Säen Sie zunächst 200 Mikroliter Volumen von 10.000 hepatozellulären Karzinomzellen in eine 96-Well-Platte mit DMEM und 10% FBS. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator unter 5% Kohlendioxid. Ersetzen Sie am nächsten Tag die Nährmedien und behandeln Sie die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Wasserstoffperoxid und Menadion.
Lösen Sie fünf Milligramm DHE in einem Milliliter DMSO. Für die Arbeitslösung wird ein 100-Mikromol-Aliquot mit vorgewärmtem DMEM-Medium auf eine Konzentration von 10 Mikromol verdünnt. Wirbeln Sie die Arbeitsfarblösung 5 bis 10 Sekunden lang ein, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten.
Entfernen Sie nun das Testmedium aus jeder Vertiefung, bevor Sie die Karzinomzellen aufstellen. Waschen Sie dann jede Mulde vorsichtig mit PBS. Pipettieren Sie 100 Mikroliter der Arbeitsfarblösung in jede Vertiefung.
Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie das DHE-haltige Medium aus jeder Vertiefung. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um jede Vertiefung dreimal mit PBS zu waschen.
Pipettieren Sie nun 200 Mikroliter PBS mit dem Kernfärbefarbstoff Hoechst 33342 in jede Vertiefung. Nach der Inkubation wird die Platte auf eine High-Content-Screening-Plattform überführt. Starten Sie die High-Content-Screening-Software Cellomics CX7.
Kalibrieren Sie die Imaging-Plattform gemäß den Herstellerangaben. Öffnen Sie die für die Plattenmarke spezifischen Systemparameter in der Gerätedatenbank. Legen Sie anschließend die Platte mit den Proben vorsichtig auf den beheizten Tisch des Bildgebungssystems.
Stellen Sie sicher, dass die Platte sicher positioniert und in der richtigen Ausrichtung ist. Drücken Sie dann vorsichtig auf die Mikroplatte, um sicherzustellen, dass sie flach auf dem Tisch anliegt. Sobald die Platte richtig positioniert ist, halten Sie die Strg-Taste gedrückt.
Klicken Sie dann auf Strg und OK, um das Dialogfeld Plattenladen/-entladen zu öffnen. Um die Bildgebungsparameter auszuwählen, öffnen Sie den Target-Aktivierungsmodus in der Cellomics BioApplications-Oberfläche. Erstellen Sie ein neues Protokoll für die Zweikanal-Datenerfassung, das mit der Kernfärbung und der DHE-Fluoreszenzsonde kompatibel ist.
Geben Sie als Nächstes die erforderlichen Objektive für die Bildaufnahme an und wählen Sie dann die entsprechende Vergrößerung. Geben Sie nun die Belichtungszeit, die Kamerabiegung und das Z-Stapel-Intervall an. Sobald die Bildgebungsparameter eingestellt sind, identifizieren Sie das primäre Tracking-Objekt von Interesse mithilfe der verschiedenen Algorithmen im Gerät.
Nachdem Sie das identifizierte Objekt segmentiert haben, validieren Sie das primäre Objekt basierend auf den spezifischen Größen-, Form- und Intensitätsparametern, die für jeden Zellentyp eindeutig sind. Definieren Sie den interessierenden Bereich um das Objekt und legen Sie einen 20-Mikrometer-Kreis um das Objekt fest. Klicken Sie auf die Registerkarte Populationscharakterisierung und legen Sie dann das Scanlimit auf 1000 Zellen pro Well mit mindestens 10 Objekten pro Feld fest.
Klicken Sie nun auf Launch View, um jede Well-Platte zu scannen. Starten Sie dann die Ansichtsanalysesoftware und exportieren Sie die quantitativen Datenparameter in einem CSV-Format für zusätzliche Analysen. Die Peroxidexposition führte zu einer statistisch signifikanten Zunahme der ROS-induzierten Fluoreszenz über alle Zelllinien in dosisabhängiger Weise.
Mit Menadion zeigten die JHH-4-Zellen eine dosisabhängige Zunahme der Fluoreszenzintensität. Der signifikante Unterschied in der Fluoreszenz wurde jedoch nur bei höheren Konzentrationen in den beiden anderen Zelllinien beobachtet.
