Wir danken Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa und Markus Manz für wertvolle Ratschläge. Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds, Krebsliga Schweiz und Tessiner Fondazione per la ricerca sul Cancro finanziert.

1. Vorbereitung der Zellsuspension aus dem Knochenmark <ol><li> Euthanize die Maus und platzieren Sie das Tier in einer Pfanne Edelstahl und Spray 70% Ethanol auf seinen Bauch und Rücken. Sammeln Sie Oberschenkel und Schienbein von Hinterbeinen und Wirbelsäule. </li><li> Exakt entfernen Sie alle Rückstände aus der Weichteile der Wirbelsäule mit einer scharfen Spitze Schere und Beine aus Knochen mit einer Gaze. Shop Knochen in einem 50-ml-Falcon-Röhrchen mit 30 ml RPMI-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), mit 50 uM β-Mercaptoethanol, 100 pM MEM nicht-essentielle Aminosäuren ergänzt, 1 mM MEM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, 100 ug / ml Streptomycin und 100 U / ml Penicillin. </li><li> Bedecken Sie den Boden einer zuvor sterilisierten Mörser mit Sterilfilter. </li><li> Übertragen Sie die Knochen in den Mörser und bedecken Sie sie mit einer Schicht von Filtern, um eine Reibungsfläche zu montieren. </li><li> Bereiten Sie eine 50-ml-Falcon-Röhrchen mit einem Falcon-Filter zur Verfügung gestellt. </li><li> Smash die Knochenmit Hilfe eines Stößels, bis eine homogene Zellsuspension. </li><li> Die Suspension in das Rohr. </li><li> Fügen Sie dem Mörtel 5 ml frisches RPMI Vollmedium zu waschen und zu ernten, die übrigen Zellen. </li><li> Wiederholen Sie die letzten beiden Punkte, bis die Knochen homogenisierte klar erscheinen. </li><li> Übertragen und Filtern in ein neues Röhrchen der Zellsuspension, um die verbleibende Gewebe Ablagerungen zu beseitigen. </li><li> Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 5 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen. Achten Sie darauf, nicht auf das Zellpellet zu stören. </li></ol> 2. Phänotypische Analyse <ol><li> Resuspendieren und waschen Sie die Zellen der einzelnen Mäuse in 15 ml PBS und 2% FBS. </li><li> Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 5 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen. Stellen Sie sicher nicht, um das Pellet zu stören. </li><li> Hängen Sie das Pellet in 5 ml PBS und 2% FBS und Zählen von Zellen. </li><li> Transfer 1 × 10 6 Zellen / Well in einer 96 Vertiefungen mit rundem BodenPlatte. </li><li> Die Platte bei 1.500 rpm für 5 min. </li><li> Bereiten Sie eine Mischung aus mAbs gegen folgende Oberflächenmarker gerichtet. Verdünnen, wie in PBS und 2% FBS, um die Zellen zu färben. <ul type="disc"><li> CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, TER119, NK1.1 konjugiert PE-Cy5 1:200 </li><li> c-Kit konjugiert APC 1:100 </li><li> SCA1 an Biotin konjugiert 1.50 </li><li> CD34 konjugiert mit FITC 01.50 </li><li> FcyR konjugiert mit PE 1:100 </li><li> IL-7R, konjugiert an PE-Cy7 1:100 </li></ul></li><li> Überstand verwerfen und 50 ul von mAk-Mix in jede Vertiefung. Distanziere in einzelne Zellen durch Pipettieren. </li><li> Inkubieren Zellen für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit 150 ul PBS und 2% FBS. </li><li> Die Platte bei 1.500 rpm für 5 min und den Überstand verwerfen durch Umdrehen der Platte. </li><li> Verdünnte Streptavidin in PBS und 2% FBS wie angegeben, um die Zellen zu färben. <ul type="disc"><li> Streptavidin konjugiertegated zu APC-Cy7 1:300 </li></ul></li><li> Dann werden 50 ul der Lösung in jede Vertiefung. Distanziere in einzelne Zell-Suspension durch Pipettieren. </li><li> Inkubieren Zellen für 10 min im Dunkeln bei 4 ° C </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit 150 ul PBS und 2% FBS. </li><li> Die Platte bei 1.500 rpm für 5 min und den Überstand verwerfen. </li><li> Die