Bereiten Sie zunächst klare Nierengewebeproben vor. Schalten Sie dann das konfokale Mikroskop ein, indem Sie zuerst die Laserleistung aktivieren und dann den konfokalen Steuerschalter betätigen. Starten Sie als Nächstes den Computer, schalten Sie das Mikroskop ein und starten Sie die konfokale Hardware.
Starten Sie nach dem Ausführen des Selbsttests die konfokale Software. Wählen Sie das entsprechende Objektiv aus. Entnehmen Sie die Probe aus dem kubischen R-Reagenz und geben Sie sie in die konfokale Schale.
Decken Sie es ab, um zu verhindern, dass das kubische R-Reagenz austrocknet. Verschieben Sie die Probe in die Mitte des Sichtfelds und passen Sie den Fokus an, bis die Probe scharf ist. Für die 3D-Rekonstruktion passen Sie die Zoomebene in eine Richtung an, bis keine Fluoreszenz mehr sichtbar ist, und definieren Sie diese Position als oben.
Stellen Sie dann die Zoomebene in die entgegengesetzte Richtung ein, bis keine Fluoreszenz mehr sichtbar ist, und definieren Sie diese Position als unten. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Ausführen" in der unteren rechten Ecke des Dialogfelds, um den Scanvorgang zu starten. Für die Rekonstruktion großer Bilder positionieren Sie das Sichtfeld in der Mitte der Probe und legen Sie dieses als Mittelpunkt fest.
Wählen Sie ein Sichtfeld von zwei mal zwei Pixeln. Wählen Sie in der ND-Multifunktionsschnittstelle den Z-Stapel aus, um große Bilder zu rekonstruieren. Passen Sie die verschiedenen Optionen im Bedienfeld nach Bedarf an und drücken Sie die Schaltfläche "Ausführen", um den Scanvorgang zu starten.
Kleben Sie die transparente Niere mit Kleber auf den Probenfixieradapter und warten Sie, bis die Niere sicher befestigt ist. Tauchen Sie dann die Niere in den Probenbehälter ein und schieben Sie den Probenbehälter in das Mikroskopsystem. Verschließen Sie die Luke.
Stellen Sie die Probe in der Lokalisierungsschnittstelle auf eine geeignete Beobachtungsposition ein. Wechseln Sie zur Erfassungsschnittstelle und stellen Sie den optischen Pfad ein. Wählen Sie den 488-Nanometer-Laser.
Wählen Sie den Lichtstrahlfilter 405-488-561-640 und stellen Sie dann den optischen Splitting-Filterblock auf SBS LP 490 ein. Wählen Sie Kamera zwei aus und ändern Sie die Pseudofarbe in Grün. Geben Sie den linken und dann den rechten Z-Offset ein, den Sie aus dem Kanal-Untermenü erhalten haben.
Wählen Sie den kleinsten Zoom und passen Sie ihn für optische Klarheit an. Ermitteln Sie die XY-Grenze und den Z-Bereich für das gesamte Organ. Modulieren Sie dann die Laserintensität und die Belichtungszeit auf weniger als 10 Millisekunden.
Initiieren Sie den Prozess, indem Sie auf Experiment starten klicken. Wenn das Gewebe übermäßig groß ist, kombinieren Sie zwei oder mehr Bilder mit der Mikroskopie-Software mit dem Bild-Stitching. Öffnen Sie die erfasste Datei und wählen Sie Verarbeitung aus.
Dann Methode und Stitching, gefolgt von Methodenparametern. Klicken Sie auf "Anwenden", um das Zusammenfügen von Bildern abzuschließen. Intravaskulär injizierter Fitindex-Strang wurde zur Markierung der Glomeruli verwendet.
In der gereinigten Niere konnten die Glomeruli mittels Lichtblattmikroskopie oder konfokaler Mikroskopie deutlich beobachtet werden.
