Nehmen Sie zunächst die Oberschenkelknochen, das Schienbein, das Becken und den Oberarmknochen, die von einer Maus isoliert wurden. Schneide mit einem Skalpell durch die Wachstumsfugen der langen Knochen und entferne die Epiphyse. Legen Sie es in eine 10-Zentimeter-Schale mit M199 medium plus 2 % FBS auf Eis.
Verwenden Sie als Nächstes eine 28-Gauge-Nadel und eine 10-Milliliter-Spritze, die mit M199-Medium plus 2 % FBS gefüllt ist, um das Mark in ein 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis zu spülen. Legen Sie den gespülten Knochen in die Schale mit der Epiphyse. Lassen Sie die 15-Milliliter-Tube aufrecht auf Eis, bis sich das Mark abgesetzt hat.
Entfernen Sie dann das M199-Medium plus 2%FBS. Geben Sie vier Milliliter des B&M-Dissoziationscocktails in das 15-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie es in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Nach der Inkubation wird der Überstand aufgefangen und durch ein 70-Mikrometer-Zellensieb in ein kaltes 50-Milliliter-Röhrchen filtriert. Geben Sie zwei Milliliter frischen B&M-Dissoziationscocktail in das restliche Knochenmarkpellet und geben Sie es wieder in das Wasserbad.
Pipettieren Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette kräftig alle verbleibenden Knochenmarkstücke. Sammeln Sie die gesamte Zellsuspension im selben Röhrchen wie zuvor. Geben Sie 20 Milliliter M199-Medium mit 0,5 % BSA und zwei Millimolar EDTA zur Zellsuspension.
Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern PBS mit einem 0,5%igen BSA und Biotin-Antikörpern. Inkubieren Sie auf einem Orbitalschüttler für 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.
Als nächstes wirbeln Sie die magnetischen Kügelchen gründlich ein. Geben Sie 25 Mikroliter der Kügelchen in das Röhrchen und inkubieren Sie erneut auf dem Orbitalschüttler. Legen Sie das Röhrchen für zwei bis drei Minuten in einen passenden Magneten und sammeln Sie den Überstand in einem frischen Röhrchen.
Brechen Sie die Knochen in der 10-Zentimeter-Schale mit dem flachen Verschlussende eines 50-Milliliter-Röhrchens in kleinere Stücke. Filtrieren Sie den Überstand durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb, um Knochenfragmente zu isolieren. Schneiden Sie die Knochenfragmente mit einer Schere in das Zellsieb.
Legen Sie den Filter mit den Knochenfragmenten auf ein 50-Milliliter-Röhrchen und öffnen Sie den Filter mit dem Skalpell. Übertragen Sie die Knochenfraktion mit einer Pinzette auf fünf Milliliter murinen B&M-Dissoziationsmix. Legen Sie dann den Schlauch horizontal in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad mit 120 U/min und schütteln Sie ihn 30 Minuten lang.
Nach dem Aufschluss fügen Sie 25 Milliliter M199-Medium mit 0,5 % BSA und zwei Millimolar EDTA hinzu. Filtrieren Sie den Überstand mit Stromazellen durch ein 70-Mikron-Zellsieb in ein kaltes 50-Milliliter-Röhrchen.