Zellen in 100 ul PBS und 2% FBS. </li><li> Erwerben Proben bei FACS. </li></ol> 3. Magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen <ol><li> Planen einer Pufferlösung mit PBS, pH 7,2, 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA. </li><li> Das Zellpellet mit Knochen Zucchini aus mindestens 10 Mäusen in 1 ml Pufferlösung, die c-Kit-mAb, konjugiert an APC abgeleitet 1:50 verdünnt. </li><li> Inkubieren Zellen für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C </li><li> Wasche zweimal die Zellen mit 40 ml Pufferlösung. </li><li> Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 5 min und entfernen Sie vorsichtig ter Überstände durch Absaugen. Stellen Sie sicher nicht, um das Pellet zu stören. </li><li> Zellpellet resuspendieren und 50 ul Anti-APC MicroBeads für jeden eingeschläfert Maus direkt an den Pellets. </li><li> Gut mischen und inkubieren für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C </li><li> Waschen der Zellen durch Zugabe von 40 ml Pufferlösung und Zentrifuge bei 1.500 rpm für 5 min. Absaugen des Überstandes. </li><li> Resuspendieren Zellpellet in Vielfachen von 4 ml Pufferlösung alle drei Mäusen eingeschläfert werden. </li><li> Platz MACS LS Spalten in dem Magnetfeld eines geeigneten MACS Separator. Verwenden Sie 1 Spalte alle drei Mäuse eingeschläfert werden. </li><li> Planen Spalten durch Spülen mit 4 ml Pufferlösung. </li><li> Anwenden Zellsuspension auf die Säulen. </li><li> Sammle unmarkierten Zellen, die hindurchgehen und Waschkolonne mit 4 ml Pufferlösung. Führen Waschschritte durch Zugabe von 4 ml Pufferlösung dreimal. Fügen Sie neue Puffer, wenn die Spalte Reservoir geleert wird. </li><li> Entfernen von Spalten aus dem Abscheider und place jeweils eine auf der 15-ml-Falcon-Tubes. </li><li> Pipette 4 ml Puffer-Lösung auf jede Spalte. Unmittelbar spülen die magnetisch markierte Zellen, indem Sie den Kolben in die Spalte. </li><li> Die Röhrchen bei 1.500 rpm für 5 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen. </li><li> Resuspendieren jedes Pellet mit 1 ml Pufferlösung und Pellets Gruppe in einem einzigen 15 ml Falcon Röhrchen. </li></ol> 4. Sortieren von hämatopoetischen Stammzellen und Lineage festgelegte Vorläuferzellen <ol><li> Bereiten Sie eine Mischung aus mAbs gegen folgende Oberflächenmarker gerichtet. Verdünnen, wie in 500 ul PBS und 2% FBS, um die Zellen zu färben. <ul type="disc"><li> CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, TER119, NK1.1 konjugiert PE-Cy5 1:200 </li><li> c-Kit konjugiert APC 1:100 </li><li> Sca-1 an Biotin konjugiert 1.50 </li><li> CD34 konjugiert mit FITC 01.50 </li><li> FcyR konjugiert mit PE 1:100 </li></ul></li><li> Das Röhrchen aus dem früs Abschnitt bei 1.500 rpm für 5 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen. </li><li> Fügen Sie die mAbs Mischung zum Pellet. Distanziere in einzelne Zell-Suspension durch Pipettieren. </li><li> Inkubieren Zellen für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C </li><li> Wasche zweimal die Zellen mit PBS 14mL und 2% FBS. </li><li> Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 5 min und den Überstand verwerfen. </li><li> Verdünnte Streptavidin, wie in 500 ul PBS und 2% FBS, um die Zellen zu färben. <ul type="disc"><li> Streptavidin konjugiert mit APC-Cy7 1:300 </li></ul></li><li> Fügen Sie die Lösung in das Röhrchen. Distanziere in einzelne Zell-Suspension durch Pipettieren. </li><li> Inkubieren Zellen für 10 min im Dunkeln bei 4 ° C </li><li> Wasche zweimal die Zellen mit 14 ml PBS und 2% FBS. </li><li> Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 5 min und den Überstand verwerfen. </li><li> Die Zellen in 500 ul PBS und 2% FBS. </li><li> Übertragen und Filtern der Zellsuspension in einem neuen 5 ml Tube, um Eliminate