. Wir haben ein Durchflusszytometrie-Protokoll entwickelt, um die nicht-immunen Zellen im Knochenmark und im Knochengewebe zu analysieren, wobei wir uns auf hämatologische Malignome der Maus konzentrieren. Diese Methode ist für die Untersuchung des Knochenmarks in verschiedenen Mausmodellen geeignet.Unsere Studie konzentriert sich auf die Isolierung und Id...

Serie: Autor im Rampenlicht: Analyse der Mikroumgebung des Knochenmarks bei hämatologischen Malignomen von Mäusen 

The bone marrow microenvironment consists of distinct cell populations, such as mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteolineage cells, and fibroblasts, which provide support for hematopoietic stem cells (HSCs). In addition to supporting normal HSCs, the bone marrow microenvironment also plays a role in the development of hematopoietic stem cell disorders, such as myelodysplastic syndromes (MDS) and acute myeloid leukemia (AML). MDS-associated mutations in HSCs lead to a block in differentiation and progressive bone marrow failure, especially in the elderly. MDS can often progress to therapy-resistant AML, a disease characterized by a rapid accumulation of immature myeloid blasts. The bone marrow microenvironment is known to be altered in patients with these myeloid neoplasms. Here, a comprehensive protocol to isolate and phenotypically characterize bone marrow microenvironmental cells from murine models of myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia is described. Isolating and characterizing changes in the bone marrow niche populations can help determine their role in disease initiation and progression and may lead to the development of novel therapeutics targeting cancer-promoting alterations in the bone marrow stromal populations.

Here a detailed protocol to isolate and characterize bone marrow microenvironmental populations from murine models of myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia is presented. This technique identifies changes in the non-hematopoietic bone marrow niche, including the endothelial and mesenchymal stromal cells, with disease progression.

Forschung

Krebsforschung

Murine Bone Marrow Harvest and Isolation for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment 

To begin, remove the tissue from the bones of the euthanized dissected mouse. Place the cleaned bones into a new six-well plate containing FACS buffer placed on ice. Transfer the bones into a mortar with two to five milliliters of FACS buffer.Grind the bones in a circular motion until the bone marrow is released. With a three milliliter syringe, pull up and flush down the bone marrow to homogenize it. Pull the homogenate into another syringe, then filter it through a 70 micrometer cell strainer into a 50 milliliter tube.Rinse the tissue chunks from their filter back into the mortar with FACS buffer before homogenizing a second time. Filter the rinsed tissue as before. Next, rinse the remaining bone spicules back into the mortar with FACS buffer.Then flush the pieces into a 15 milliliter tube to ensure maximum yield. To digest the bone marrow, first centrifuge it at 300 G for five minutes at four degrees Celsius. Resuspend the bone marrow pellet in two milliliters of digestion mixture.Transfer the mixture to a 15 milliliter tube. Then incubate it at 37 degrees Celsius for 45 minutes on a rotator. Now, add 10 milliliters of FACS buffer to stop the enzymatic digestion.Filter the mixture through a 70 micrometer cell strainer into a 50 milliliter tube. Centrifuge the suspension at 400 G for seven minutes at four degrees Celsius. Resuspend the pellet in one milliliter of RBC lysis buffer.Next, add 10 milliliters of FACS buffer to halt the lysis. Then filter the mixture as before into a 50 milliliter tube. Lastly, centrifuge the mixture at 300 G for five minutes at four degrees celsius.After discarding the supernatant, resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. For the digestion of bone spicules, first, vortex the bone spicules. Decant the supernatant and retain the bones at the bottom.Next, resuspend the spicules in one milliliter of the bone spicule digestion mixture. Incubate the tube on a rotator for 60 minutes at 37 degrees Celsius. Finally, stop the digestion with 10 milliliters of FACS buffer.Filter the mixture into the 50 milliliter tube containing RBC lysed and digested bone marrow.

Knochenmarkgewinnung und -isolierung von Mäusen zur Charakterisierung der Mikroumgebung der myeloischen Leukämie 

Murine Bone Marrow Staining for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment

To begin, mix the isolated murine bone marrow suspension with the bone spicule suspension. Pipette 10 microliters of the cell suspension onto a hemocytometer for counting. Centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees Celsius.Then resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. To stain the cells with antibodies for magnetic depletion, add FC block, CD45 APC, and TER-119 APC. Then wash the cell suspension with FACS buffer.After centrifuging the remaining mixture, resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. To stain the cell suspension with microbeads for magnetic depletion, add mouse IgG and anti-APC microbeads. Incubate the mixture on ice for 20 minutes.Wash the LD column with two milliliters of MACS buffer. Resuspend the cells in the buffer, then filter it through a five milliliter test tube with a 35 micrometer cell strainer cap. Next, set the LD column on the magnetic separator stand and place a five milliliter test tube under the column to collect the eluted material.Pipette the cell suspension into the LD column and collect the negative fraction flow through in the test tube. Wash the column two times with one milliliter of MACS buffer and collect the eluent material in the same tube. Place the LD column over a new five milliliter test tube.With a pipette, dispense three milliliters of buffer into the column, then flush out the positively labeled cells into a five milliliter test tube. Centrifuge both the positive and negative fractions, then resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. To stain the CD45 TER-119 negative fraction add one microliter of each antibody for every 10 to the sixth cells.Place the suspension on ice for 20 minutes. Then wash the suspension with two milliliters of FACS buffer before centrifuging. Add one milliliter of the buffer to the pellet and pipette propidium iodide for live cell staining.Finally, filter the sample through a 35 micrometer cell strainer into a five milliliter test tube before analyzing the cells on a multicolor flow cytometer. Arteriolar endothelial cells significantly expanded in the acute myeloid leukemia microenvironment with a concomitant loss in the sinusoidal endothelial populations. A small expansion in the mesenchymal stromal cells were seen at eight weeks of age.