zelluläre Aggregate, die mit der Sortier-Verfahren stören können. </li><li> 5 l der 7-AAD (verwenden Sie es verdünnt 1:100) zur Zellsuspension, um 7-AAD + toten Zellen aus den sortierten Populationen auszuschließen. </li><li> Sortieren Zellen mit einem BD FACSAria nach folgenden Phänotypen: <ul type="disc"><li> LKS-Zellen: LIN - c-Kit + Sca-1 + </li><li> LT-HSK: LKS CD34 - </li><li> ST-HSK: LKS CD34 + </li><li> GVP: LIN - c-Kit + Sca-1 niedriger FcyR hohe CD34 + </li><li> Abgeordneten: lin - c-Kit + Sca-1 niedriger FcyR niedrigen CD34 - </li><li> CMPs: LIN - c-Kit + Sca-1 niedriger FcyR niedrigen CD34 + </li></ul></li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 zeigt ein Beispiel des elektronischen Gating Verfahren zuPunktzahl gemeinsamen lymphoiden Vorläuferzellen (CLP) als Lin - / c-Kit lo / Interleukin (IL)-7R + Zellen; Lin - / c-Kit + / Sca-1 + (LKS) und Lin - / c-Kit + / SCA -1 lo (c-Kit +)-Zellen, aus dem c-Kit + Tor, sind gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen (CMPs) als FcyR lo CD34 +-Zellen, Granulozyten / Monozyten-Vorläuferzellen (GVP) als FcyR Hallo CD34 +-Zellen und Megakaryozyten / identifiziert Erythrozyten-Vorläuferzellen (MdEP) als FcyR lo CD34 - Zellen; von der LKS-Tor, LT-und ST-HSC HSC werden als CD34 identifiziert - und CD34 +-Zellen. Das Knochenmark Zellsuspension kann für c-Kit +-Zellen mit magnetischen Beads (Abb. 2) angereichert werden, LT-und ST-HSC HSC kann dann nach CD34 Expression sowie andere Vorläuferzellen nach der oben beschriebenen Phänotyp sortiert werden. HSK können ana sein<html> lysiert im Live-Imaging-konfokale Mikroskopie, wie in Abbildung 4, wo CD34 gezeigt - Zellen mit dem Nukleotid-bindenden Verbindung Quinacrin 11 sowie nukleare rot (DRAQ5) gefärbt wurden. In HSCs, aber nicht GVP sind Quinacrin-positive Vesikel im Zytoplasma sichtbar 12. Darüber hinaus können sortiert HSK in verschiedene Experimente verwendet werden, wie in 5, die den Anstieg der zytosolischen Ca 2 + in LT-HSC durch Aktivierung von purinergen P2-Rezeptoren bei Belichtung zeigt gezeigt, Adenosin-Triphosphat (ATP) und Ionomycin 12. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig1.jpg" /> Abbildung 1. Vertreter Dot-Plot Analyse von LIN-BM-Zellen. Elektronische Gating Verfahren auf Durchflusszytometer zu ermitteln und ein Tor hämatopoetischen Vorläuferzellen und HSK aus Knochenmark Zellsuspension gefärbt, wie im Protokoll Text beschrieben. pload/3736/3736fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Eine Regelung zur selektiven Anreicherung von c-Kit +-Zellen aus dem Knochenmark. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig3.jpg" /> Abbildung 3 Zellzyklus-Analyse von elektronisch gesteuerten LKS CD34 -. Blutstammzellen bei gesunden Kontrollen und Mäuse, die mit IBD mit Ki-67 Antikörper und DAPI gefärbt. Die Zellen wurden fixiert und permeabilisiert mit Lyse / Fix und Perm Puffer durch Färbung mit FITC-konjugierten Ki-67 und DAPI bei 1 ug / ml gefolgt. Radfahren Zellen sind kaum, wenn überhaupt nachweisbar in der LKS-CD34 - HSC Fach von gesunden Kontrollen 12. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig4.jpg" /> . Abbildung 4 Live-Imaging-konfokale Mikroskopie von FACS sortierten CD34 - HSC und GVP mit dem Nukleotid-bindenden Verbindung Quinacrin und nukleare rot (DRAQ5) gefärbt. Die kleinen Quadranten zeigen Quinacrin POSitive Vesikel im Zytoplasma von HSK erkannt, aber nicht GVP. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig5.jpg" /> Abbildung 5. Cytosolischen Ca 2 + Erhöhungen der HSZ sortiert mit Fura-2 beladen und stimuliert mit ATP und Ionomycin. Spuren von einzelnen Zellen gezeigt werden. Alle Zellen waren als Reaktion auf extrazelluläres ATP zeigt prominente Anstieg der cytosolischen Ca 2 + nach Zugabe von ATP.

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+variation+in+cycling+of+hematopoietic+stem+cells+in+steady+state+and+inflammation.">Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation.</a> J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hier beschriebene Methode ermöglicht eine schnelle und genaue Analyse der Hämatopoese in einzelnen Mäusen (Abbildung 1). Diese Analyse in verschiedenen experimentellen Einstellungen, einschließlich Mausmodell von Entzündungen, Autoimmunerkrankungen, Immundefizienz, degenerative Erkrankungen, Stoffwechselstörungen und Krebs, ermöglicht der Bewältigung der Folgen von pathologischen Zuständen, auf die Hämatopoese. Abbildung 3 zeigt die Analyse der Zellzyklus-Aktivität auf el...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 42401 </td></tr><tr><td> MEM NEAA 100X </td><td> Gibco </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> Natriumpyruvat </td><td> Gibco </td><td> 11360 </td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 20012 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td></tr><tr><td> Zellsieb 40 um </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> 7-AAD Färbelösung </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> Lyse / Fix-Puffer </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558049 </td></tr><tr><td> Perm Puffer III </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558050 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Ki-67 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556026 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> CD4 (GK1.5) </td><td> eBioscience </td><td> 150041 </td></tr><tr><td> CD8 (53-6,7) </td><td> eBioscience </td><td> 150081 </td></tr><tr><td> CD3 (145-2C11) </td><td> eBioscience </td><td> 150031 </td></tr><tr><td> CD45R (RA3-6B2) </td><td> eBioscience </td><td> 150452 </td></tr><tr><td> CD19 (6D5) </td><td> eBioscience </td><td> 150193 </td></tr><tr><td> Gr1 (RB6-8C5) </td><td> eBioscience </td><td> 155931 </td></tr><tr><td> Tre119 (TER-119) </td><td> eBioscience </td><td> 155921 </td></tr><tr><td> NK-1.1 (PK136) </td><td> eBioscience </td><td> 455941 </td></tr><tr><td> c-Kit (2B8) </td><td> eBioscience </td><td> 171171 </td></tr><tr><td> Sca-1 (D7) </td><td> eBiosciENCE </td><td> 135981 </td></tr><tr><td> CD34 (RAM34) </td><td> eBioscience </td><td> 110341 </td></tr><tr><td> FcyR (2.4G2) </td><td> eBioscience </td><td> 553145 </td></tr><tr><td> Anti-APC MicroBeads </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-090-855 </td></tr><tr><td> LS Columns </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-042-401 </td></tr></tbody></table>

phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors

Das Knochenmark ist der wichtigste Ort, wo HSCs und reifer Blutzellen Abstammung Vorfahren wohnen und differenzieren in einem erwachsenen Organismus. Blutstammzellen bilden eine Minute Zellpopulation von pluripotenten Zellen zu erzeugen vermag alle Blutzelllinien für ein Leben-Zeit ein. Die molekulare Aufklärung von HSK-Homöostase im Knochenmark hat wichtige Auswirkungen in der Hämatopoese, der Onkologie und der regenerativen Medizin. Wir beschreiben die Kennzeichnung Protokoll mit fluoreszierenden Antikörpern und dem elektronischen Gating Verfahren in der Durchflusszytometrie auf hämatopoetischen Vorläuferzellen Teilmengen und HSCs Verteilung in einzelnen Mäusen (Abb. 1) punkten. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode, um ausgiebig zu bereichern hämatopoetischen Vorläuferzellen als auch langfristige (LT) und kurzfristige (ST) Rekonstituieren Blutstammzellen aus dem Knochenmark gepoolten Zellsuspensionen von magnetischen Anreicherung von Zellen, die c-Kit. Die resultierende Zelle Herstellung verwendet werden, um ausgewählte Teilmengen für die in vitro zu sortieren undIn-vivo-funktionelle Untersuchungen (Abb. 2). Beide trabekulären Osteoblasten 2,3 und sinusförmige Endothel 4 bilden funktionale Nischen Unterstützung von Blutstammzellen im Knochenmark. Mehrere Mechanismen in der osteoblastischen Nische, einschließlich einer Teilmenge von N-Cadherin + Osteoblasten 3 und Wechselwirkung des Tie2-Rezeptor-Tyrosinkinase im HSK mit seinem Liganden Angiopoietin-1 5, ausgedrückt stimmen bei der Bestimmung HSK Ruhe. &quot;Ruhezustand&quot; im Knochenmark ist entscheidend für die HSK von der Replikation und eventuelle Erschöpfung bei übermäßiger Aktivität Radfahren 6 zu schützen. Exogene Stimuli, die auf Zellen des angeborenen Immunsystems, wie Toll-like-Rezeptor-Liganden 7 und Interferon-α 6 kann auch induzieren Proliferation und Differenzierung von Blutstammzellen in Linie festgelegte Vorläuferzellen. Kürzlich wurde eine Population von schlafenden Blutstammzellen in der Maus lin - c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 - CD34 - Population wurde bisher 8 beschrieben. Sortieren von Zellen auf CD34-Expression aus der hämatopoetischen Vorläuferzellen angereicherten Zellsuspension, wie hier beschrieben Basis ermöglicht die Isolierung von sowohl ruhende selbst erneuernden LT-HSK und ST-HSK 9. Ein ähnliches Verfahren auf Erschöpfung der Linie positive Zellen und Sortierung von LT-HSC mit CD48-Antikörpern und flk2 Basis wurde bereits 10 beschrieben. Im vorliegenden Bericht stellen wir ein Protokoll für die phänotypische Charakterisierung und Ex-vivo-Zellzyklus-Analyse von hämatopoetischen Vorläuferzellen, die nützlich für die Überwachung der Hämatopoese in verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen kann. Darüber hinaus beschreiben wir ein Verfahren FACS-Sortierung für HSK, die verwendet werden, um Faktoren und Mechanismen, die ihre Selbst-Erneuerung, Erweiterung und Differenzierung in der Zellbiologie und Signaltransduktion Assays sowie für die Transplantation definiert werden können.

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Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

phenotypic-analysis-isolation-murine-hematopoietic-stem-cells-lineage

Research

JoVE Journal

Biology

18.5K Aufrufe.  Bellinzona (Switzerland). Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Serie: Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolierung und Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ)

Forschung

Biologie

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Isolierung und Analyse von hämatopoetischen Stammzellen aus der Plazenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These regions are crucial in establishing the blood system in the embryos and leads to the eventual movement of stem cells into the fetal liver and then development of adult stem cells in the bonemarrow. Early hematopoietic stem cells can be isolated from these organs through microdissection of the embryo followed by flow cytometric sorting to obtain a more pure population. It remains unclear how these stem cell populations contribute to the fetal and adult stem cell pool.   Also, our lab investigates how early stem cells functionally differ from fetal and adult hematopoietic stem cells. Furthermore, our lab sorts different populations of hematopoietic stem cells and test their functional role in the context of a variety of genetic models. In this video, we demonstrate the micro-dissection procedure we commonly use and also show the results of a typical FACS plotfter isolating these rare populations, it is possible to perform a variety of functional assays including: colony assays and bone marrow transplants. 



This video shows how to micro-dissect the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region from embryos and use flow cytometry to sort hematopoietic stem cells.

Isolierung von Anfang hämatopoetischen Stammzellen aus Murine Dottersack und AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Isolierung, Kultur und Transplantation von Muskel-Satelliten-Zellen

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

Retrovirale Infektion von murinen embryonalen Stammzellen abgeleitete Embryoidkörper Zellen für die Analyse von hämatopoetischen Differenzierung

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

Identifizierung von Schlüsselfaktoren Regelselbsterneuerung und Differenzierung in EML hämatopoetischen Vorläuferzellen durch RNA-Sequenzierungsanalyse

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotenzials in hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen durch Durchflusszytometrie

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...